中國(guó)沿海三井卷曲紐蟲的分布與COI序列分析*

高凱夢(mèng)， 孫世春

(中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院， 海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所， 山東 青島 266003)

卷曲屬(EmplectonemaStimpson, 1857)屬于紐形動(dòng)物門(Nemertea) 針紐綱(Hoplonemertea)單針目(Monostilifera)卷曲科(Emplectonemertidae Bürger, 1904)，是一類身體纖細(xì)的單針紐蟲，目前包含二十多個(gè)物種。在中國(guó)沿海曾報(bào)道細(xì)卷曲紐蟲(Emplectonemagracile(Johnston, 1837))和三井卷曲紐蟲(EmplectonemamitsuiiYamaoka, 1947) 兩種[1-2]。其中，三井卷曲紐蟲在中國(guó)(大連)的記錄[2]存有較大疑問(wèn)(見下文)。

三井卷曲紐蟲最早由山岡貞一(Yamaoka)發(fā)現(xiàn)于日本下田，原始描述是由奧田四郎對(duì)山岡貞一的遺作簡(jiǎn)化后發(fā)表于《日本動(dòng)物圖鑒》(改訂增補(bǔ))[3],山岡氏對(duì)該種的完整描述則于2005年發(fā)表[4]。該種的已知分布區(qū)包括日本東海岸、日本海沿岸[4-7]和韓國(guó)[8]。

近年來(lái)，本課題組在中國(guó)沿海紐形動(dòng)物采集調(diào)查時(shí)，在中國(guó)的東海、南海8地采集到三井卷曲紐蟲標(biāo)本27個(gè)，并對(duì)其開展了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的采集、觀察與處理

調(diào)查采集主要在巖相潮間帶進(jìn)行。采集方法一是肉眼搜索，二是采集海藻、固著貝類、藤壺等污損生物，加海水浸泡通過(guò)溶氧脅迫獲得紐蟲。所獲紐蟲饑餓24 h后，直接以95%乙醇固定用于后續(xù)分子生物學(xué)研究，或活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行形態(tài)觀察。

活體紐蟲用7.5% MgCl2麻醉，先用體視顯微鏡(尼康SMZ800)觀察、測(cè)量、拍照。然后將標(biāo)本轉(zhuǎn)移到載玻片上，用蓋玻片輕壓，于顯微鏡(尼康E600)下進(jìn)一步觀察吻針等內(nèi)部構(gòu)造。標(biāo)本以波恩氏液或10%海水福爾馬林固定，或以10%海水福爾馬林固定頭部，以95%乙醇固定尾部(用于分子生物學(xué)研究)。形態(tài)學(xué)標(biāo)本固定至少24 h后轉(zhuǎn)移到70%乙醇保存，乙醇固定的分子生物學(xué)樣品于-25 ℃保存。

本研究在中國(guó)沿海8個(gè)地點(diǎn)獲得的27個(gè)標(biāo)本，其中用于分子生物學(xué)研究的標(biāo)本21個(gè)，采集信息見表1、圖1。標(biāo)本保存于中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所。除表1所列地點(diǎn)外，近20年來(lái)，我們還在遼寧大連、旅順、大長(zhǎng)山島、獐子島、廣鹿島、葫蘆島，河北秦皇島，山東北隍城島、大欽島、砣磯島、北長(zhǎng)山島、南長(zhǎng)山島、大黑山島、崆峒島、威海、榮成馬山、乳山、鰲山衛(wèi)、青島、靈山島、日照，福建平潭、南日島、惠安、廈門、東山，廣東南澳島、深圳東山、硇洲島、海陵島，廣西北海、防城港、潿洲島，海南海口、臨高、鶯歌海、儋州、三亞、陵水、永興島、七連嶼等40余個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行了樣品采集(調(diào)查地點(diǎn)覆蓋了自渤海至南海中國(guó)各海區(qū))，但未采集到本種紐蟲。

表1 研究標(biāo)本的采集信息及COI的GenBank序列號(hào)Table 1 Sampling information of specimens used in the present study, and the GenBank accession numbers of COI sequences

1.2 分子生物學(xué)研究

所有樣本均使用試劑盒MicroElute Genomic DNA Kit200(OMEGA, USA)進(jìn)行DNA的提取。利用通用引物正向引物L(fēng)CO-1490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG和反向引物HCO-2198 TTAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA進(jìn)行COI基因片段擴(kuò)增[9]。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其熱循環(huán)條件為：94 ℃下預(yù)變性2 min，循環(huán)(94 ℃下變性1 min，49 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min)35次，最后在72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，經(jīng)純化后用相同引物進(jìn)行雙向測(cè)序(北京六合華大基因科技有限公司)。DNA序列的GenBank號(hào)(包括從GenBank下載的2條序列)見表1。

用MEGA ver.6.0 軟件[10]對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)、計(jì)算遺傳距離(未校正p-距離，uncorrected p-distance；以下簡(jiǎn)稱p-距離)。用軟件TCS v.1.21[11]在95%的鏈接概率下生成單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。單倍型及核苷酸多樣性參數(shù)由DnaSP ver.5.10.01軟件計(jì)算[12]。

2 結(jié)果

三井卷曲紐蟲Emplectonema mitsuii Yamaoka, 1947

EmplectonemamitsuiiYamaoka: 山岡貞一 1947: 1466, fig. 4133[3]; 佐藤隼夫, 伊藤猛夫 1961: 187, fig. 7.1.7[13]; 奧田四郎, 巖田文男 1965: 397, figs a-d[14]; 宋鵬東等 1989: 53-54[2]; Crandall et al. 2001: 177-178, pl. 1 figs 1-4, pl. 2 figs 16, 16a, 16b[5]; Yamaoka 2005: 142[4]; Kajihara et al. 2011: tab. 1[6]; Sundberg et al. 2016: tab. S1[8]。

2.1 標(biāo)本及采集信息

研究標(biāo)本共27個(gè)。采自浙江省舟山市泗礁山、嵊山島、枸杞島、東極島，臺(tái)州市大陳島，溫州市南麂島和柴嶼，海南省文昌市龍樓(銅鼓嶺)共8個(gè)地點(diǎn)，詳細(xì)信息見表1、圖1。所有標(biāo)本均采自潮間帶，除在柴嶼發(fā)現(xiàn)個(gè)別個(gè)體生活于巖石縫隙外，均生活于海藻叢中。

(圓點(diǎn)表示本研究的采集地點(diǎn)；三角為其它文獻(xiàn)記錄[2]。Circles show collecting sites of present study; the triangle shows the site of a previous record [2].)

2.2 形態(tài)

體扁平，前部背面稍隆起，腹面平，麻醉后常向腹面彎曲。麻醉后體長(zhǎng)約15～29 mm，體寬0.5～0.7 mm。體黃，顯綠，或黃綠色(見圖2A～E)，有的個(gè)體背面具青色小斑點(diǎn)(見圖2C)。頭端尖，運(yùn)動(dòng)時(shí)尤為明顯。眼點(diǎn)較大，分4組，前兩組各2～6個(gè)，后兩組各1～4個(gè)，一般橙紅色，偶見暗褐色(見圖2C, D)。前頭溝在腹面，向上不延伸至背面；后頭溝位于后眼之后，呈環(huán)繞身體的閉環(huán)(見圖2C～E)。頭部中央具一橙紅色色斑，位于左右前眼點(diǎn)之間(見圖2B, C)。吻孔腹位，縱裂縫狀(見圖2D)。吻腔不及體長(zhǎng)的一半。吻主針光滑，長(zhǎng)62～85 μm，針座近錐形，后端圓，長(zhǎng)59～69 μm，針座寬20～30 μm(見圖2I)。主針略長(zhǎng)于針座，針長(zhǎng)/座長(zhǎng)為1.02～1.14。副針囊2個(gè)，各具副針2～3枚。腸具側(cè)盲囊。沒有對(duì)所有個(gè)體進(jìn)行鏡檢，但龍樓4月標(biāo)本、枸杞7月標(biāo)本、柴嶼10月標(biāo)本見成熟個(gè)體。生殖腺位于體后部約60%，數(shù)目很多(見圖2F, G)。精子頭部棒狀，約3～4 μm，具很長(zhǎng)的鞭毛(見圖2H)。

(A：活體外形(柴嶼標(biāo)本)；B, C：頭部背面觀，示眼的數(shù)目和顏色變化(B大陳島標(biāo)本，C柴嶼標(biāo)本)；D：頭部腹面觀(枸杞島標(biāo)本)；E：頭部側(cè)面觀(枸杞標(biāo)本)；F：柴嶼10月份雌性個(gè)體的腸區(qū)壓片，示成熟卵；G：柴嶼10月份雄性個(gè)體的腸區(qū)壓片，示成熟精巢；H：精子；I：主針及針座。gr1： 前頭溝；gr2： 后頭溝; rs： 吻口。比例尺：B～E = 200 μm; F,G = 100 μm; H = 10 μm; I = 50 μm。A: A complete worm from Chai Yu (Island); B, C: Dorsal view of head (A from Dachen Island, B from Chai Yu), showing number and color variation of eyes; D: Ventral view of head (from Gouqi Island); E: Lateral view of head (from Gouqi Island); F: Squeezed intestinal region of a female collected from Chai Yu in October; G: Squeezed intestinal region of a male collected from Chai Yu in October; H: Sperms; I: Central stylet and basis. gr1: Anterior cephalic groove; gr2: Posterior cephalic groove; rs: Rhynchostome. Scale bars: B～E = 200 μm; F,G = 100 μm; H = 10 μm; I = 50 μm.)

2.3 DNA序列

將中國(guó)21個(gè)標(biāo)本的COI序列(658 bp)與GenBank下載的2條序列(見表1)比對(duì)后，得到長(zhǎng)度為513 bp的序列數(shù)據(jù)集。對(duì)23條COI序列的分析共檢測(cè)到4個(gè)不同單倍型(Hap1，Hap2，Hap3，Hap4)，構(gòu)成一個(gè)單倍型網(wǎng)絡(luò)。其中，主單倍型Hap1包含19個(gè)個(gè)體，來(lái)自中國(guó)沿海的6個(gè)地點(diǎn)(嵊山島、枸杞島、東極島、南麂島、柴嶼、龍樓)；Hap2包含2個(gè)個(gè)體，分別來(lái)自日本忍路和韓國(guó)濟(jì)州島；Hap3和Hap4各包含1個(gè)個(gè)體，分別采自嵊山島和柴嶼(見圖3)。所有23條序列的p-距離為0.000 0～0.017 5(平均0.003 3)，平均單倍型多樣性(Hd)為0.320±0.121, 平均核苷酸多樣性(π)為0.003±0.002，呈現(xiàn)單倍型多樣性與核苷酸多樣性均低的模式。中國(guó)沿海21個(gè)樣本間的p-距離為0.000 0～0.003 9(平均0.000 4)，平均單倍型多樣性Hd為0.186±0.110, 平均核苷酸多樣性π為0.000 4±0.000 2。東海(浙江5地19個(gè)標(biāo)本)和南海(龍樓2個(gè)標(biāo)本)樣本間平均遺傳距離僅為0.000 2。中國(guó)與日本(忍路)/韓國(guó)(濟(jì)州島)樣本間遺傳距離明顯較大，均為0.017 7(日本與韓國(guó)兩樣本的COI序列相同)(見表2)。

(圖中數(shù)字為標(biāo)本數(shù)；單倍型間的每個(gè)空心圓代表一個(gè)缺失的單倍型。 Numbers correspond to the number of specimens; each blank circle indicates a missing haplotype. )

表2 不同地點(diǎn)基于COI序列的遺傳距離(未校正p-距離)Table 2 Averaged genetic distance (uncorrected p-distance) for COI sequences between different locations

3 討論

本文觀察的中國(guó)標(biāo)本的形態(tài)與原始描述基本一致。與模式標(biāo)本相比[4-5]，本文標(biāo)本存在以下細(xì)微差異：體型較小(體長(zhǎng)15～29 mmvs.50～70 mm)；體色黃綠色(見圖2A～E)，而模式標(biāo)本體色白黃；多數(shù)標(biāo)本眼的顏色與原始描述一致，呈朱紅色，但也發(fā)現(xiàn)眼呈暗褐色的標(biāo)本(見圖2C)；吻針和針座較小(主針長(zhǎng)62～85 μmvs.96～130 μm；針座長(zhǎng)59～69 μmvs.80～110 μm)，該差異可能是因?yàn)楸疚臉?biāo)本個(gè)體較小。Sundberg等對(duì)大量樣品的分析結(jié)果顯示，紐形動(dòng)物COI基因的種內(nèi)變異上限約為3%[8]，本文樣品與韓國(guó)、日本標(biāo)本間序列差異小于此值(見表2)?；贑OI序列的TCS物種界定分析顯示，中國(guó)、日本、韓國(guó)的23個(gè)標(biāo)本歸于同一單倍型網(wǎng)絡(luò)，也表明他們隸屬同一物種[15]。

除本文記錄的分布點(diǎn)外，本種已知分布區(qū)包括日本下田(靜岡)[4-5]、三崎(神奈川)、忍路(北海道)和佐渡島(新潟)[6-7]，韓國(guó)濟(jì)州島( 見表1)。宋鵬東等曾在大連記錄本種[2]，但近年來(lái)，作者及同事在遼寧至山東的黃渤海沿岸進(jìn)行了多次調(diào)查采集，超過(guò)20個(gè)調(diào)查地點(diǎn)具有本種的典型生境(巖相潮間帶，有大型藻類生長(zhǎng))，但均未發(fā)現(xiàn)本種。三井卷曲紐蟲是一暖水種，其在緯度較高的北海道忍路出現(xiàn)可能與對(duì)馬暖流有關(guān)(柁原宏，個(gè)人通訊)。因此，本種在大連的分布可能系一誤記。

COI序列的分析結(jié)果表明，三井卷曲紐蟲的單倍型多樣性和核苷酸多樣性總體較低，特別是浙江、海南90%個(gè)體共享同一單倍型，其他個(gè)體與該主單倍型間也僅有一個(gè)堿基差異，提示其可能經(jīng)歷過(guò)瓶頸效應(yīng)或種群是由少數(shù)個(gè)體通過(guò)奠基者效應(yīng)而建立[16]。雖然濟(jì)州島與忍路間、浙江各采樣點(diǎn)與海南龍樓間的地理距離明顯大于浙江各采樣點(diǎn)與濟(jì)州島間的距離，但浙江和濟(jì)州島的個(gè)體間遺傳距離遠(yuǎn)大于濟(jì)州島與忍路、浙江與海南個(gè)體間的遺傳距離(見表2)。遺憾的是，濟(jì)州島和忍路的樣品僅有1個(gè)，海南樣品僅有2個(gè)，包括模式產(chǎn)地在內(nèi)的日本東海岸多個(gè)分布地均無(wú)可用于DNA研究的樣品，現(xiàn)有數(shù)據(jù)尚不能探討三井卷曲紐蟲的地理分布格局的形成歷史。

4 結(jié)語(yǔ)

形態(tài)研究和DNA序列分析表明，浙江和海南的標(biāo)本與在日本、韓國(guó)報(bào)道的三井卷曲紐蟲屬于同種。在中國(guó)沿海三井卷曲紐蟲分布于浙江、海南等暖水水域，前人在遼寧大連的記錄可能為一誤記。中國(guó)沿海三井卷曲紐蟲的遺傳距離、單倍型與核苷酸多樣性均很低，但與韓國(guó)、日本2個(gè)樣品間序列差異較大，提示有必要通過(guò)深度采樣在種群水平上解析其地理分布格局的形成歷史。

致謝：曾曉起教授、鄭曉東教授等在樣品采集過(guò)程中給予大量幫助，俄羅斯科學(xué)院遠(yuǎn)東分院Alexei V. Chernyshev教授提供GenBank序列樣品的準(zhǔn)確采集地信息，北海道大學(xué)柁原宏教授對(duì)研究物種在日本的分布給予進(jìn)一步解釋，謹(jǐn)此致謝！