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    槐耳抗腫瘤活性部位篩選研究

    2021-07-21 13:12:22徐志遠程向東
    關(guān)鍵詞:石油醚藥效批號

    黃 挺 楊 翀 徐志遠 程向東

    槐耳是多孔菌科真菌槐栓菌Trametes robiniophila Murr.的干燥子實體,別名槐檽、槐菌、槐雞、槐蛾、赤雞等,主要分布于我國陜西、山東、河北等地[2]。臨床和基礎(chǔ)實驗證實,槐耳具有良好的抗腫瘤作用,對腫瘤的生長、增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移均具有抑制作用,能誘導(dǎo)惡性腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤血管生成,逆轉(zhuǎn)耐藥細胞株,增強化療藥物敏感性等療效明顯,且對正常細胞毒性小[1-8]。本研究主要探討槐耳不同提取物對不同腫瘤細胞的體外抑制作用,報道如下。

    1 實驗材料

    1.1 細胞株 人肝癌細胞HepG2、人肺癌細胞A549、人胰腺癌細胞PANC-1、人腸癌細胞HCT-116、人胃癌細胞MKN-45、人胃癌細胞BGC-823 細胞株,均來源于中國科學(xué)院生命科學(xué)研究院細胞庫。

    1.2 藥品與試劑 槐耳藥材(浙江佐力百草中藥飲片有限公司,產(chǎn)于山東,批號20151001)經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定教研室陳孔榮教授鑒定,來源于山東,為多孔菌科真菌槐栓菌Trametes robiniophila Murr.的干燥子實體;槐耳顆粒(啟動蓋天力藥業(yè)有限公司,批號EJ14);RPMI Medium Modified 1640(美國HyClone 公司,批號1676918);胎牛血清FBS(Gibco,批號1616966);胰蛋白酶-EDTA 消化液(美國Gibco 公司,批號21467 E16);Cell Counting Kit-8(杭州諾揚生物有限公司,批號010417170406);Phosphate Buffered Saline(美國HyCloneTM公司,批號NAH1449);DMSO(Dimethyl Sulfoxide)(美 國Sigma-Aldrich 公司,批號WXBB8079V)。

    1.3 主要儀器 十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司,型號XS105);千分之一電子天平(常州市幸運電子設(shè)備有限公司,型號JA203H);百分之一天平(常州市幸運電子設(shè)備有限公司,型號XY2000C);臺式冷凍多用離心機(Thermo Electron Corporation,型號CL31R);超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司,型號KQ5200DE);超低溫冰箱(Thermo Electron Corporation);多 功 能 酶 標 儀(Thermo scientific,型號Varioskan Flash);CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation,型號3111);倒置熒光顯微鏡(日本Nikon 公司,OLYMPUS CKX41SF);生物安全柜(Thermo,型號1287)。

    2 實驗方法

    2.1 樣品制備 采用系統(tǒng)溶劑法依次、分段制樣,稱取干燥的槐耳子實體粉末10g,加入10 倍量石油醚加熱回流2 次,每次1h,提取液濃縮得到樣品A(槐耳石油醚浸膏);提取后藥渣經(jīng)減壓濃縮,除去石油醚干燥后加入30 倍量90%乙醇,加熱回流2 次,每次2h,濃縮得到醇提液,濃縮得到樣品B(槐耳醇提浸膏);醇提后藥渣經(jīng)干燥,除去乙醇,加入20 倍量蒸餾水回流3 次,每次2h,得到水提液,濃縮得到樣品C(槐耳水提浸膏)。

    2.2 細胞培養(yǎng) 將冷凍保存的6 種人腫瘤細胞株復(fù)蘇后,HepG2、PANC-1 培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液,A549、HCT-116、MKN-45、BGC-823 細胞株均培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中生長至80%細胞融合,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

    2.3 體外抗腫瘤實驗及提取物再分離 采用CCK-8 法測定不同濃度梯度(16、8、4、2、1、0.5、0.25mg/mL)的槐耳各提取物(A、B、C、B+C、A+B+C)對各種人腫瘤細胞增殖抑制作用。根據(jù)細胞實驗結(jié)果,進而對槐耳乙醇提取物,依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取,回收溶劑后,得到石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。CCK-8 法觀察不同槐耳提取部位對人胃癌BGC-823 細胞增殖的影響。

    2.4 腫瘤細胞處理 人胃癌BGC-823 細胞培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中生長至80%細胞融合,用0.1%胰酶溶液消化,制成單細胞懸液,調(diào)整細胞濃度為5×104個/mL,均勻接種于96 孔微量培養(yǎng)板中,每組3 個復(fù)孔,100μL/孔,置37℃飽和濕度、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h 后,正常對照組加入含等量的培養(yǎng)液;加入濃度梯度的藥物,每100μL/孔,平行設(shè)5 個復(fù)孔,同時設(shè)置不添加細胞懸液為空白對照組,只加100μL 新鮮培養(yǎng)基,平行測定3 次。在同樣條件的培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24h,每孔加入10μL CCK-8 溶液,繼續(xù)孵育2h后停止培養(yǎng),于多功能酶標儀上450nm 處測定各孔的光密度(OD)值,以正常對照組測得的OD 值為對照,按照抑制率公式計算槐耳各提取物組對于腫瘤細胞增殖的抑制效果,計算出IC50 值。抑制率=[1-(實驗組CCK-8 檢測OD 值-空白組OD)/(對照組CCK-8 檢測OD 值-空白組OD)]×100%。

    2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),計量資料以均數(shù)±標準差()表示,兩組間比較采用t 檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 槐耳不同提取物體外抗腫瘤結(jié)果 槐耳各提取物對6 種腫瘤細胞增殖抑制實驗均顯示48h 藥效較24h 藥效更佳。24h 細胞藥效實驗結(jié)果顯示,醇提和石油醚提取部位對胃癌細胞BGC-823 藥效最佳;水提、醇水雙提、石油醚+醇提+水提部位均表現(xiàn)出對腸癌細胞HCT-116 藥效最佳。48h 細胞藥效實驗結(jié)果顯示,水提和石油醚提取部位對胃癌細胞BGC-823藥效最佳;醇水雙提、石油醚+醇提+水提部位均表現(xiàn)出對腸癌細胞HCT-116 藥效最佳;醇提部位對肝癌HepG2 細胞藥效最佳。綜合分析得出槐耳各提取物均對胃癌細胞BGC-823 具有較好的抑制增殖作用,醇水雙提與石油醚+醇提+水提不存在顯著性差異。見表1。

    表1 槐耳不同提取物對不同腫瘤細胞的增殖抑制作用(μg/mL,)

    表1 槐耳不同提取物對不同腫瘤細胞的增殖抑制作用(μg/mL,)

    注:A549 人非小細胞肺癌細胞系;HepG2 為人肝癌細胞;MKN-45 為人胃癌細胞;PANC-1 為人胰腺癌細胞;HCT-116 為人結(jié)腸癌細胞;BGC-823 為人胃腺癌細胞(低分化);與24h 比較,aP<0.05;與24h 水提、醇水雙提、石油醚+醇+水提比較,bP<0.05;與24h 石油醚提、醇提比較,cP<0.05;與48h 醇提、醇水雙提、石油醚+醇+水提比較,dP<0.05;與48h 石油醚提、醇提、水提、石油醚+醇+水提比較,eP<0.05;與48h 石油醚提、水提、醇水雙提、石油醚+醇+水提比較,fP<0.05

    3.2 槐耳醇提取物活性部位對BGC-823 細胞增殖抑制的結(jié)果 槐耳乙醇提取物對BGC-823 細胞的增殖抑制作用較石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取純化組藥效更佳(IC50 值最?。≒ 均<0.01);作用時間48h 較24h 效果好(P 均<0.01)。見表2。

    表2 槐耳醇提取物活性部位對BGC-823 細胞增殖抑制IC50 值(mg/mL,)

    表2 槐耳醇提取物活性部位對BGC-823 細胞增殖抑制IC50 值(mg/mL,)

    注:BGC-823 為人胃腺癌細胞(低分化);與24、48h 石油醚萃取、氯仿萃取、乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取比較,aP<0.01;與24h 比較,bP<0.01

    4 討論

    近年來,國內(nèi)外對中藥槐耳的研究集中在其水提取物上,即槐耳清膏與槐耳顆粒。2018 年《GUT》刊發(fā)了一項由我國39 家醫(yī)院共同開展的多中心隨機雙盲Ⅲ期肝癌臨床研究數(shù)據(jù),結(jié)果提示槐耳可以降低腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)率、延長無復(fù)發(fā)生存期(RFS)[9]。另一項臨床研究表明,口服槐耳顆粒的乳腺癌患者可獲得更長的無病生存期,同時降低乳腺癌患者的血清腫瘤標志物水平,提高患者生存質(zhì)量[10]。

    乙醇作為中藥的提取溶劑具有提取率高,回收簡便等特點,但乙醇對多糖等大極性化合物的提取能力較弱。因此,本實驗研究槐耳醇提物各部位的同時補充水提多糖部位的研究,以保證全面且充分的開展槐耳提取物抗腫瘤的研究?;倍煌崛∥飳Χ喾N腫瘤細胞具有增殖抑制作用,且對BGC-823 細胞具有最佳增殖抑制作用,BGC-823 細胞顯示作用時間48h 較24h 效果好,槐耳醇水雙提提取物IC50值最小,其次是醇提物,不同浸出部位之間有顯著差異。因此,選擇篩選出槐耳抗腫瘤活性最強的是醇水雙提提取物。而此前相關(guān)研究僅限于對槐耳水提物及其多糖成分,并未對槐耳的醇提部位進行成分分析,致使相關(guān)藥用部位被摒棄。

    從槐耳各提取物對人胃癌BGC-823 細胞的增殖抑制試驗中,我們發(fā)現(xiàn)與醇提組作比較,萃取處理后的醇提物較醇提物抗腫瘤效果沒有增加,反而有下降趨勢,可能原因是萃取處理后雖然總黃酮、總?cè)萍兌仍黾樱嬲鹂鼓[瘤作用的不只總黃酮、總?cè)瞥煞?,或者萃取處理后藥材整體性遭到破壞,抗腫瘤成分之間的協(xié)同作用遭到破壞。目前槐耳醇提有效部位的具體成分還需進一步挖掘和鑒定,各成分之間是否存在協(xié)同作用需在后續(xù)實驗中得到證實。因此,后續(xù)實驗擬對槐耳醇提取物中的有效成分進一步分析,并為研究槐耳醇提取物有效單體成分抗腫瘤機制的研究奠定基礎(chǔ)。

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