低劑量右美托咪定可減輕早期膿毒癥大鼠胃體細(xì)胞凋亡

林雅萍，朱丹丹，林 艷

(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬福州市中醫(yī)院麻醉科，福建 福州 350001)

膿毒癥是最為常見(jiàn)的臨床急危重癥之一，其發(fā)病率及病死率高居不下[1-2]。正常的胃腸功能有助于防止腸道菌群易位，避免發(fā)生及加重膿毒癥。然而，膿毒癥后常常因?yàn)閯×业娜硌仔苑磻?yīng)及血容量再分布而產(chǎn)生胃腸功能紊亂，甚至誘發(fā)應(yīng)激性潰瘍，且以胃底、胃體最為多見(jiàn)[3]。所以膿毒癥胃黏膜保護(hù)顯得尤為重要，包括制酸劑、胃黏膜保護(hù)劑的使用。近年有研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定具有免疫調(diào)節(jié)作用，可抑制細(xì)胞凋亡而減輕腸缺血再灌注損傷[4-5]。右美托咪定是新型α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，因其可靠的鎮(zhèn)靜作用，廣泛應(yīng)用于臨床[6]。本研究旨在通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)，探討右美托咪定對(duì)膿毒癥早期大鼠胃體黏膜損傷抗凋亡保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型及標(biāo)本制備：清潔級(jí)SD健康雄性大鼠32只(購(gòu)自福建吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)，體重180～220 g，隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為正常組(C組)，膿毒癥組(S組)、膿毒癥+右美托咪定高劑量組(H組)及膿毒癥+右美托咪定低劑量組(L組)，每組大鼠8只(詳見(jiàn)圖1)。S組、H組及L組大鼠予腹腔注射脂多糖(1 mg/100 g)腹腔注射誘導(dǎo)模型[7]，并記時(shí)間軸為0時(shí)，C組大鼠腹腔注射同等劑量生理鹽水。H組大鼠4 h后沿尾靜脈以5 μg/(kg·h)泵注右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)持續(xù)2 h，L組大鼠4 h后以10 μg/(kg·h)泵注DEX持續(xù)2 h[8]，C組及S組泵注生理鹽水。大鼠以固定器妥善固定后，將鼠尾浸泡在46～50℃的溫水中2 min后取出，尾靜脈穿刺留置針置管(26G)，固定鼠尾進(jìn)行藥物微注泵入。泵注結(jié)束后采用大鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x(北京軟隆 BP-2010A)測(cè)量尾動(dòng)脈平均動(dòng)脈壓、脈率。24 h后心臟穿刺采血1 ml用于白介素-6(Interleukin-6,IL-6)及腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的檢測(cè)，隨后采用頸椎脫臼法處死大鼠后迅速開(kāi)腹取1.0 cm×1.0 cm大小胃底組織共2份，冰鹽水洗凈后一份凍存于-20℃，用于Western blot檢測(cè)凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)；另一份于4%多聚甲醛固定用于TUNEL法檢測(cè)凋亡系數(shù)。采血處死后10 min內(nèi)完成標(biāo)本。見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物處置方法均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)且本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

圖1 大鼠試驗(yàn)流程圖

1.2試驗(yàn)材料：脂多糖(Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4)購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司(批號(hào)L2630)；右美托咪定購(gòu)自四川國(guó)瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司(批號(hào)1910201)； IL-6及TNF-α采用ELISA法檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(批號(hào)SEKR-0005及SEKR-0009)；Caspase-3、Caspase-9蛋白WB檢測(cè)一抗均購(gòu)自Thermo Fisher公司(批號(hào)43-7800及PA5-22252)；TUNEL試劑盒購(gòu)自Roche公司(批號(hào)19684817510)，組織石蠟切片經(jīng)TUNEL染色后凋亡細(xì)胞被染色成深褐色，由專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行閱片計(jì)數(shù)，每張片分別3次各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，凋亡系數(shù)=凋亡細(xì)胞/100，三次取均值為該標(biāo)本凋亡系數(shù)。操作嚴(yán)格按照各指標(biāo)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1不同組大鼠腹腔注射脂多糖后一般情況：C組大鼠精神狀態(tài)好，活動(dòng)自如，毛色有光澤；S組、H組及L組大鼠腹腔注射脂多糖后1 h均有不同程度無(wú)精打采、立毛、震顫、呼吸急促。24 h后觀察大鼠，S組及H組各有2只出現(xiàn)腹瀉，所有動(dòng)物均未觀察到眼眶后滲出改變，各組大鼠死亡例數(shù)均為0。24 h處死大鼠剖腹可見(jiàn)明顯渾濁腹水，腸管不同程度充血腫脹。以上癥狀及腹部情況表明，與C組對(duì)比，S組、H組及L組大鼠予LPS腹腔注射后均能均一化地誘導(dǎo)為膿毒癥模型。

2.2不同組大鼠平均動(dòng)脈壓、脈率的比較：?jiǎn)我蛩胤讲罘治鎏崾救M大鼠尾動(dòng)脈平均動(dòng)脈壓存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，S組[(112.500±16.844)mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)]與C組[(138.875±14.545)mm Hg]對(duì)比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與S組對(duì)比，H組[(83.875±8.408)mm Hg]顯著性低下，但L組[(108.25±10.389)mm Hg]與S組無(wú)差異；L組大鼠平均動(dòng)脈壓顯著性高于H組。對(duì)比三組大鼠尾動(dòng)脈脈率(次/min)提示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，腹腔注射LPS后，S組[(335.125±10.696)次/min]明顯高于C組[(280.625±10.295)次/min]，同時(shí)高于藥物干預(yù)的H組[(208.875±14.662)次/min]及L組[(259.500±19.741)次/min]，高劑量的H組顯著性低于低劑量L組。見(jiàn)圖2。

注：不同組大鼠尾靜脈平均動(dòng)脈壓及脈率均采用方差分析(平均動(dòng)脈壓對(duì)比F值=24.099，P<0.001；脈率對(duì)比F值=105.962，P<0.001)。兩兩對(duì)比均采用LSD-t檢驗(yàn)，平均動(dòng)脈壓對(duì)比，t(C組、S組)=26.375，P<0.005，t(S組、H組)=28.625，P<0.001,t(S組、L組)=4.25，P=0.518,t(H組、L組)=24.375，P=0.001;脈率對(duì)比，t(C組、S組)=-54.5，P<0.001，t(S組、H組)=126.25，P<0.001,t(S組、L組)=75.625，P<0.001,t(H組、L組)=-50.625，P<0.001。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS代表P>0.05圖2 不同組大鼠尾動(dòng)脈平均動(dòng)脈壓及脈率的比較(n=8)

2.3不同組大鼠IL-6、TNF-α的比較：對(duì)比分析三組大鼠血IL-6及TNF-α呈現(xiàn)相同的差異趨勢(shì)，造模后S組IL-6[(94.818±9.163)pg/ml]明顯高于C組[(1.240±1.023)pg/ml]，高劑量使用DEX后，H組IL-6[(76.020±11.825)pg/ml]低于S組，但與L組[(84.653±15.379)pg/ml]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，L組與S組之間無(wú)差異。各組大鼠進(jìn)行TNF-α對(duì)比，S組TNF-α[(115.281±18.962)pg/ml]高于C組[(11.848±4.539)pg/ml]，H組TNF-α[(87.774±14.007)pg/ml]低于S組，但與L組[(101.416±15.140)pg/ml]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，L組與S組對(duì)比同樣無(wú)差異。見(jiàn)圖3。

注：不同組大鼠IL-6、TNF-α均采用方差分析(IL-6對(duì)比F值=126.225，P<0.001；TNF-α對(duì)比F值=84.808，P<0.001)。兩兩對(duì)比均采用LSD-t檢驗(yàn)，IL-6對(duì)比，t(C組、S組)=-93.577，P<0.005，t(S組、H組)=18.797，P=0.002,t(S組、L組)=10.164，P=0.069,t(H組、L組)=-8.632，P=0.119;TNF-α對(duì)比，t(C組、S組)=-103.433，P<0.001，t(S組、H組)=27.507，P=0.001,t(S組、L組)=13.865，P=0.061,t(H組、L組)=-13.642，P<0.065。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS代表P>0.05圖3 不同組大鼠血白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)的比較(n=8)

2.4不同組大鼠胃底組織TUNEL染色及Caspase-9、Caspase-3蛋白表達(dá)的比較：四組大鼠進(jìn)行TUNEL染色。對(duì)比C組，LPS造模后的S組大鼠胃底細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著性升高；進(jìn)行DEX干預(yù)后,與S組對(duì)比，L組大鼠凋亡細(xì)胞顯著性減輕，但加大DEX用量的H組并未表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡減少。在Caspase-3蛋白表達(dá)量上觀察到同樣的差異，S組 Caspase-3蛋白表達(dá)量最高，H組及L組均低于S組，但只有L組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Caspase-9蛋白的表達(dá)中，H組及L組與S組對(duì)比均無(wú)顯著性差異。見(jiàn)圖4～6。

注：不同組大鼠胃體組織切片，TUNEL法染色后凋亡細(xì)胞被染成深褐色(箭頭所示),400倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)。A為C組見(jiàn)多數(shù)胃底細(xì)胞核淡紫色，未見(jiàn)明顯深褐色染色細(xì)胞；B為S組，深褐色染色細(xì)胞較多，且細(xì)胞排列紊亂；C為H組大鼠胃底組織，深褐色著色細(xì)胞亦較多；D為L(zhǎng)組大鼠，凋亡細(xì)胞較S組及H組減少圖4 不同組大鼠胃體組織TUNEL染色切片(×400)

圖5 不同組大鼠胃底組織Caspase-9及Caspase-3進(jìn)行Western blot條帶圖

注：H值為各組參數(shù)進(jìn)行Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)所得統(tǒng)計(jì)量，凋亡系數(shù)對(duì)比H值=24.905，P<0.001；Caspase-9相對(duì)灰度值對(duì)比H值=22.534，P<0.001；Caspase-3相對(duì)灰度值對(duì)比H值=23.673，P<0.001。兩兩對(duì)比采取Nemenyi法，凋亡系數(shù)對(duì)比，χ2(C組、S組)=-22.688，P<0.001，χ2(S組、H組)=-8.0，P=0.526,χ2(S組、L組)=-13.562，P=0.023,χ2(H組、L組)=-5.562，P=0.235;Caspase-9相對(duì)灰度值對(duì)比，χ2(C組、S組)=-21.0，P<0.001，χ2(S組、H組)=-4.750，P=0.311,χ2(S組、L組)=-11.250，P=0.099,χ2(H組、L組)=-6.50，P=0.166;Caspase-3相對(duì)灰度值對(duì)比，χ2(C組、S組)=-22.50，P<0.001，χ2(S組、H組)=-8.875，P=0.351,χ2(S組、L組)=-12.625，P=0.043,χ2(H組、L組)=-3.75，P=0.424。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS代表P>0.05圖6 不同組大鼠胃底組織凋亡系數(shù)、Caspase-9及Caspase-3相對(duì)灰度值比較(n=8)

3 討論

膿毒癥后大量炎性介質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)，劇烈的炎性反應(yīng)有誘導(dǎo)靶器官細(xì)胞凋亡，引起臟器功能損害[9]，其中急性胃黏膜病變，如應(yīng)激性潰瘍伴出血的發(fā)生將嚴(yán)重威脅患者預(yù)后[3]。本研究旨在針對(duì)膿毒癥早期強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)風(fēng)暴階段，探討右美托咪定對(duì)胃體黏膜的影響，本研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定可降低LPS誘導(dǎo)的膿毒癥早期大鼠的脈率，而高劑量使用DEX會(huì)使原本不高的血壓進(jìn)一步降低，而低劑量則對(duì)血壓影響不大；監(jiān)測(cè)炎性反應(yīng)指標(biāo)，高劑量表現(xiàn)出更加明顯的IL-6、TNF-α下降，在低劑量大鼠中同樣有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；同時(shí)低劑量DEX干預(yù)后可減少膿毒癥大鼠胃體細(xì)胞凋亡，加大劑量干預(yù)則并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

膿毒癥大鼠模型技術(shù)成熟穩(wěn)定，主要有三種方式：腹腔注射脂多糖、細(xì)菌接種及盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)造模[10]。為避免腹部手術(shù)對(duì)大鼠胃體不必要的創(chuàng)傷性影響，本研究采用腹腔注射脂多糖制作膿毒癥模型，造模后大鼠有豎毛、寒戰(zhàn)、呼吸急促，精神萎靡，毛松，剖腹可見(jiàn)渾濁腹水，惡臭，腸管充血腫脹，與李佳紅等研究結(jié)果[7]相符，同時(shí)監(jiān)測(cè)IL-6、TNF-α明顯升高，兩者在膿毒癥炎性反應(yīng)的評(píng)估中有重要意義[11]，表明LPS腹腔注射能夠良好地誘導(dǎo)膿毒癥大鼠模型。

右美托咪定是近年臨床常用的鎮(zhèn)靜藥物，因其對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響小、譫妄發(fā)生率低等優(yōu)勢(shì)受到臨床醫(yī)生的青睞。臨床上，右美托咪定誘導(dǎo)的心率下降較為常見(jiàn)。本研究中發(fā)現(xiàn)右美托咪定干預(yù)后膿毒癥大鼠脈率有所下降，但低劑量對(duì)尾動(dòng)脈平均動(dòng)脈壓變化不明顯，有助于維持血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定。研究表明，右美托咪定除了有助于減輕膿毒癥大鼠血流動(dòng)力學(xué)的變化外[12]，同時(shí)可改善微循環(huán)[13]及抑制炎性反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)等作用[14]，表現(xiàn)為降低IL-6、IL-8、TNF-α及高遷移率族蛋白B1等炎性介質(zhì)的含量[4]。在此研究中同樣發(fā)現(xiàn)右美托咪定干預(yù)后IL-6、TNF-α出現(xiàn)下降，只是高劑量組更加明顯，而低劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)[15]，名為末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法。通過(guò)標(biāo)記細(xì)胞凋亡后出現(xiàn)的DNA末端殘基，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，從病理組織學(xué)角度直觀地評(píng)估組織細(xì)胞凋亡情況。本研究中發(fā)現(xiàn)膿毒癥可增加胃體組織細(xì)胞凋亡，低劑量右美托咪定干預(yù)后凋亡細(xì)胞數(shù)減少，高劑量并未得到更好的效果。同樣的變化趨勢(shì)也發(fā)生在凋亡蛋白Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)上。半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)家族包括多達(dá)10余種Caspase分子，主要是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)不可逆的凋亡程序[16]。本研究觀察到，膿毒癥大鼠無(wú)論是Caspase-9還是Caspase-3較正常大鼠均有明顯增高，DEX藥物干預(yù)后，低劑量組較膿毒癥大鼠表現(xiàn)出顯著性Caspase -3蛋白表達(dá)下降，而Caspase-9蛋白表達(dá)灰度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與此同時(shí)，高劑量干預(yù)組與膿毒癥大鼠對(duì)比未見(jiàn)凋亡蛋白Caspase-9或Caspase-3的表達(dá)顯著性差異。推測(cè)原因可能是低劑量DEX有助于維持膿毒癥血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定及其抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)，改善胃體組織細(xì)胞局部微循環(huán)、減輕炎性反應(yīng)損傷，從而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而高劑量DEX顯著降低血壓有關(guān)，胃組織低灌注帶來(lái)的不良后果掩蓋了DEX的抗凋亡保護(hù)作用。Caspase家族中Caspase-9負(fù)責(zé)凋亡程序起始部分，而Caspase-3是最后執(zhí)行凋亡蛋白之一。至于為什么起始部分的Caspase-9沒(méi)有變化而執(zhí)行者Caspase-3表達(dá)明顯降低？筆者給出的推測(cè)是DEX在膿毒癥中與Caspase蛋白之間存在另一條啟動(dòng)程序模式，其中的具體分子作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，腹腔注射脂多糖是一種可靠的膿毒癥造模方式，同時(shí)可避免胃體組織創(chuàng)傷性損傷的干擾；膿毒癥大鼠可出現(xiàn)血流動(dòng)力學(xué)改變，低劑量右美托咪定干預(yù)后表現(xiàn)為減慢脈率、血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，并通過(guò)減少胃體組織細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)而減少凋亡發(fā)揮保護(hù)作用，而高劑量右美托咪定治療并未見(jiàn)上述的保護(hù)作用。