腰退行性病變與TRALL基因之間關(guān)系的研究△

徐世民，王炳武，張曉霞，劉偉強(qiáng)，于明東，蘇保輝，高加智

（山東省濰坊市人民醫(yī)院脊柱外科，261041）

腰椎間盤退行性病變（lumbar degenerative dis?ease,LDD）是臨床常見疾病，它是由腰椎間盤的生理結(jié)構(gòu)退行性病變引起腰椎間盤突出、椎管狹窄等病理改變，導(dǎo)致患者出現(xiàn)腰痛、下肢麻木、大小便障礙等臨床癥狀［1］。據(jù)統(tǒng)計，全球每年有2.66億人患有LDD，發(fā)病率為3.63%［2］，超過一半的人在生活中會受到腰背痛的影響［3］。隨著對腰椎間盤退變認(rèn)識的進(jìn)展，包括影像學(xué)檢查和干預(yù)試驗等被應(yīng)用到不同的方面，以推測LDD的病因［4，5］。腰椎間盤的退變具有很強(qiáng)的遺傳性，細(xì)胞行為和細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)是否完整均由遺傳信息所決定［6］。因此，本研究從此角度出發(fā)，探討LDD與TRAIL基因之間的相關(guān)性及TRAIL基因的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

腰椎間盤髓核取自人體。其中，2019年7月—2020年7月手術(shù)治療的腰椎間盤突出癥60例患者為退變組，男32例，女28例，年齡32～64歲；同期因腰椎創(chuàng)傷手術(shù)，但椎間盤無退變的60例患者為未退變組，男49例，女11例，年齡26～57歲。將取出的髓核分成兩部分，一部分用于制作石蠟切片，一部分用于髓核細(xì)胞的分離培養(yǎng)。本研究已預(yù)先通過本院倫理委員會批準(zhǔn)并書面同意，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 組織化學(xué)染色

1.2.1 染色

髓核組織固定、脫水、浸蠟后制備蠟塊，切5μ的石蠟切片。切片脫蠟、復(fù)水后行組化染色。

Tunel（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）法檢測細(xì)胞凋亡，用50 μl末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）和450 μl地高辛標(biāo)記的dUTP液混勻，而陰性對照組僅加50 μl地高辛標(biāo)記的dUTP液，陽性對照組先加入100 μl DNase1，15～25℃反應(yīng)10 min，后面步驟同處理組。玻片干后，加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液，在濕盒中37℃反應(yīng)1 h。加3%BSA室溫作用20 min后，分別在3%BSA和50 μl POD轉(zhuǎn)換液中孵育30 min，并加入DAB底物。蘇木素復(fù)染后梯度酒精脫水。鏡下觀察凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核內(nèi)有黑棕色顆粒的為陽性細(xì)胞。

1.2.2 免疫組化

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL）免疫組化染色，采用DAB法，復(fù)水，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入一抗TRAIL，4℃過夜，加入生物素標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。鏡下見TRAIL陰性的細(xì)胞胞漿染色呈淺藍(lán)色，而陽性的細(xì)胞呈現(xiàn)胞膜褶皺，著色較深，且細(xì)胞漿出現(xiàn)黃色顆粒樣物質(zhì)。

1.3 體外試驗

1.3.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

將退變髓核有消化酶消化后，用10%胎牛血清（美國Invitrogen公司）的DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）進(jìn)行沉淀，記為原代（P0）。加入0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司）2 ml，當(dāng)細(xì)胞突起回縮、變圓、細(xì)胞間隙變大，按1∶4傳代接種到新的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。

1.3.2 細(xì)胞體外分組與處理

P1細(xì)胞分為4組，分別為空白對照組（control組）、TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染組（siTRAIL組）、TNF-α處理組（TNF-α組）和TNF-α處理+TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染組（TNF-α+siTRAIL組）。

空白對照組：細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不行其它干預(yù)。

TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染組：將髓核細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化并計數(shù)后接種于6孔板，以DMEM培養(yǎng)基稀釋 10 μl Lipofectamine 2000～250 μl，加入 0.05 nmol的TRAIL siRNA至250 μl DMEM培養(yǎng)基，終濃度為200 nmol/L。1×PBS緩沖液沖洗采用熒光定量PCR檢測髓核細(xì)胞中TRAIL的表達(dá)，以確定轉(zhuǎn)染效率。

TNF-α處理組：細(xì)胞接種于6孔板，加入濃度為100 ng/ml的TNF-α的低糖DMEM培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)2 d。

TNF-α處理+TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染組：將髓核細(xì)胞用濃度為100 ng/ml的TNF-α處理，培養(yǎng)2 d后，用0.25%胰蛋白酶消化并計數(shù)后接種于6孔板，加入Li?pofectamine 2000和TRAIL siRNA DMEM培養(yǎng)基，終濃度為200 nmol/L。1×PBS緩沖液沖洗采用熒光定量PCR檢測髓核細(xì)胞中TRAIL的表達(dá)，以確定轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3檢測指標(biāo)

MTT細(xì)胞增殖檢測：將細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞接種到培養(yǎng)板。培養(yǎng)48 h后，加新鮮配置的MTT溶液 （5 mg/ml） 20 μl/孔，繼續(xù)孵育 4 h。上清液吸除，每孔中加150 μl DMSO，室溫，搖床振蕩10 min。490 nm波長，測定各孔光吸收值。

流式細(xì)胞檢測:將貼壁細(xì)胞用標(biāo)記溶液FITCAnnexin V和PI溶液標(biāo)記，使用BD FACSAria流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）檢測。在散點圖上，正常的活細(xì)胞顯示在左下象限，不被FITC-An?nexin V和PI染色，即FITC-/PI-；凋亡早期的細(xì)胞顯示在右下象限，它僅被FITC-Annexin V染色，即FITC+/PI-；凋亡晚期和壞死的細(xì)胞顯示在右上象限，它們既可以被FITC-Annexin V染色又可以被PI染色，即FITC+/PI+。

Western blot檢測：P1細(xì)胞提取的組織蛋白與5×SDS上樣充分?jǐn)噭颍瑢⒌鞍准訜嶙冃院?，用SDS聚丙烯酰胺（美國Amresco公司）凝膠電泳，麗春紅染色后，剪出目的蛋白條帶。加入二抗溶液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑混合，在Biorad凝膠成像系統(tǒng)中曝光，觀察蛋白條帶情況并拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 髓核組織化學(xué)檢測

兩組髓核Tunel組化染色結(jié)果見圖1a，1b。退變組髓核內(nèi)細(xì)胞稀疏，可見染色質(zhì)邊集化的TUNEL染色陽性細(xì)胞，呈黑棕色（圖1a），而未退變組腰椎間盤內(nèi)髓核細(xì)胞數(shù)量較多，呈藍(lán)色，散在分布少許的TUNEL染色陽性細(xì)胞（圖1b）。退變組中凋亡陽性細(xì)胞率為48.92%，末退變組中凋亡陽性細(xì)胞率為5.23%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

TRAIL免疫組化染色見圖1c，1d，退變組TRAIL陽性細(xì)胞多見，呈現(xiàn)胞膜褶皺，著色較深，胞漿出現(xiàn)黃色顆粒樣物質(zhì)（圖1c）。未退變組TRAIL陽性細(xì)胞較少，而陰性細(xì)胞多見，胞漿染色呈淺藍(lán)（圖1d）。

圖1 組織化學(xué)染色結(jié)果（×400） 1a:退變組Tunel染色，髓核細(xì)胞減少，可見較多Tunel染色陽性（黑棕色） 1b:未退變組Tunel染色，可見大量髓核細(xì)胞，呈藍(lán)色，散布少許Tunel陽性細(xì)胞 1c:退變組TRAIL染色，可見較多TRAIL陽性細(xì)胞，細(xì)胞呈現(xiàn)胞膜褶皺，著色較深，且細(xì)胞漿出現(xiàn)黃色顆粒樣物質(zhì) 1d:未退變組TRAIL染色，以TRAIL陰性細(xì)胞為主，胞漿染色呈淺藍(lán)色

退變組TRAIL陽性率為49.11%，未退變組TRAIL陽性率為12.25%，兩組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

Pearson相關(guān)分析表明，髓核細(xì)胞的TRAIL陽性率與TUNEL凋亡細(xì)胞陽性率之間呈正相關(guān)（r=0.917，P<0.001）。

2.2 體外試驗結(jié)果

2.2.1 MTT檢測

將TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染至退變髓核細(xì)胞中，用100 ng/mL的TNF-α處理轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的髓核細(xì)胞，然后MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果見圖2。相較于空白對照組，TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長速度（100.75±5.72）%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），TNF-α處理細(xì)胞的增殖速度為（49.19±2.89）%，顯著降低且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染+TNF-α處理組細(xì)胞的活性無明顯變化（P>0.05），提示沉默TRAIL的表達(dá)能顯著改善TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞活性抑制。

圖2 siRNA沉默TRAIL表達(dá)對退變髓核細(xì)胞活性的影響，*與對照組相比，P<0.05

2.2.2 流式細(xì)胞檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果見圖3。相較于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染退變髓核細(xì)胞凋亡無明顯改變（P>0.05），TNF-α處理組細(xì)胞的凋亡率明顯升高（P<0.05）。TRAIL-siR?NA轉(zhuǎn)染+TNF-α處理組細(xì)胞的凋亡率較未轉(zhuǎn)染組顯著增加（P<0.05），但較TNF-α處理組顯著降低，提示沉默TRAIL的表達(dá)可抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖3 siRNA沉默TRAIL表達(dá)對退變髓核細(xì)胞凋亡的影響

2.2.3 Caspase-3的Western blot檢測

采用分光光度法Western blot檢測退變髓核細(xì)胞中Caspase-3活性和表達(dá)情況，結(jié)果見圖4。相較于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染組退變髓核細(xì)胞中Caspase-3活性和表達(dá)無明顯變化（P>0.05），TNF-α處理組細(xì)胞中Caspase-3的活性和表達(dá)明顯升高（P<0.05），而TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染+TNF-α處理組細(xì)胞Caspase-3的活性和表達(dá)無明顯變化（P>0.05），提示沉默TRAIL的表達(dá)可抑制TNF-α誘導(dǎo)的Cas?pase-3激活和表達(dá)。

圖4 siRNA沉默TRAIL表達(dá)對退變髓核細(xì)胞中Caspase-3活性和表達(dá)的影響

3 討論

腰椎間盤在特定范圍內(nèi)有著較好耐受性，而負(fù)荷超過一定程度就會對椎間盤發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而出現(xiàn)椎間盤退變［7］。目前LDD的治療方法有藥物治療（如非甾體抗炎藥）、物理治療和手術(shù)治療、改善椎間盤變性的藥物治療、椎間盤變性的生物治療以及干細(xì)胞治療［8，9］。既往研究已認(rèn)識到老化與退化的過程類似，但仍未明確兩者之間的具體關(guān)系。

細(xì)胞生理狀態(tài)的改變可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，腰椎間盤的凋亡與其退變聯(lián)系緊密［10］。細(xì)胞凋亡使椎間盤的滲透壓、pH值、氧分壓等因子出現(xiàn)異常，引起椎間盤內(nèi)代謝產(chǎn)物的淤積，進(jìn)而發(fā)生椎間盤的退變［11］。本研究對髓核細(xì)胞TUNEL染色觀察顯示：對照組腰椎間盤髓核內(nèi)細(xì)胞較多，平均凋亡陽性細(xì)胞率明顯低于病例組，提示細(xì)胞凋亡是椎間盤髓核細(xì)胞減少的原因。TRAIL基因受多種因素的調(diào)節(jié)，包括反轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳學(xué)因素和單核苷酸多態(tài)性和功能不同的亞型［12］。TRAIL蛋白可以被檢測為跨膜型蛋白和可溶性蛋白［13］。TRAIL通過與5個同源受體的復(fù)雜配體-受體系統(tǒng)的相互作用發(fā)揮其生物效應(yīng)，在正常生理條件下可以以不同的親和力結(jié)合配體［14］。TRAIL受體系統(tǒng)的第5個受體是骨保護(hù)素，最初發(fā)現(xiàn)通過與NF-κB配體受體激動劑相互作用作為破骨細(xì)胞生成調(diào)節(jié)［15］。TRAIL基因?qū)?xì)胞凋亡存在不同細(xì)胞傳遞不同信號的特點，主要涉及到死亡受體復(fù)合物DISC、凋亡蛋白及凋亡抑制蛋白［12］。TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞選擇性的凋亡涉及轉(zhuǎn)化/感染細(xì)胞，非腫瘤細(xì)胞基本不受影響，并因此成為科學(xué)研究的熱點［16，17］。國外實驗證明，在正常細(xì)胞/組織中可能有其他的作用，也能促進(jìn)存活/增殖，干擾多種細(xì)胞類型的分化，甚至能激活腫瘤細(xì)胞中的促生存信號通路［18］。多種異常刺激可以增加髓核細(xì)胞中的炎性因子（如IL-1β和TNF-α）表達(dá)，從而引起髓核細(xì)胞合成代謝與分解活性的失衡，加速了椎間盤退變。同時也有研究證實，高水平的TNF-α可以激活內(nèi)源性和外源性途徑中的Caspase-3蛋白發(fā)揮凋亡作用，因此本研究選擇TNF-α作為誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡的刺激性因子［19，20］。

本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRAIL陽性率與TUNEL凋亡細(xì)胞陽性率成正比且經(jīng)TNF-α處理后細(xì)胞增殖明顯降低，細(xì)胞凋亡顯著升高，Western blot檢測結(jié)果顯示TNF-α處理組細(xì)胞的Caspase-3蛋白含量明顯高于其他組。此外本次研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL-siRNA轉(zhuǎn)染+TNF-α處理組細(xì)胞的活性、凋亡率及Caspase-3蛋白水平與對照組無明顯差異，提示siRNA沉默TRAIL表達(dá)可抑制TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并可顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的Caspase-3激活和表達(dá)。由此本次研究認(rèn)為，TRAIL和Caspase-3蛋白通過參與髓核細(xì)胞的凋亡而引發(fā)腰椎間盤退變。TRAIL是一種凋亡分子，能與死亡受體特異性結(jié)合后選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase-3蛋白具有剪切DNA蛋白片段的功能，是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子。Eerenbeemt等［16］研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL可激活死亡受體而啟動外源性凋亡途徑誘導(dǎo)髓核細(xì)胞凋亡，與本次研究結(jié)果相一致，并認(rèn)為抑制TRAIL基因的表達(dá)使ERK通路失活可成為臨床治療IDD的潛在治療靶點。與先前研究相一致的是，caspase-3在內(nèi)源性（線粒體）細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，短期抑制cas?pase-3可用于治療損傷誘導(dǎo)的椎間盤退行性病變。

綜上所述，髓核TRAIL陽性表達(dá)細(xì)胞率與凋亡細(xì)胞率呈正相關(guān)，TRAIL沉默能顯著提高TNF-α對細(xì)胞活性的抑制作用并可顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡及Caspase-3的活化和表達(dá)。