基于DNA條形碼的四川老君山國家級自然保護區(qū)尺蛾科昆蟲種類鑒定

王紅梅， 張雪蓮， 王磊， 岳碧松， 馮盛林， 陳本平， 孟楊, 2*

(1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065； 2. 四川大學(xué)自然博物館，成都610065； 3. 四川省屏山縣老君山國家級自然保護區(qū)管理局，四川屏山645350)

昆蟲是種類最多的動物類群，同時也對生態(tài)系統(tǒng)功能和全球經(jīng)濟有著重要作用(師丹，2009)。在生態(tài)系統(tǒng)中，昆蟲往往與其他生物相互依存，尤其是鳥類和植物(欒天宇，2017)。在保護區(qū)中昆蟲作為生物資源的重要組成部分，了解其本底對于保護區(qū)的資源利用和生態(tài)環(huán)境監(jiān)測等方面都具有重要意義(查玉平，2005)。四川老君山國家級自然保護區(qū)是以保護四川山鷓鴣Arborophilarufipectus、白腹錦雞Chrysolophusamherstiae、白鷴Lophuranycthemera和紅腹角雉Tragopantemminckii等雉科Phasianidae鳥類，以及其伴生的珍稀野生動植物和亞熱帶闊葉林生態(tài)系統(tǒng)為目的的森林和野生動物類型自然保護區(qū)。保護區(qū)內(nèi)生物資源豐富，植物、獸類和鳥類的生物資源都經(jīng)過了較為詳細的調(diào)查(楊杰等，2007；廖文波，2010；伍自力等，2015；何云玲等，2016)，但尺蛾科Geometridae昆蟲作為生物資源的組成部分還未經(jīng)過詳細調(diào)查。

尺蛾科Geometridae隸屬于鱗翅目Lepidoptera尺蛾總科Geometroidea。尺蛾科是鱗翅目的第二大科，目前已描述的尺蛾接近23 000種，分布在除少數(shù)極地地區(qū)外的世界各地(Scoble & Hausmann，2007)。中國尺蛾科昆蟲種類十分豐富，目前已記載了3 800種以上(姜楠，2013)。尺蛾多以樹木為食，在森林生態(tài)系統(tǒng)中多樣性較高，對環(huán)境變化非常敏感，可作為環(huán)境監(jiān)測的重要指標(biāo)(韓紅香，2005；班曉雙，2017)。

Hebert等(2003a，2003b)對動物界11個門的13 320個物種線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(cytochrome oxidase subunit Ⅰ，COⅠ)基因近5’端一段長度為658 bp的片段比對研究，發(fā)現(xiàn)這段序列相對保守又具有高變異性，認為該基因片段可以用于物種鑒定，并提出了DNA條形碼技術(shù)。DNA條形碼是一段相對標(biāo)準(zhǔn)化短基因片段，DNA條形碼技術(shù)通過對這一段相對標(biāo)準(zhǔn)化的基因片段測序分析后，進行個體物種鑒定、系統(tǒng)進化發(fā)育研究、隱存種和新種發(fā)現(xiàn)等分析研究(Hebertetal.，2004a；Parketal.，2011；Chestersetal.，2012)。目前DNA條形碼技術(shù)已廣泛應(yīng)用到昆蟲、鳥類、哺乳動物等類群的物種鑒定中(Hebertetal.，2004b；宋韶彬等，2014；Caietal.，2016；楊瑞生等，2017；Liuetal.，2018)。在昆蟲的分子鑒定中，目前被廣泛接受的分子標(biāo)記是COⅠ基因。

本研究基于DNA條形碼技術(shù)分析保護區(qū)燈誘采集的尺蛾科昆蟲資源，為保護區(qū)尺蛾科昆蟲資源提供相關(guān)資料，同時為其資源利用與管理提供依據(jù)。

1 研究地概況

四川老君山國家級自然保護區(qū)位于四川盆地南緣宜賓市屏山縣境內(nèi)中部，屬于涼山山系，東西長約11.6 km，南北寬約7.4 km，總面積約為35 km2，海拔800～2 008.7 m。該地區(qū)屬亞熱帶溫潤季風(fēng)氣候區(qū)，四季分明，雨量充沛，雨熱同季，年均氣溫12～14.7 ℃，年平均變幅小，年均濕度在85%以上，7—10月多在88%～92%(楊杰等，2007)。植被以闊葉林為主，包括亞熱帶常綠闊葉林和亞熱帶山地常綠、落葉闊葉混交林，海拔1 500 m以上分布了大面積原始常綠闊葉林，人為干擾較少，海拔1 500 m以下主要分布次生林和一定面積的人工林，人為干擾較大(西麗媛子等，2020)。

2 材料和方法

2.1 樣本采集

2019年6—8月和2020年5—6月用黑光燈燈誘采集，采樣地點為新田咀保護站(104.072 19°E，28.683 73°N，海拔1 101 m)、二埝坪觀測站(104.159 00°E，28.431 00°N，海拔1 536 m)和爛池子(104.036 00°E，28.730 40°N，海拔886 m)。經(jīng)過展翅、整姿和烘干定型后，標(biāo)本保存于四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室。

2.2 DNA提取、PCR擴增及測序

依據(jù)形態(tài)將2 402號尺蛾科標(biāo)本初步分為252組，每組選取1～3只，取樣本腿部肌肉組織放置于1.5 mL無菌EP管中進行實驗。按照動物通用DNA提取試劑盒說明書提取樣本的總DNA(北京擎科，貨號：TSP201)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂猛ㄓ靡飻U增COⅠ基因LC01490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，HC02198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’(Folmeretal.，1994)。取PCR產(chǎn)物5 μL，以標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker為參考，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物條帶清晰單一，產(chǎn)物長度與預(yù)期一致送至北京擎科生物科技有限公司成都分公司進行雙向測序。

2.3 數(shù)據(jù)分析

測序結(jié)果用DNASTAR Lasergene v7.1 Seqman查看峰圖質(zhì)量并進行人工校正和拼接，導(dǎo)出為fasta格式。通過MEGA 7.0分析計算序列堿基組成，統(tǒng)計保守位點(C)、變異位點(V)、簡約信息位點(Pi)和單態(tài)位點(S)等的數(shù)量；結(jié)合BOLD和GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)屬種的COⅠ基因序列，基于Kimura 2-parameter(K2P)模型，計算遺傳距離。

使用BOLD Systems v4數(shù)據(jù)庫，根據(jù)Ratnasingham和Hebert(2007)的方法進行物種鑒定，認為大多數(shù)動物的參考閾值是3%，選擇相似度≥97%的匹配結(jié)果，結(jié)合該序列在BOLD數(shù)據(jù)庫中的形態(tài)記錄(http://www.boldsystems.org/index.php/TaxBrowser_Home)，確定種名(Muhammadetal.，2018)；若相似度<97%，根據(jù)數(shù)據(jù)庫給出的與查詢樣本關(guān)系最近的100條序列的分類信息，將樣本只確定到科或?qū)俚乃?，避免誤鑒。即若與其關(guān)系最近的100條序列均隸屬于尺蛾科，則該序列也隸屬于尺蛾科，并結(jié)合ID頁給出的查詢樣本與其關(guān)系最近的100條序列構(gòu)建的NJ樹來判斷。

采用構(gòu)建NJ樹和ABGD在線工具(https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/abgdweb.html)對只確定到科或?qū)偎降男蛄羞M行物種界定(Puillandreetal.，2012；李晶等，2013；楊倩倩等，2018)。用MEGA 7.0基于K2P模型，構(gòu)建NJ樹，檢驗支持率的重復(fù)性抽樣次數(shù)為1 000，聚到同一支的序列認為是同一個物種。在ABGD網(wǎng)站提交只鑒定到科、屬水平的序列，最小相對gap寬度值X設(shè)為1.0，其余參數(shù)為默認值，模型選擇K2P，進行物種劃分，劃分到同一組的樣本認定為同一個物種(邢樹文等，2019)。

3 結(jié)果

3.1 COⅠ基因堿基組成

共采集到2 402號標(biāo)本，獲得了297條鱗翅目尺蛾科COⅠ序列，經(jīng)Clustal W比對后獲得658 bp等長片段。利用MEGA 7.0以無脊椎動物密碼子表翻譯成氨基酸序列后，序列中沒有插入、缺失、刪除或終止密碼子，說明所有序列均為功能性線粒體COⅠ基因。297條序列A、T、G、C的平均含量分別為31.0%、39.2%、14.9%、14.8%，A+T含量為70.2%，G+C含量為29.7%，表現(xiàn)出AT偏向性，符合昆蟲線粒體基因組A+T含量較高的特點(Simonetal.，2006)。檢測到保守位點361個，變異位點297個，簡約信息位點271個，單態(tài)位點26個，變異位點的占比為45.1%。

3.2 物種界定結(jié)果

通過BOLD數(shù)據(jù)庫比對297條序列，140條序列鑒定到種，隸屬于74屬95種，60條序列鑒定到屬水平，97條序列只鑒定到科水平。

以鞘翅目Coleoptera物種Contacyphonpadi(GenBank登錄號：KM286254.1)和歐洲深山鍬甲Lucanuscervus(GenBank登錄號：KM286254.1)為外群，157條只鑒定到科或?qū)俚男蛄袠?gòu)建NJ樹。結(jié)果顯示，157條序列劃分成96個單系，聚在一起的支持率均大于99%。ABGD的劃分結(jié)果分為初始劃分和遞進劃分。遞進劃分在P值為0.001時劃分成100組，P值為0.001 7、0.002 8和0.004 6時劃分成99組，P值為0.007 7時劃分成98組，P值為0.012 9、0.021 5和0.035 9時劃分成96組；而初始劃分結(jié)果穩(wěn)定，不同的P值均劃分成96組(圖1)。選擇初始劃分結(jié)果作為物種劃分結(jié)果，結(jié)果與NJ樹的聚類結(jié)果一致，呈現(xiàn)對應(yīng)關(guān)系(圖2)。通過構(gòu)建NJ樹和ABGD在線工具將60條鑒定到屬的序列劃分成35種，隸屬于31屬；97條鑒定到科的序列劃分成61種。

297條序列隸屬于191種，鑒定到種和屬水平的序列隸屬于92屬(表1)。

表1 四川老君山國家級自然保護區(qū)尺蛾科昆蟲名錄 Table 1 Directory of Geometridae in the Laojunshan National Nature Reserve， Sichuan

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

3.3 遺傳距離分析

從BOLD和GenBank數(shù)據(jù)庫中下載本文涉及的相關(guān)物種COⅠ序列用于遺傳距離分析，除去序列較短長度低于500 bp的序列，共有70條序列用于分析兩兩遺傳距離，隸屬于46屬55種?；贙2P模型計算367條序列的兩兩遺傳距離，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)遺傳距離最小為0，最大為4.36%，平均種內(nèi)遺傳距離為0.63%，褐緣白短尾尺蛾Ourapteryxsimilaria種內(nèi)遺傳距離最大；種間遺傳距離最小為3.43%，最大為19.12%，黑刺斑黃尺蛾Opisthograptismoelleri和Geometridae sp.18之間為最大種間遺傳距離，平均種間遺傳距離為11.91%，平均種間距離是平均種內(nèi)距離的18.9倍(圖3)。

4 討論

在昆蟲的實際研究中，常常會收集某個特定區(qū)域內(nèi)的昆蟲，其種類繁多，隸屬于不同的目、科。大多數(shù)昆蟲處在不同的發(fā)育階段，形態(tài)變化較大，親緣關(guān)系較近的昆蟲形態(tài)相似；昆蟲中普遍存在雌雄二型現(xiàn)象(王孟卿，楊定，2005)，這對于非分類學(xué)專家來說很難對其進行準(zhǔn)確的形態(tài)學(xué)鑒定，對于分類學(xué)專家來說也是巨大的工作量。隨著DNA條形碼技術(shù)的提出，有效解決了這一問題，通過對特定的基因片段的測序和比對，較容易確定樣本的分類地位。

本研究采集了2 402號尺蛾科昆蟲標(biāo)本，獲得了297條COⅠ基因序列，隸屬于191種。有95種鑒定到種水平，占總物種數(shù)的49.74%；35種只鑒定到屬水平，占18.32%；61種只鑒定到科水平，占31.93%；未確定到種的物種數(shù)占50.26%。與傳統(tǒng)昆蟲的鑒定方法相比，分子鑒定的效率很大程度上取決于基因數(shù)據(jù)庫的信息量，數(shù)據(jù)庫中包含的物種基因信息量越大，DNA條形碼的鑒定效率和準(zhǔn)確性越高。截止到2020年9月，BOLD數(shù)據(jù)庫中公開了尺蛾科的124 801條COⅠ基因序列，隸屬于12 110種，約占目前已知尺蛾科物種數(shù)的52.65%，還有許多尺蛾科物種缺少DNA條形碼數(shù)據(jù)。由此可見BOLD DNA條形碼數(shù)據(jù)庫中尺蛾科部分還有很多信息尚未完善，今后需要大量相關(guān)工作。

根據(jù)條形碼構(gòu)建NJ樹來確定樣品的物種，方法簡單、結(jié)果直觀，這一方法在不同的分類群中取得了較理想的結(jié)果。Hajibabaei等(2006)鑒定熱帶鱗翅目昆蟲時發(fā)現(xiàn)，NJ樹的鑒定準(zhǔn)確率高達97.9%。本研究構(gòu)建NJ樹對未鑒定到種的序列進行聚類分析時發(fā)現(xiàn)，聚在一起的單支支持率均大于99%，表明其劃分結(jié)果可信度高，該結(jié)果與ABGD的劃分結(jié)果一致。能否準(zhǔn)確區(qū)分物種依賴于所選分子標(biāo)記的物種種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離之間的分離程度，物種的遺傳距離存在條碼間隙，即物種的最大種內(nèi)遺傳距離小于最小種間遺傳距離(Hebertetal.，2004b)。在本研究中，尺蛾科的平均種間遺傳距離是平均種內(nèi)遺傳距離的18.9倍，符合Hebert等(2004b)提出的10×原則，關(guān)注種內(nèi)遺傳距離較大的物種，比如褐緣白短尾尺蛾Ourapteryxsimilaria，其最大種內(nèi)遺傳距離仍小于最小種間遺傳距離，存在條碼間隙，仍可以將它與其他物種準(zhǔn)確的區(qū)分出來，說明以COⅠ基因作為分子標(biāo)記的DNA條形碼技術(shù)可以對本研究中尺蛾科昆蟲進行有效分析。

四川老君山國家級自然保護區(qū)內(nèi)鱗翅目尺蛾科昆蟲資源豐富，尺蛾科昆蟲種類的調(diào)查是研究其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和地理親緣關(guān)系的重要資料。本研究只采集了5—8月的鱗翅目尺蛾科樣本，缺少其他月份的鱗翅目尺蛾科的種類，之后還需要繼續(xù)調(diào)查、補充該地區(qū)鱗翅目尺蛾科昆蟲DNA條形碼，構(gòu)建一個較為完整的保護區(qū)尺蛾科昆蟲DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，為其保護與利用提供依據(jù)。