高糖環(huán)境下lncRNA MEG3對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的作用及其機(jī)制△

邵珺 王楊寧致 詹鵬飛

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病性微血管病變中最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，已成為當(dāng)前全球重要的致盲眼病。目前，除了玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物以及視網(wǎng)膜光凝外，臨床上尚缺乏其他有效的控制 DR 發(fā)生發(fā)展的治療方法[1-3]。長(zhǎng)期高血糖引起的眼部微環(huán)境失衡(高糖、缺氧等因素)能夠誘發(fā)關(guān)鍵基因，如VEGF通路相關(guān)基因，在表達(dá)水平和表觀遺傳學(xué)上出現(xiàn)異常，這是DR 病情進(jìn)一步發(fā)展的重要原因[4]。因此，觀察DR發(fā)展過程中關(guān)鍵基因表達(dá)水平的變化對(duì)深入探索DR的發(fā)病機(jī)制及其精準(zhǔn)治療均具有重要的意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)常見的非編碼RNA，能夠通過特異性堿基配對(duì)及結(jié)合，調(diào)控前體mRNA剪接、mRNA翻譯以及miRNA的功能，在腫瘤發(fā)展以及心血管病變等疾病中均有報(bào)道[5]。lncRNA廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織器官中，可通過微小RNA(miRNA) 應(yīng)答元件(MRE)作為miRNA(另一類 22 nt 左右的非編碼 RNA)的吸附物而發(fā)揮功能[6-8]。lncRNA 在眼部疾病已有報(bào)道，如青光眼、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等[9-10]。有報(bào)道表明lncRNA MEG3/mir223/NLRP3炎癥小體信號(hào)軸可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[11]。在DR發(fā)病中，lncRNA MEG3可通過 PI3k/Akt信號(hào)通路調(diào)控視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的功能[10]。然而lncRNA MEG3的具體作用機(jī)制尚未完全明確。

本研究團(tuán)隊(duì)曾利用miRNA 芯片和qRT-PCR進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p 在 DR患者的血清和房水中水平均有升高，并通過調(diào)控下游FBXW7靶基因抑制DR新生血管生成[12]，通過進(jìn)一步的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，lncRNA MEG3與mir-223-3p可能存在相互作用。因此，本研究旨在探討lncRNA MEG3在高糖環(huán)境下對(duì)人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(hRECs)增殖和遷移的作用及其機(jī)制，為DR的發(fā)病機(jī)制、臨床預(yù)防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料hRECs購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，Hek293細(xì)胞(人胚腎293細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)室自存)，胎牛血清(FBS)(美國(guó)Gibco公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyelone公司)，2.5 g·L-1胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(凱基生物科技發(fā)展有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Amresco公司)，F(xiàn)BXW7抗體(英國(guó)Abcam公司)。SuperRT cDNA Kit、2×Taq Master Mix及染料(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，傷口愈合插件(德國(guó)Ibidi公司)，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色試劑盒(北京索萊寶公司)。siRNA序列由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，lncRNA引物由吉瑪生物(蘇州)股份有限公司設(shè)計(jì)合成。雙熒光素酶報(bào)告基因和lncRNA MEG3結(jié)合位點(diǎn)或野生型/突變型基因質(zhì)粒及過表達(dá)質(zhì)粒、miR-223-3p mimics均從上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司訂購(gòu)。

1.2 方法

1.2.1 hRECs的培養(yǎng)hRECs接種于96孔板，細(xì)胞密度為30個(gè)·μL-1，置于含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、20 g·L-1青-鏈霉素溶液雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將hRECs分為正常(低糖)組、高糖(對(duì)照)組、lncRNA MEG3過表達(dá)(高糖)組、lncRNA MEG3過表達(dá)對(duì)照(高糖)組、lncRNA MEG3沉默(高糖)組、lncRNA MEG3沉默對(duì)照(高糖)組、lncRNA MEG3過表達(dá)+沉默(高糖)組及l(fā)ncRNA MEG3+miR-223-3p過表達(dá)組。正常(低糖)組在培養(yǎng)基中加入5.5 mmol·L-1葡萄糖，所有高糖組在培養(yǎng)基中加入25.0 mmol·L-1葡萄糖。

1.2.2 lncRNA MEG3對(duì)hRECs增殖的影響各組hRECs接種于96孔板，細(xì)胞密度為30個(gè)·μL-1，培養(yǎng)24 h貼壁后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，于酶標(biāo)儀450 nm下測(cè)各孔光密度(D)。設(shè)置足夠多的平行培養(yǎng)孔，連續(xù)6 d檢測(cè)各組hRECs增殖情況。

1.2.3 lncRNA MEG3對(duì)hRECs愈合能力的影響將上述各組hRECs接種于培養(yǎng)皿，細(xì)胞密度為30個(gè)· μL-1，培養(yǎng)至融合度達(dá)到90%左右后，用移液槍頭對(duì)細(xì)胞表面進(jìn)行劃痕。使用光學(xué)顯微鏡觀察并分別在劃痕后0 h、24 h 照相，使用IncuCyte ZOOM軟件掃描圖像并計(jì)算各組hRECs劃痕相對(duì)細(xì)胞密度(RWD)。

1.2.4 lncRNA MEG3對(duì)hRECs遷移能力的影響各組hRECs置入孔徑為8.0 μm的Transwell小室，小室內(nèi)加入200 μL 含10×103個(gè)hRECs的無FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。吸棄上下室培養(yǎng)基，用棉簽擦凈上室內(nèi)細(xì)胞，24孔板內(nèi)加入40 g·L-1多聚甲醛室溫下固定30 min，吸棄多聚甲醛，PBS沖洗小室背面2遍，24孔板內(nèi)加入結(jié)晶紫600 μL，室溫下染色20 min，吸出后PBS沖洗小室背面2遍，光學(xué)顯微鏡下觀察上室并照相，任意取5個(gè)視野進(jìn)行hRECs計(jì)數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將lncRNA MEG3、抑制劑及miR-223-3p導(dǎo)入hRECs各組hRECs覆蓋培養(yǎng)皿底部 70%左右時(shí)，吸棄完全培養(yǎng)基，PBS清洗 2～3 次。六孔板每孔 250 μL無血清培養(yǎng)基 Opti-MEM和5 μL lipo2000 配制成混合液，靜置 5 min，然后再用適量的質(zhì)粒和 250 μL Opti-MEM 配制成質(zhì)?；旌弦?，靜置 20 min，lipo2000 和 Opti-MEM 的混合液加入到質(zhì)?；旌弦褐谢旌暇鶆?。 在六孔板每孔加入 1.5 mL Opti-MEM 然后再加入上面配置好的混合液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4～6 h。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)觀察lncRNA MEG3與miR-223-3p的相互作用RegRNA在線服務(wù)器“http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw”以及miRcode “http://www.mircode.org/” 在線服務(wù)器被用于預(yù)測(cè)能夠與lncRNA MEG3直接相互作用的miRNA，其中，miR-223-3p被預(yù)測(cè)為lncRNA MEG3的直接靶點(diǎn)。Hek293細(xì)胞接種于24 孔板進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞分為lncRNA MEG3野生型對(duì)照組、lncRNA MEG3野生型+miR-223 mimic組、lncRNA MEG3突變型對(duì)照組、lncRNA MEG3突變型(Site 1)+miR-223 mimic組、lncRNA MEG3突變型(Site 2)+miR-223 mimic組和lncRNA MEG3突變型(Site 1+Site 2)+miR-223 mimic組。使用lipo2000完成上述質(zhì)粒與miR-223 mimic對(duì)Hek293細(xì)胞的共轉(zhuǎn)染，步驟同1.2.5。報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)，lncRNA MEG3插入螢火蟲熒光素酶的3’ UTR區(qū)域，而攜帶海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒則共同轉(zhuǎn)染作為內(nèi)參。Hek293細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，加入100 μL裂解液裂解細(xì)胞15 min。采用雙熒光素酶分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，在40 μL 熒光素酶檢測(cè)試劑 II中加入10 μL細(xì)胞裂解液，吹打混勻后，檢測(cè)螢火蟲熒光素酶的活性(D560 nm)，隨后加入40 μL熒光淬滅試劑，再次讀數(shù)，即為海腎熒光素酶的活性(D465 nm)。計(jì)算每組的螢光蟲熒光素酶/海腎熒光素酶的信號(hào)比值，對(duì)照組比值為100%。

1.2.7 qRT-PCR檢測(cè)高糖及低糖環(huán)境下hRECs中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平采用RNA試劑盒 Takara提取總RNA。利用Taqman miRNA ABC純化試劑盒提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增lncRNA MEG3的cDNA，SYBRgreen實(shí)時(shí)定量PCR混合物測(cè)定lncRNA MEG3在hRECs中的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參。lncRNA MEG3引物序列：上游引物為5’-AGCGCTTCTGAAGACCAAAC-3’、下游引物為5’-GAACACAAAGACACCCAGCA-3’，大小為20 bp。利用2-ΔΔCt計(jì)算hRECs中l(wèi)ncRNA MEG3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)高糖環(huán)境下PABPC1過表達(dá)或沉默對(duì)hRECs中l(wèi)ncRNA MEG3的表達(dá)水平的影響pcDNA3.1(+)-PABPC1 過表達(dá)質(zhì)粒以及siPABPC1 沉默RNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。在高糖培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)hRECs至培養(yǎng)皿底部細(xì)胞覆蓋率為60%～70%時(shí)，采用Lipo2000試劑盒 (Life Technologies, 美國(guó)) 將過表達(dá)對(duì)照(1 g·L-1)、PABPC1過表達(dá)質(zhì)粒(1 g·L-1)、PABPC1沉默RNA(40 nmol·L-1)以及沉默對(duì)照(40 nmol·L-1)轉(zhuǎn)染入hRECs。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，并提取總RNA，采用qRT-PCR方法測(cè)定lncRNA MEG3在hRECs內(nèi)的表達(dá)水平(方法同1.2.7)。

1.2.9 Western blot檢測(cè)lncRNA MEG3對(duì)FBXW7蛋白表達(dá)水平的影響待各組hRECs覆蓋培養(yǎng)皿底部大約70%左右的時(shí)候，吸棄培養(yǎng)皿中的完全培養(yǎng)基，用 PBS 清洗 2～3 次。RIPA 裂解液與蛋白酶抑制劑按體積比1001 混合后，每孔加入適量的混合液，放置在冰上 5 min充分裂解。細(xì)胞放置在離心管中并在冰上靜置 20 min，在 4 ℃下13 000 r·min-1離心 15 min，取上清。上清蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳后，將蛋白條帶電轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用50 g·L-1脫脂奶粉封閉，分別使用兔抗人FBXW7一抗、鼠抗兔二抗完成孵育與洗滌，使用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯色試劑盒進(jìn)行顯色。顯色后，條帶使用Gelpro軟件掃描黑度計(jì)算相對(duì)含量，以各樣品對(duì)應(yīng)的GAPDH相對(duì)含量為基準(zhǔn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。高糖組與正常(低糖)組hRECs中l(wèi)ncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)水平差異比較采用單因素方差分析；不同試劑或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組間細(xì)胞移行數(shù)、RWD、細(xì)胞中FBXW7蛋白相對(duì)表達(dá)量、lncRNA-MEG3熒光素酶活性和細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)水平差異比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同環(huán)境下hRECs中l(wèi)ncRNA MEG3的表達(dá)水平以正常(低糖)組hRECs中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)量(1.00±0.09)為基準(zhǔn)，高糖(對(duì)照)組hRECs中l(wèi)ncRNA MEG3的表達(dá)量(0.49±0.05)較正常(低糖)組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=73.613，P=0.001)。

2.2 各組hRECs增殖率比較CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，hRECs連續(xù)培養(yǎng)5 d，高糖(對(duì)照)組與正常(低糖)組相比，hRECs增殖能力顯著上升(F=328.044，P<0.001);lncRNA MEG3過表達(dá)(高糖)組 hRECs增殖能力顯著低于lncRNA MEG3過表達(dá)對(duì)照(高糖)組(F=121.193，P<0.001)；lncRNA MEG3 沉默(高糖)組hRECs增殖能力稍高于lncRNA MEG3沉默對(duì)照(高糖)組，但差異不顯著(F= 0.689，P=0.453)(見表1)。

2.3 過表達(dá)或沉默lncRNA MEG3對(duì)hRECs愈合及遷移能力的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖(對(duì)照)組hRECs[RWD(98.2±9.6)%]愈合速度顯著高于正常(低糖)組[RWD(30.5±4.5)%](F=85.735，P=0.005);lncRNA MEG3過表達(dá)(高糖)組hRECs[RWD(33.6±4.3)%]愈合速度顯著低于lncRNA MEG3過表達(dá)對(duì)照(高糖)組[RWD(30.5±4.5)%](F=121.193，P<0.001)；而lncRNA MEG3沉默(高糖)組hRECs[RWD(99.7±9.2)%]愈合速度略高于lncRNA MEG3沉默對(duì)照(高糖)組[RWD(93.6±8.8)%]，但兩者差異不顯著(F=0.689,P=0.453)(圖1A)。

圖1 過表達(dá)或沉默lncRNA MEG3對(duì)各組hRECs愈合能力及遷移能力的影響 A：愈合實(shí)驗(yàn)觀察過表達(dá)或沉默lncRNA MEG3對(duì)hRECs愈合能力的影響；B：Transwell實(shí)驗(yàn)觀察過表達(dá)或沉默lncRNA MEG3對(duì)hRECs遷移能力的影響。圖中標(biāo)尺為200 μm。

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖(對(duì)照)組hRECs[細(xì)胞遷移數(shù)(377±22)個(gè)]遷移速度顯著高于正常(低糖)組[細(xì)胞遷移數(shù)(322±24)個(gè)](F=89.240，P=0.008)；lncRNA MEG3過表達(dá)(高糖)組hRECs[細(xì)胞遷移數(shù)(209±18)個(gè)]遷移能力顯著低于lncRNA MEG3過表達(dá)對(duì)照(高糖)組[細(xì)胞遷移數(shù)(319±36)個(gè)](F=22.407，P=0.009)；而lncRNA MEG3沉默(高糖)組hRECs[細(xì)胞遷移數(shù)(497±51)個(gè)]遷移能力顯著高于lncRNA MEG3沉默對(duì)照(高糖)組[細(xì)胞遷移數(shù)(352±33)個(gè)](F=17.093，P=0.014)(圖1B)。

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證lncRNA MEG3與miR-223-3p的直接作用經(jīng)預(yù)測(cè)，lncRNA MEG3具有與miR-223-3p直接配對(duì)的兩個(gè)潛在靶點(diǎn)(見圖2)。lncRNA MEG3與miR-223-3p的潛在直接作用位點(diǎn)位于MEG3序列的301-324位(位點(diǎn)1)以及498-518位(位點(diǎn)2)。

圖2 lncRNA MEG3與miR-223-3p的作用位點(diǎn)

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，添加miR-223-3p后野生型 lncRNA MEG3的熒光素酶活性由(100.0±8.3)%降至(51.5±6.2)%(F=66.691,P=0.001)，突變型 lncRNA MEG3的熒光素酶活性由(98.8±6.8)%降至(61.5±5.1)%(位點(diǎn)1，F(xiàn)=58.657,P=0.002)和(70.3±6.2)%(位點(diǎn)2，F(xiàn)=29.104，P=0.006)。而在lncRNA MEG3的雙位點(diǎn)(位點(diǎn)1+位點(diǎn)2)突變中，熒光素酶活性由(98.8±6.8)%降至(97.8±8.3)%，差異不顯著(F=0.049，P=0.836)。該結(jié)果驗(yàn)證了lncRNA MEG3的位點(diǎn)1和位點(diǎn)2都能夠和miR-223-3p發(fā)生直接的相互作用。

2.5 miR-223-3p mimic 逆轉(zhuǎn)過表達(dá)lncRNA MEG3對(duì)hRECs增殖的抑制作用當(dāng)同時(shí)轉(zhuǎn)染過表達(dá)lncRNA MEG3質(zhì)粒和miR-223-3p后，可恢復(fù)高糖的細(xì)胞表型(見表2)。lncRNA MEG3過表達(dá)可顯著抑制hRECs增殖，而共轉(zhuǎn)染miR-223-3p mimic后，lncRNA MEG3過表達(dá)對(duì)hRECs增殖的抑制作用被逆轉(zhuǎn)了。

表2 CCK-8法測(cè)定miR-223-3p對(duì)過表達(dá)lncRNA MEG3后hRECs增殖的影響

2.6 miR-223-3p mimic 逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)lncRNA MEG3對(duì)hRECs細(xì)胞愈合以及遷移能力的抑制作用愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖(對(duì)照)組hRECs愈合能力[RWD(85.5±7.3)%]與lncRNA MEG3過表達(dá)對(duì)照(高糖)組[RWD(86.3±8.2)%]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.145，P=1.553)；lncRNA MEG3過表達(dá)(高糖)組hRECs愈合能力[RWD(28.9±3.6)%]顯著低于lncRNA MEG3過表達(dá)對(duì)照(高糖)組(RWD(86.3±8.2)%](F=89.732，P=0.002)和lncRNA MEG3 +miR-223-3p過表達(dá)(高糖)組[RWD(87.6±9.0)%](F=110.016，P<0.001)及l(fā)ncRNA MEG3過表達(dá)+沉默(高糖)組[RWD(89.5±7.5)%](F= 97.332，P=0.001)(圖3A)。

圖3 共轉(zhuǎn)染miR-223-3p對(duì)lncRNA MEG3過表達(dá)后hRECs愈傷以及遷移的影響 A：共轉(zhuǎn)染miR-223-3p對(duì)lncRNA MEG3過表達(dá)后hRECs愈合能力的影響；B：共轉(zhuǎn)染miR-223-3p對(duì)lncRNA MEG3過表達(dá)后hRECs遷移能力的影響。圖中標(biāo)尺為200 μm。

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖(對(duì)照)組hRECs遷移數(shù)[(385±41)個(gè)]與lncRNA MEG3過表達(dá)對(duì)照(高糖)組[細(xì)胞遷移數(shù)(352±37)個(gè)]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.357，P=0.972)；lncRNA MEG3過表達(dá)(高糖)組hRECs遷移數(shù)[(187±22)個(gè)]顯著低于lncRNA MEG3過表達(dá)對(duì)照(高糖)組[細(xì)胞遷移數(shù)(352±37)個(gè)](F=35.725，P=0.003)； lncRNA MEG3過表達(dá)(高糖)組hRECs遷移數(shù)顯著低于lncRNA MEG3 +miR-223-3p過表達(dá)(高糖)組[細(xì)胞遷移數(shù)(322±34)個(gè)](F=33.338，P=0.004)；而lncRNA MEG3過表達(dá)(高糖)組hRECs遷移數(shù)顯著低于lncRNA MEG3過表達(dá)+沉默(高糖)組[細(xì)胞遷移數(shù)(309±28)個(gè)](F= 30.457，P=0.007)(圖3B)。結(jié)果表明，lncRNA-MEG3可通過調(diào)控 miR-223-3p進(jìn)一步影響hRECs的愈合和遷移能力。

2.7 lncRNA過表達(dá)對(duì)miR-223-3p下游靶點(diǎn)FBXW7的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，正常(低糖)組hRECs中FBXW7蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于高糖(對(duì)照)組(F=195.226，P<0.001); lncRNA MEG3過表達(dá)(高糖)組hRECs中FBXW7蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于lncRNA MEG3過表達(dá)對(duì)照(高糖)組(F=185.443,P<0.001)，而lncRNA MEG3+miR-223-3p過表達(dá)(高糖)組或lncRNA MEG3過表達(dá)+沉默(高糖)組中，這一趨勢(shì)得以逆轉(zhuǎn)(F=162.257，P<0.001；F=145.293，P<0.001)(圖4)。這表明lncRNA MEG3為miR-223-3p的上游基因，可調(diào)控mir-223-3p的下游靶點(diǎn)并發(fā)揮作用；lncRNA MEG3、miR-223-3p以及FBXW7處于同一信號(hào)通路內(nèi)。

圖4 Western blot檢測(cè)各組hRECs內(nèi)FBXW7蛋白表達(dá) 1：正常(低糖)組；2：高糖(對(duì)照)組；3：lncRNA MEG3過表達(dá)對(duì)照(高糖)組；4：lncRNA MEG3過表達(dá)(高糖)組；5：lncRNA MEG3+miR-223-3P過表達(dá)(高糖)組；6：lncRNA MEG3過表達(dá)+沉默(高糖)組。

2.8 PABPC1對(duì)hRECs中l(wèi)ncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)水平的影響高糖條件下，hRECs中l(wèi)ncRNA MEG3的表達(dá)水平(1.00±0.05)為基準(zhǔn)；相對(duì)于lncRNA MEG3過表達(dá)對(duì)照組(0.98±0.04)，PABPC1基因的過表達(dá)則顯著提升了hRECs中l(wèi)ncRNA MEG3的相對(duì)表達(dá)水平(1.64±0.13)(F=70.638，P=0.001)；相對(duì)于lncRNA MEG3沉默對(duì)照(1.02±0.07)，PABPC1基因的沉默則顯著降低了hRECs中l(wèi)ncRNA MEG3的相對(duì)表達(dá)水平(0.49±0.03)(F=145.293，P<0.001)。這說明PABPC1可能是lncRNA MEG3的上游調(diào)控元件。

3 討論

DR作為高致盲眼病之一，臨床上尚無有效的根治方法。因此，全面了解 DR的潛在發(fā)病機(jī)制可為臨床醫(yī)師有效防治DR提供新的理論依據(jù)[13]。課題組曾研究發(fā)現(xiàn),DR發(fā)病中，miR-223-3p的表達(dá)上調(diào)是導(dǎo)致細(xì)胞增殖的重要因素[12]。近年來，lncRNA被確定為新的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)因子[14-15]，lncRNA可以像分子“海綿”一樣吸附下游miRNA而調(diào)節(jié)生物學(xué)功能[8-9]。即lncRNA可以競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miRNA發(fā)揮作用?，F(xiàn)有研究表明，lncRNA與一些眼部疾病及血管生成相關(guān)[10, 16]。在DR進(jìn)展過程中，lncRNA-RNCR2、NEAT2、CDKN2B-AS1和PVT1均有顯著變化[9]; lncRNA MALAT1通過調(diào)節(jié) miR-125b/ve-cadherin 信號(hào)軸促進(jìn)DR新生血管的生成。

本研究中，我們利用RegRNA以及miRcode等在線生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)了lncRNA MEG3和miR-223-3p存在兩個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)，并進(jìn)一步采用雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，miR-223-3p能夠抑制帶有野生型lncRNA MEG3序列質(zhì)粒的熒光素酶活性，這說明兩者是有直接結(jié)合的；而突變位點(diǎn)1后，熒光素酶活性顯著下降，但下降幅度低于野生型，突變位點(diǎn)2后，熒光素酶活性下降幅度繼續(xù)降低。這說明，預(yù)測(cè)的兩個(gè)位點(diǎn)在lncRNA MEG3與miR-223-3p的結(jié)合中起重要作用，而突變位點(diǎn)2發(fā)揮了主要的作用。在高糖培養(yǎng)環(huán)境中，hREC中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)顯著低于正常低糖環(huán)境，這說明lncRNA MEG3在DR的相關(guān)生理環(huán)境中可能是受到抑制的。根據(jù)前期報(bào)道，在人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)miR-223-3p 水平與lncRNA MEG3有一定的關(guān)系[11]，而在本研究中，在高糖環(huán)境中l(wèi)ncRNA MEG3 過表達(dá)可以抑制hRECs的增殖能力、愈合能力以及遷移能力，但這種影響趨勢(shì)能夠被共轉(zhuǎn)染的miR-223-3p或沉默lncRNA MEG3逆轉(zhuǎn)，這說明miR-223-3p極有可能是lncRNA MEG3的直接下游靶點(diǎn)。此外，在前期研究中，miR-223-3p 的3’ UTR 區(qū)域被證明可以與FBXW7直接相互作用，并進(jìn)一步影響 notch1通路[12,17]。因此，本研究觀察了高糖環(huán)境中l(wèi)ncRNA MEG3過表達(dá)對(duì)FBXW7的影響，結(jié)果顯示：過表達(dá)lncRNA MEG3能夠顯著提升hRECs中FBXW7蛋白表達(dá)水平，而共轉(zhuǎn)染miR-223-3p或lncRNA MEG3后，該趨勢(shì)被逆轉(zhuǎn)。這進(jìn)一步證實(shí)了高糖環(huán)境下lncRNA MEG3、miR-223-3p與FBXW7處于同一信號(hào)通路內(nèi)。

根據(jù)前期報(bào)道，PABPC1是一種核酸結(jié)合蛋白，通過結(jié)合 RNA分子的 poly (a)尾部，參與調(diào)節(jié)途徑和穩(wěn)定lncRNA[18-20]。為了探索lncRNA MEG3的上游作用元件并解析高糖環(huán)境中l(wèi)ncRNA MEG3水平降低的分子機(jī)制，本研究利用調(diào)控PABPC1的水平來干預(yù)lncRNA MEG3,結(jié)果顯示，高糖環(huán)境中，過表達(dá)PABPC1可以顯著提升lncRNA MEG3在hRECs中的相對(duì)表達(dá)水平；而沉默PABPC1基因后，lncRNA MEG3相對(duì)表達(dá)水平也顯著降低。這說明PABPC1極有可能是lncRNA MEG3的上游調(diào)控元件。

綜上，本研究圍繞hRECs展開體外細(xì)胞水平的工作，在模擬DR的高糖環(huán)境下，lncRNA MEG3被證實(shí)為miR-223-3p分子的直接上游調(diào)控元件，并通過miR-223-3p對(duì)hRECs的增殖、愈合以及遷移能力等進(jìn)行抑制，同時(shí)也初步驗(yàn)證了lncRNA MEG3的上游調(diào)控元件可能為PABPC1。