高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定葉氏消渴方降糖顆粒中6種成分

楊力龍，龔志強(qiáng)，霍 宇*，梁天堅(jiān)，汪 磊，李思梅，劉方蓉

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，中國(guó) 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院 ，中國(guó) 南寧 530222)

葉氏消渴方為《臨證指南醫(yī)案》卷六“三消”中治中上焦消渴病的首方[1-7]，療效顯著。方中取生地為君藥，甘寒質(zhì)潤(rùn)，清熱涼血，養(yǎng)陰生津，配合滋陰瀉火、潤(rùn)燥除煩的知母、石膏為臣藥，再輔以生甘草、麥冬以清熱解毒、補(bǔ)液生津，生白芍為使藥，養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛，引散血中郁熱[8-10]。藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，運(yùn)用現(xiàn)代的中藥藥劑學(xué)理論和方法制備成的葉氏消渴方降糖顆粒劑，通過(guò)無(wú)糖化的制劑輔料設(shè)計(jì)，在保障其藥效的同時(shí)，有效解決了中藥煎煮麻煩、攜帶不便、量大難喝等弊端[11]。在已有最優(yōu)葉氏消渴方藥量配伍的基礎(chǔ)上[12]，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法分別搭載二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)及蒸發(fā)光檢測(cè)器(HPLC-ELSD)對(duì)葉氏消渴方降糖顆粒劑中主要的6種成分進(jìn)行含量測(cè)定，為葉氏消渴方降糖顆粒劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器和試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

各標(biāo)準(zhǔn)品沒(méi)食子酸(批號(hào)：110831-201605)、梓醇(批號(hào)：110808-201711)、芍藥苷(批號(hào)：110736-201844)、丹皮酚(批號(hào)：110877-201805)、知母皂苷B Ⅱ(批號(hào)：111839-201706)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。麥冬皂苷D對(duì)照品(批號(hào)：A0037-201812)，購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；葉氏消渴方降糖顆粒劑7批樣品為實(shí)驗(yàn)室自制(批號(hào)：181001，181002，181003，181004，181005，181006和181007)，原藥材產(chǎn)地見(jiàn)表1，均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院黃茂春副教授鑒定；常用試劑為AR分析純，娃哈哈純凈水，色譜乙腈(批號(hào)：19012101，美國(guó)TEDA)；色譜甲醇(批號(hào)：19011312，美國(guó)TEDA)。

表1 葉氏消渴方降糖顆粒劑生藥來(lái)源

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，1200化學(xué)工作站，二極管陣列(DAD)檢測(cè)器；Allteach 3300蒸發(fā)光散射(ELSD)檢測(cè)器(成都奧泰萬(wàn)譜科技)；KM-615D超聲波清洗器(廣州科潔)；XS205DU型電子分析天平(上海Mettler Toledo)；SG-4054恒溫水浴鍋 (上海碩光)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 HPLC法同時(shí)測(cè)定葉氏消渴方降糖顆粒劑中梓醇、沒(méi)食子酸、芍藥苷、丹皮酚含量

2.1.1 色譜條件 色譜柱選用島津Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流動(dòng)相為0.5%磷酸水溶液-乙腈(體積比92∶8)等度洗脫；流速：0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)定葉氏消渴方降糖顆粒劑，約5 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇水溶液50 mL，超聲提取30 min(功率200 W，超聲頻率50 kHz)，冷卻搖勻，過(guò)濾，濾液經(jīng)60 ℃水浴揮干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，定容，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即制備得供試品溶液。

2.1.3 混合對(duì)照品的制備 分別精密稱(chēng)取對(duì)照品梓醇12.68 mg，沒(méi)食子酸17.8 mg，芍藥苷15.64 mg，丹皮酚14.26 mg，置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即分別得到0.252，0.356，0.313，0.285 g·L-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取梓醇、沒(méi)食子酸、芍藥苷、丹皮酚質(zhì)量濃度分別為0.252，0.356，0.313，0.285 g·L-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，在“2.1.1”色譜條件下進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 葉氏消渴方降糖顆粒劑中4種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.1.5 精密度考察 取梓醇、沒(méi)食子酸、芍藥苷、丹皮酚質(zhì)量濃度分別為0.252，0.356，0.313，0.285 g·L-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.1.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，計(jì)算各組分平均峰面積和RSD值。結(jié)果梓醇、沒(méi)食子酸、芍藥苷、丹皮酚平均峰面積分別為863.8，480.1，270.7和313.9；4種成分RSD值分別為0.96%，1.08%，1.16%和1.27%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)定181002批次葉氏消渴方降糖顆粒劑6份，按“2.1.2”方法平行制備供試品溶液，按“2.1.1”方法測(cè)定，結(jié)果梓醇、沒(méi)食子酸、芍藥苷、丹皮酚的平均含量分別為0.147 8，0.227 4，0.131 2，0.082 6 mg·g-1；RSD值分別為2.17%，1.83%，1.98%和1.63%，可見(jiàn)方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性考察 取181002批次葉氏消渴方降糖顆粒劑供試品溶液，在同一色譜條件下于0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積，結(jié)果梓醇、沒(méi)食子酸、芍藥苷、丹皮酚峰面積的RSD值分別為1.04%，1.61%，2.12%和1.57%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取缺生地、白芍藥材制備的陰性樣品5 g，按“2.1.2”方法制備，得缺生地、白芍的陰性供試品，分別吸取各樣品，按上述“2.1.1”色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果陰性樣品液沒(méi)有色譜峰干擾，提示此法專(zhuān)屬性良好，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 樣品專(zhuān)屬性考察HPLC圖譜(A：混合對(duì)照品溶液；B：供試品溶液；C：陰性供試品溶液)

2.1.9 加樣回收考察 取181002批次葉氏消渴方降糖顆粒劑供試品溶液9份，每份約5.0 g，等量加入已知濃度的混合對(duì)照品溶液2.0，3.0，4.0 mL，按“2.1.2”方法制備，按“2.1.1”方法計(jì)算加樣回收率，結(jié)果梓醇、沒(méi)食子酸、芍藥苷、丹皮酚平均加樣回收率分別為 98.51%，98.86%，98.24%和98.28%，平均RSD值為0.71%，0.63%，0.99%和0.74%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.1.10 樣品測(cè)定 精密稱(chēng)取葉氏消渴方降糖顆粒劑每批次各3份，按“2.1.2”方法制備供試品溶液，用“2.1.1”方法測(cè)定，分別計(jì)算梓醇、沒(méi)食子酸、芍藥苷、丹皮酚的含量。

2.2 HPLC-ELSD法測(cè)定葉氏消渴方降糖顆粒劑中知母皂苷、麥冬皂苷D含量

2.2.1 色譜條件 默克Lichrospher 5HE C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(體積比25∶75)等度洗脫，柱溫30 ℃，流速設(shè)置為1.0 mL·min-1；蒸發(fā)光檢測(cè)器：漂移管溫度80 ℃，氣體流量2.0 L·min-1，增益為8；以知母皂苷B Ⅱ計(jì)算，理論塔板數(shù)不低于3 000。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)定葉氏消渴方降糖顆粒劑10 g，置具塞錐形瓶中，精密加入3倍體積30%的丙酮溶液，超聲30 min(超聲功率 400 W，頻率60 kHz)，冷卻，過(guò)濾，取續(xù)濾液于50 ℃水浴揮干，甲醇溶解并定容，搖勻后過(guò)0.25 μm微孔濾膜，即制備得供試品溶液。

2.2.3 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)定知母皂苷B Ⅱ 11.28 mg，麥冬皂苷D 9.96 mg，共同置于25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解并定容，搖勻，過(guò)0.25 μm微孔濾膜，即得濃度分別為0.451 2，0.398 4 g·L-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取質(zhì)量濃度分別為0.451 2，0.398 4 g·L-1的知母皂苷B Ⅱ、麥冬皂苷D混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋?zhuān)ㄈ葜吝m當(dāng)比例，按“2.2.1”方法測(cè)定，縱坐標(biāo)(Y)為對(duì)照品峰面積的自然對(duì)數(shù)值，橫坐標(biāo)(X)為對(duì)照品的進(jìn)樣量(μg)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明知母皂苷B Ⅱ、麥冬皂苷D進(jìn)樣量分別在0.451 2～4.512 μg和0.398 4～3.984 μg時(shí)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=1.503 2X+6.031 1(r=0.999 3)；Y=1.227 5X+3.797 9(r=0.999 4)。

2.2.5 精密度實(shí)驗(yàn)考察 精密吸取質(zhì)量濃度分別為0.451 2，0.398 4 g·L-1的知母皂苷B Ⅱ、麥冬皂苷D混合對(duì)照品溶液適量，按“2.2.1”方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得知母皂苷B Ⅱ、麥冬皂苷D的峰面積自然對(duì)數(shù)RSD值分別為1.83%和2.02%，表明精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)考察 取181002批次葉氏消渴方降糖顆粒劑6份，精密稱(chēng)定，按“2.2.2”方法平行制備6份供試品溶液，照“2.2.1”方法進(jìn)樣，測(cè)得知母皂苷B Ⅱ、麥冬皂苷D的平均含量分別為52.14，37.07 μg·g-1，RSD值分別為2.03%和1.93%，說(shuō)明方法重復(fù)性較好。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)考察 精密吸取181002批次葉氏消渴方降糖顆粒劑供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果知母皂苷B Ⅱ、麥冬皂苷D峰面積自然對(duì)數(shù)RSD值分別為1.13%及2.26%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取缺知母、麥冬藥材的的陰性樣品10 g，按照“2.2.2”方法制備陰性供試品溶液，分別吸取對(duì)照品、樣品及陰性供試品溶液，按照“2.2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果陰性樣品無(wú)色譜峰干擾，表明上述方法專(zhuān)屬性良好，見(jiàn)圖2。

圖2 樣品HPLC-ELSD專(zhuān)屬性色譜圖(A.知母皂苷B Ⅱ?qū)φ掌啡芤?；B.供試品溶液；C.陰性供試品溶液)

2.2.9 加樣回收實(shí)驗(yàn)考察 精密稱(chēng)定葉氏消渴方降糖顆粒劑(批號(hào)：181002)，共9份，每份約10 g。等量加入已知濃度的混合對(duì)照品溶液2.0，3.0，4.0 mL， 按“2.2.2”方法制備，按“2.2.1”計(jì)算加樣回收率，結(jié)果知母皂苷B Ⅱ、麥冬皂苷D的加樣回收率分別為98.51%和99.51%，平均RSD值分別為 0.59%及1.85%，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.2.10 樣品測(cè)定 精密稱(chēng)定各批次葉氏消渴方降糖顆粒劑3份，每份10 g，按“2.2.2”方法制備，依照“2.2.1”方法進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中知母皂苷B Ⅱ、麥冬皂苷D的含量，綜合“2.1.10”測(cè)定結(jié)果，自制的7批次葉氏消渴方降糖顆粒劑樣品中各成分含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同批次葉氏消渴方降糖顆粒劑主要成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

葉氏消渴方組方均為常見(jiàn)中藥，現(xiàn)代中藥藥理研究表明方中大多數(shù)中藥具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)降血糖的作用[13]。生地黃作為中醫(yī)降血糖“圣藥”，可富集梓醇[14，15]。體內(nèi)體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，梓醇能明顯降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血糖，調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血脂平衡，可作為生地降血糖的代表性活性物質(zhì)。知母在有效降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血糖的同時(shí)，對(duì)糖尿病并發(fā)的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用。研究表明知母的主要降血糖活性物質(zhì)包括知母多糖、知母醇提物、單體提取物OfficinalisininⅠ等[16-18]，其中知母皂苷B Ⅱ廣泛用于心血管疾病、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等方面[19，20]，可作為知母的主要有效活性成分。麥冬作為臨床常用的滋補(bǔ)類(lèi)中藥，其中麥冬皂苷D具有顯著的降血脂、降血糖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用[21，22]。本文選取生地的主要降糖活性成分梓醇，白芍中的主要活性成分沒(méi)食子酸、芍藥苷、丹皮酚，知母中的知母皂苷B Ⅱ以及麥冬中的麥冬皂苷D作為含量測(cè)定指標(biāo)成分，對(duì)葉氏消渴方降糖顆粒劑開(kāi)展質(zhì)量控制技術(shù)研究。結(jié)合文獻(xiàn)方法[23-25]，優(yōu)化了流動(dòng)相的比例，以乙腈-水(體積比25∶75)為最佳。皂苷類(lèi)化合物紫外(200～400 nm)光區(qū)域吸收較弱，因此本文選擇皂苷類(lèi)成分常用的ELSD檢測(cè)器進(jìn)行含量測(cè)定。

4 結(jié)論

本文建立了葉氏消渴方降糖顆粒劑中梓醇、沒(méi)食子酸、芍藥苷、丹皮酚、知母皂苷B Ⅱ及麥冬皂苷D 6個(gè)成分的含量測(cè)定方法，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于葉氏消渴方降糖顆粒劑主要活性成分含量測(cè)定，為葉氏消溫飽方降糖顆粒劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。