中山地區(qū)淋球菌頭孢菌素敏感性及NG-MAST研究

陸善詞 梁 棟 梁連輝 高文軍 蔡常輝

中山市第二人民醫(yī)院,中山,528447

目前，注射用頭孢曲松和口服頭孢克肟是全球大多數(shù)國家和地區(qū)用于治療淋病的一線藥物。因抗生素的濫用和市場監(jiān)管不足，以及淋球菌易獲取外源性耐藥基因的特性，近年來，多個(gè)國家出現(xiàn)對(duì)頭孢曲松高度耐藥的淋球菌株，甚至出現(xiàn)口服頭孢菌素類藥物治療淋病失敗的病例[1,2]。NG-MAST基因分型技術(shù)是一種可監(jiān)測特殊菌株的暴發(fā)流行、耐藥性及菌株進(jìn)化等情況的有效方法[3,4]。本研究目的是探討中山市轄區(qū)淋球菌對(duì)頭孢曲松、頭孢克肟的耐藥性及分子流行病學(xué)特征，為臨床治療及預(yù)防提供依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 菌株收集及藥敏試驗(yàn) 淋球菌收集于2017年5月至2018年10月中山市12個(gè)淋球菌耐藥監(jiān)測點(diǎn)共193株，菌株經(jīng)過分離培養(yǎng)、鑒定和純化后用10%小牛血清保存管凍存于-70℃低溫冰箱中。淋球菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分包括英國Oxoid公司GC瓊脂粉(批號(hào)：2202790)與無菌脫纖維羊血(購自廣州迪景公司)。頭孢曲松與頭孢克肟2種抗生素，以及世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)菌株 (WHO G、WHO J、WHO K、WHO L、WHO P)均由中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心提供。采用WHO推薦的瓊脂稀釋法檢測菌株對(duì)頭孢曲松與頭孢克肟的藥敏值(MIC值)。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為頭孢曲松MIC<0.125 mg/L為敏感，MIC≥0.125 mg/L為低敏；頭孢克肟為MIC<0.25 mg/L為敏感，MIC≥0.25 mg/L為低敏。臨床菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇后，經(jīng)2次傳代，用18～20 h新鮮培養(yǎng)物配成0.5麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙?，菌懸液再?jīng)10倍稀釋后接種于含抗生素的瓊脂平板上，將平板置于35℃二氧化碳箱培養(yǎng)24～48 h觀察結(jié)果。每批試驗(yàn)均加入已知MIC值的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行全程質(zhì)量控制。

1.2 DNA提取 淋球菌株復(fù)蘇經(jīng)2 次傳代后，刮取平板上菌落于無菌生理鹽水中制成均勻的混懸液，并調(diào)整菌懸液濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?。Expure-20r全自動(dòng)核酸提取儀及配套試劑(批號(hào)：20180603)由深圳匯研科創(chuàng)生物科技有限公司生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)方法如下：向試劑盒六聯(lián)管第一孔加入180 μL菌懸液和20 μL核酸吸附劑，混勻后上機(jī)，儀器即可全自動(dòng)完成核酸的純化和提取。

1.3 NG-MAST分型 用Martin等文獻(xiàn)報(bào)道方法[4]。實(shí)驗(yàn)步驟如下：用PCR法擴(kuò)增porB基因和tbpB基因，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，將正確位置條帶產(chǎn)物進(jìn)行純化后測序(由南京勒伯生物技術(shù)有限公司完成)。porB基因測序結(jié)果與基因庫中已知序列(Gen Bank號(hào):M21289)進(jìn)行比對(duì)，選取por B基因擴(kuò)增序列上一段490 bp大小片段進(jìn)入NG-MAST網(wǎng)站比對(duì)以獲取其等位基因型別；tbpB基因測序結(jié)果與基因庫中已知序列(U65222)進(jìn)行比對(duì)，選取tbpB基因擴(kuò)增序列上一段390 bp大小片段進(jìn)入NG-MAST網(wǎng)站比對(duì)以獲取tbpB基因等位基因型別；最后綜合porB和tbpB基因的等位基因型別從NG-MAST網(wǎng)站獲取該淋球菌株的基因型別。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果及MIC值分布 共檢測193株臨床分離淋球菌，頭孢曲松的低敏率為5.2%，頭孢克肟的低敏率為13.5%。淋球菌株對(duì)2種抗生素的MIC值分布見表1。

表1 淋球菌株對(duì)2種抗生素的MIC值分布 株

2.2 NG-MAST型別分布 193株淋球菌共檢出125個(gè)型別，其中已知型別65(52%)種，新型別60(48%)種。菌株型別中以ST5308(n=7)、ST2268(n=7)、ST5061(n=7)、ST10091(n=4)、NEW1(n=6)、NEW2(n=4)和NEW3(n=4)為優(yōu)勢型別，其中兩株菌同型別有21種，3株菌同型別有7種，其余為90種單一型別。

表3 優(yōu)勢型別菌株對(duì)頭孢克肟的MIC值分布 株

2.3 NG-MAST優(yōu)勢型別菌株對(duì)頭孢菌素的MIC值分布及耐藥情況 從表2、3中可見相同NG-MAST型別菌株對(duì)同一藥物敏感性具有相同或相近的MIC值，滴度相差不超過3個(gè)濃度級(jí)。7株ST5308型別菌株中有6株對(duì)頭孢克肟顯示低度敏感。另檢出成簇的ST 9659(n=3)型別菌株對(duì)頭孢曲松顯示低度敏感(MIC值均0.125 mg/L)。

表2 優(yōu)勢型別菌株對(duì)頭孢曲松的MIC值分布 株

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),中山地區(qū)淋球菌株對(duì)頭孢曲松與頭孢克肟的低敏率較高(5.2%和13.5%)，其中頭孢曲松的低敏率明顯高于近年國內(nèi)山東(1.6%)、浙江(0.0%)的報(bào)道[5，6]，亦高于Chen等監(jiān)測2012-2013年全國淋球菌株的報(bào)告水平(平均4.4%)[7]，但略低于2017年廣州地區(qū)的耐藥監(jiān)測報(bào)道(6.9%)[8]；頭孢克肟的低敏率高于近年廣西壯族自治區(qū)的耐藥監(jiān)測報(bào)道(11.3%)[9]，但與近年廣州地區(qū)的耐藥監(jiān)測報(bào)道接近(15.8%)[8]。研究表明，中山地區(qū)淋球菌對(duì)第三代頭孢菌素有較高的低敏率，應(yīng)重視淋球菌的耐藥性監(jiān)測工作，以及加強(qiáng)臨床用藥的合理性和規(guī)范性使用管理。

Martin等[4]創(chuàng)建的NG-MAST基因分型法，是對(duì)兩個(gè)編碼淋球菌外膜蛋白基因(porB和tbpB)進(jìn)行多態(tài)性測序分析，并與數(shù)據(jù)庫比對(duì)后獲得菌株的基因型別。該法具有操作簡便、結(jié)果客觀、實(shí)驗(yàn)室間的可比性高等。有研究表明，ST型別相同菌株對(duì)同一抗生素的敏感性存在較穩(wěn)定的一致性(MIC值集中于特定范圍)，由此可通過ST型別預(yù)測菌株對(duì)藥物的敏感性，并適合特定區(qū)域追蹤特殊菌株(如耐藥菌株)的傳播特征[9，10]。本研究發(fā)現(xiàn):所檢菌株型別多達(dá)125種，其中已知型別與新型別種數(shù)分別為65(52%)和60(48%)種；印證同型別菌株對(duì)同一抗生素敏感性(MIC值)具相同或相近性的報(bào)道[10]；發(fā)現(xiàn)多個(gè)特殊菌株型別，即優(yōu)勢型別ST5308(n=7)菌株對(duì)頭孢克肟呈低度敏感，與Yan等報(bào)道一致[11]；成簇的ST 9659(n=3)型別菌株對(duì)頭孢曲松低度敏感； ST 10091(n=4)優(yōu)勢型別菌株恰為作者對(duì)本批菌株進(jìn)行阿奇霉素耐藥性另一研究中的對(duì)阿奇霉素呈高度耐藥性的淋球菌(MIC值≥256 mg/L)[12]，對(duì)該型別的耐藥性于鄰近的深圳市曾有報(bào)道，但不屬于當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢菌株型別[13]。上述情況表明，本地區(qū)淋球菌株NG-MAST 基因分型呈遺傳背景的多樣性，可通過檢測發(fā)現(xiàn)的特殊菌株型別，預(yù)測感染菌的耐藥性并指導(dǎo)臨床選用合理的治療方案，以及對(duì)提前干預(yù)特殊菌株的暴發(fā)流行有重要意義。

本市主要流行的ST5308、ST5061曾被Qin等報(bào)道為珠海市和廣州市流行的主要菌型，ST5061還是長沙市流行的主要菌型[14，15]。由于NG-MAST 基因分型法具較高分辨率，檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化和結(jié)果具穩(wěn)定性[16]，推測廣州、珠海、中山三市作為經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，湖南則毗鄰廣東，是重要?jiǎng)诠ぽ敵龅?，四地區(qū)間人員的流動(dòng)性強(qiáng)，導(dǎo)致上述淋球菌型別的流行，ST5308、ST5061是上述四地共同流行的主要基因型別，提示可能存在一定的性傳播網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。此外，近年本市與廣州地區(qū)的淋球菌對(duì)頭孢克肟的低敏率接近，可能與兩地共同出現(xiàn)對(duì)頭孢克肟低敏的優(yōu)勢菌型ST5308有較大關(guān)系(占中山低敏菌率25%)。本地主要流行菌型ST10091在周邊或外省未見報(bào)道，提示該淋球菌型存在地域局限性流行情況，可能與該型別菌流入本市較早、傳播較廣并形成當(dāng)?shù)刂饕餍芯陀嘘P(guān)。目前，為延緩淋球菌對(duì)頭孢菌素耐藥性進(jìn)展，世界衛(wèi)生組織推薦頭孢曲松聯(lián)合阿奇霉素作為治療淋病的策略，但本市淋球菌對(duì)阿奇霉素的耐藥性高[12]，并且出現(xiàn)對(duì)阿奇霉素呈高度耐藥性的ST10091優(yōu)勢菌型，因此在中山地區(qū)不宜或慎用該策略。研究未發(fā)現(xiàn)在世界范圍內(nèi)傳播較廣對(duì)頭孢菌素高度耐藥的ST1407淋球菌菌型，但其在國內(nèi)的上海、廣西及我省廣州均有零星報(bào)道[7，14]，因此要高度關(guān)注該耐藥菌型和做好耐藥監(jiān)測工作，以防流入本市。此外，本地區(qū)流行的主要菌型與Chen等報(bào)道我國最主要流行基因型不同，其報(bào)道為:所有地區(qū)流行ST2318；ST1866流行于南方(包括廣東，廣西和海南)和華東地區(qū)(包括浙江，江蘇和上海)；ST5062流行西南部；北部流行ST10290；而西北部流行ST4846[7]。說明不同地域所流行主要菌型可不相同。因此，為掌握中山地區(qū)淋球菌的分子流行病學(xué)狀況和落實(shí)淋病防控工作，運(yùn)用NG-MAST基因分型技術(shù)進(jìn)行監(jiān)測并建立區(qū)域菌株型別數(shù)據(jù)庫十分必要。