應(yīng)用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)檢測X-性連鎖魚鱗病一家系STS基因

黨 陽 湯莊力 牛新武 耿松梅 劉 艷 王曉鵬

1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚病院，西安，710004；2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，杭州，310009

X-性連鎖魚鱗病(X-linked ichthyosis, XLI, OMIM # 308100)由Lundborg等學(xué)者在1927年首次報道[1]。XLI患者幾乎全部為男性，世界范圍內(nèi)的患病率約為每1500名男性中有一例患者[2]，在所有型別魚鱗病的構(gòu)成比中排第2位。

XLI患者通常在出生后數(shù)周開始出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，但部分患者出生時即有魚鱗病皮損[3,4]。皮損初發(fā)時表現(xiàn)為軀干四肢廣泛分布的半透明大而細(xì)碎的鱗屑，隨著病情進(jìn)展，皮損逐漸發(fā)展為典型的深色多邊形黏附性鱗片。皮損可累及四肢、軀干、頸部，褶皺部位亦可受累。此外，部分患者可同時伴有隱睪、角膜渾濁以及神經(jīng)精神系統(tǒng)改變[5]。

XLI的致病基因為STS基因，該基因位于Xp22.31，共有10個外顯子，基因長度約為135 bp，編碼類固醇硫酸酯酶(steroid sulfatase, STS)。STS廣泛分布于包括胎盤、皮膚、陰道、乳腺、血液、肝臟、腦等人體各組織器官[6]，并被證實與XLI的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[7]。本文報道1個呈現(xiàn)STS基因大片段缺失的X-性連鎖魚鱗病家系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 先證者，男，31歲。出生時系足月順產(chǎn)，生后生長發(fā)育同同齡兒?；颊叱錾?個月即出現(xiàn)全身皮膚干燥、粗糙，四肢伸側(cè)為著，可見大小不一的多邊形黑褐色鱗片。家系中無類似臨床表現(xiàn)患者。先證者父母非近親婚配。

1.2 外周血基因組DNA提取與質(zhì)檢 獲取患者及其父母知情同意后，經(jīng)肘正中靜脈分別采集患者及其父母外周血2 mL，EDTA抗凝，使用全血基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取基因組DNA備用。

利用ND-1000-UV-VIS波長紫外/可見光掃描分光光度儀(Nanodrop，USA)對提取的基因組DNA進(jìn)行定量檢測。所提取的DNA樣本濃度應(yīng)介于20～100 ng/μL之間，OD260/OD280比值以及OD260/OD230比值均應(yīng)介于1.8～2之間。

1.3 多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)檢測 按照多重連接探針擴(kuò)增P160-STS試劑盒(MRC，Holland)的操作說明書對所得基因組DNA樣本進(jìn)行多重連接探針擴(kuò)增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)。

將擴(kuò)增所得的樣本使用ABI3130型基因測序儀(Applied Biosystems，CA，USA)進(jìn)行測序，運用MLPA分析軟件Coffalyser對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

患者所在家系中僅患者表現(xiàn)有XLI的臨床癥狀，尤其是四肢伸側(cè)可見大小不一多邊形黑褐色鱗屑(圖1)。

1a：左上肢伸側(cè)皮損；1b：左下肢股骨前側(cè)皮損；1c：患者雙下肢皮損

對患者及其父母的MLPA分析結(jié)果可知，患者STS基因各外顯子探針檢測信號均為0，提示患者為STS基因缺失半合子?；颊吣赣HSTS基因各外顯子探針檢測信號均小于0.7，提示該基因全部外顯子存在雜合缺失。患者及其母親STS基因MLPA分析結(jié)果見圖2。患者父親STS基因各外顯子探針檢測信號均正常。

2a:患者STS基因MLPA結(jié)果圖，該基因各外顯子探針檢測信號均為0，提示患者為缺失半合子；2b:患者母親STS基因MLPA結(jié)果圖，該基因各外顯子的探針檢測信號介于0.49～0.55之間，均小于0.7，提示患者母親為缺失雜合子

3 討論

XLI為伴X染色體隱性遺傳性皮膚病。由于男性基因組核型為46，XY，一旦唯一的X染色體存在STS基因突變或缺失即可出現(xiàn)魚鱗病的典型臨床表現(xiàn)，而女性患者只有STS基因發(fā)生純合突變或復(fù)合雜合突變時才會表現(xiàn)魚鱗病的典型臨床表現(xiàn)，截至目前，PubMed數(shù)據(jù)庫中僅報道4例女性XLI患者[8]，患病人數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于男性。

在健康人皮膚組織，STS主要存在于角質(zhì)形成細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。當(dāng)STS基因發(fā)生喪失功能突變時，其編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，局部膽固醇硫酸鹽脫磺化過程受阻，一方面造成局部膽固醇硫酸鹽的大量沉積，出現(xiàn)鱗屑等臨床表現(xiàn)，另一方面造成膽固醇硫酸鹽脫磺化的產(chǎn)物顯著減少，影響皮膚正常的屏障功能，并改變皮膚正常的pH值。異常的皮膚pH值會影響局部絲氨酸蛋白酶的活性，表皮角質(zhì)層細(xì)胞間黏附性增強(qiáng)，進(jìn)一步出現(xiàn)表皮角化過度的病理生理改變[9]。

STS基因位于Xp22.31區(qū)域，屬于人類X染色體上的進(jìn)化層(evolutionary strata)，該區(qū)域具有低豐度的散在重復(fù)序列(interspersed repeats)以及較低的GC含量，容易發(fā)生非等位基因同源重組[10,11]。該區(qū)域的基因除了STS外還有ANOS1、NLGN4X、HDHD1、PNPLA4和VCX。ANOS1基因突變可致卡爾曼綜合征，NLGN4X和VCX基因與智力發(fā)育有關(guān)，而HDHD1和PNPLA4基因則分別與核苷酸去磷酸化以及維持表皮穩(wěn)態(tài)相關(guān)[11]。本研究中的先證者在該區(qū)域發(fā)生了微缺失，造成STS以及HDHD1基因全部外顯子缺失，但HDHD1基因突變所致人類疾病至今未見報道[12]?；颊吣赣HSTS基因各外顯子的探針檢測信號均小于0.7，但檢測信號略有差異，值介于0.49～0.55之間，該基因各外顯子檢測信號的微小差異可能與萊昂現(xiàn)象(Lyon phenomenon)有關(guān)。

XLI為伴X染色體隱性遺傳，該家系中患者的母親無兄弟，姐妹拒絕接受相關(guān)檢查，而患者的外祖父母已經(jīng)過世，據(jù)其母回憶，患者的外祖父無魚鱗病的相關(guān)臨床表現(xiàn)，而STS基因發(fā)生原位缺失的幾率小，因而推測該缺失雜合子可能來源于先證者外婆或更久遠(yuǎn)的親代。

Xp22.31區(qū)域微缺失造成STS基因以及HDHD1基因外顯子全部缺失在XLI較為常見，約占所有XLI患者的85%～90%[1]，STS基因堿基替換或插入缺失突變僅占本病基因改變的很小一部分。運用MLPA技術(shù)常規(guī)開展產(chǎn)前篩查，尤其是在有魚鱗病家族史的備孕夫妻中開展，對提高新生人口質(zhì)量有較大幫助。