復合酶水解技術(shù)改善綠茶濃縮液品質(zhì)的研究

楊曉麗

（上?？底R食品科技有限公司，上海201103）

我國的茶文化源遠流長，已經(jīng)有幾千年的歷史[1]。茶葉中富含茶多酚、礦物質(zhì)、氨基酸、維生素、膳食纖維和咖啡堿等，具有降壓、減肥、健美、抗輻射、治糖尿病、提神醒腦、利尿、明目等諸多功效，茶飲料又具有低熱量、低糖、純天然和消暑解渴的特點，因而茶飲料已成為人們消費的一種潮流[2]。目前茶飲料在我國是僅次于水、碳酸飲料的第三大飲品，年產(chǎn)值約1500億元，市場銷售潛力巨大[3]。

茶濃縮液是以成品茶為原料，經(jīng)過浸提、凈化、濃縮、灌裝和滅酶等工序制成的茶原汁或調(diào)味茶汁，在茶飲料生產(chǎn)中可作為原漿或主劑使用，是一種新的茶葉深加工產(chǎn)品[4]。目前，茶葉浸提方法主要有有機溶劑浸提法和水浸提法。有機溶劑浸提法成本較高，技術(shù)難度大，而且對產(chǎn)品有污染[5]。水浸提法成本低、技術(shù)成熟、操作簡易、適用性廣，但也存在浸提不充分，浸提率低等問題[6]。此外，目前水提法生產(chǎn)的綠茶濃縮液氨基酸含量相對較低，并且苦澀味較重，再加上加工過程中滋味香氣成分的損失，使得目前的綠茶濃縮液產(chǎn)品普遍存在滋味淡薄苦澀、鮮醇甘爽不足的問題，無法滿足高端市場的需求[7]。

酶水解具有專一、反應條件溫和等優(yōu)點，目前已經(jīng)廣泛應用于食品、飼料、制藥和化學工業(yè)等行業(yè)中[8]。將酶水解技術(shù)應用于茶飲料的加工過程中，不僅能避免物理方法和化學方法導致的成分損失[9]，還可以提高茶飲料的營養(yǎng)價值和感官品質(zhì)[10]。目前茶飲料加工中應用較普遍的酶有單寧酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等，但將多種酶復合使用的研究還不多見。綜上所述，為了解決目前綠茶濃縮液產(chǎn)品中的不足，研究使用破壁酶提高茶葉中有效成分的溶出率，通過蛋白酶水解提高氨基酸含量，再聯(lián)用單寧酶解決茶濃縮液渾濁問題，從而為改善茶濃縮液品質(zhì)提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

特 制 龍 井 綠 茶 ： 市 售 ；Celluclast 1.5 L、Pectinex Ultra AFP、Pectinex UF：諾維信（中國）生物 技 術(shù) 有 限 公 司 ；Rapidase PRESS、Rapidase ADEX-P、Pectinase AR4、Validase FP500： 帝斯曼（ 中 國 ） 有 限 公 司 ；Pectinase PL、Cellulase A、Cellulase T、Protease A2SD、Protease P6SD、Prote AX、Protease MSD、Sumizyme FP：天野酶制劑商貿(mào)（上海）有限公司；單寧酶KT05：龜甲萬株式會社；Rohament CL、Rohapect B1L：德國AB酶制劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

754PC型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：上海精風儀器有限公司；R201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責任公司；A670型全自動折光儀：海能儀器有限公司；S-433D型全自動氨基酸分析儀：賽卡姆科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 復合酶水解技術(shù)制備綠茶濃縮液工藝流程

取特制龍井綠茶15 g放入燒杯中，按茶水比1∶13加入蒸餾水，在95℃條件下浸提15 min；待浸提液冷卻至45℃后，同時加入破壁酶和單寧酶，恒溫攪拌（300 rpm）15 min，再加入蛋白酶恒溫攪拌15 min；之后繼續(xù)在45℃條件下恒溫水浴8 h，抽濾收集酶解液，沸水加熱15 min滅酶；最后將酶解液濃縮至白利度Brix=40%，即獲得綠茶濃縮液產(chǎn)品。

1.3.2 破壁酶水解條件研究

（1）破壁酶的篩選

按1.3.1所述方法制備綠茶浸提液；待溫度降低到45℃后，分別加入11種破壁酶（Celluclast 1.5 L、Pectinex Ultra AFP、Pectinex UF、Rapidase PRESS、Rapidase ADEX -P、Pectinase AR4、Pectinase PL、Cellulase A、Cellulase T、Rohament CL、Rohapect B1L），加酶量為茶葉重量的0.5%；在45℃條件下恒溫水浴8 h，抽濾收集酶解液，沸水加熱15 min滅酶；待溫度降低到25℃后，用折光儀測定酶解液的Brix，并以此為指標評價不同破壁酶的水解效果。

（2）破壁酶的復配

采用3因素3水平正交試驗的方法優(yōu)化破壁酶的復配比例。選用L9（33）正交表設(shè)計試驗，因素和水平見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.3 蛋白酶水解條件研究

（1）蛋白酶的篩選

按1.3.1所述方法制備綠茶浸提液；待溫度降低到45℃后，分別加入6種蛋白酶（Protease A2SD、Protease P6SD、Prote AX、Protease MSD、Sumizyme FP、Validase FP500）， 加酶量為茶葉重量的1%；在45℃條件下恒溫水浴8 h，抽濾收集酶解液，沸水加熱15 min滅酶；待溫度降低到25℃后測定酶解液氨基酸含量，并以此為指標評價不同蛋白酶的水解效果。

氨基酸含量采用茚三酮比色法測定[11]：取樣品4.0 mL加入具塞比色管中，每管各加入0.5 mL茚三酮溶液和0.5 mL磷酸鹽緩沖液，充分搖勻，在沸水浴下反應15 min，取出后快速冷卻至室溫，加水至10 mL刻度線，充分搖勻，靜置15 min后在570 nm波長條件下測吸光值，并帶入到標準曲線y=269.88x+76.104（R2=0.9944）計算氨基酸含量。

（2）水解時間對蛋白酶水解效果的影響

按1.3.1所述方法制備綠茶浸提液；待溫度降低到45℃后，加入篩選所得蛋白酶，加酶量為茶葉重量的1%；在45℃條件下恒溫水浴10 h，每小時取樣測定酶解液的氨基酸含量，比較水解時間對水解效果的影響。

（3）加酶量對蛋白酶水解效果的影響

按1.3.1所述方法制備綠茶浸提液；待溫度降低到45℃后，加入篩選所得蛋白酶，加酶量分別為茶葉重量的0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%；在45℃條件下恒溫水浴8 h后取樣測定酶解液的氨基酸含量，比較加酶量對水解效果的影響。

（4）單寧酶澄清效果評價

按1.3.1所述方法制備綠茶浸提液；待溫度降低到45℃后，加入單寧酶KT05，加酶量為茶葉重量的0.1%；在45℃條件下恒溫水浴1 h，抽濾收集酶解液，沸水加熱15 min滅酶；酶解液和未經(jīng)酶解的浸提液均在4℃條件下靜置過夜，觀察比較澄清程度。

1.3.4 感官評價

將綠茶濃縮液用蒸餾水稀釋至Brix=0.3%后，由10名經(jīng)過充分訓練的感官評審人員進行感官評價。感官分析包括香氣、鮮味、甜味、苦澀感、回甘、飽滿感及整體口感7種指標，5分為非常滿意，4分為滿意，3分為基本滿意，2分為一般，1分為基本不接受，0分為完全不接受。

1.3.5 氨基酸分析

使用全自動氨基酸分析儀對濃縮液中不同氨基酸的含量進行分析，具體方法參照參考文獻[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 破壁酶水解條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 破壁酶的選擇

由圖1可知，使用破壁酶水解處理后，茶湯的Brix均有所升高，這表明破壁酶能促進茶葉中有效物質(zhì)溶出。茶葉細胞壁主要組分為果膠類物質(zhì)和纖維素，由于其不溶于水，導致茶葉內(nèi)的有效物質(zhì)無法充分釋放出來[13]。實驗選用的破壁酶包括纖維素酶和果膠酶，都能促使茶葉細胞壁破裂，從而使有效成分更易溶出。通過比較不同破壁酶水解后茶湯的Brix可以發(fā)現(xiàn)，Rapidase PRESS、Pectinase PL和Rohapect B1L三種酶的促進效果最佳，因此選擇這三種酶進行復配優(yōu)化。

圖1 不同破壁酶對水解效果的影響Fig.1 Effect of different wall-breaking enzymes on hydrolysis

2.1.2 破壁酶復合比例優(yōu)化

為了確定三種破壁酶最佳復配比例，本研究采用L9（33）正交表設(shè)計試驗，正交實驗結(jié)果見表2。

表2 破壁酶復配正交實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析Table 2 Result and data analysis of wall-breaking enzymes complexation orthogonal experiment particle-shape green tea

由正交試驗結(jié)果可知，三種酶影響茶葉水解效果的順序為：A＞C＞B，即Pectinase PL＞Rohapect B1L＞Rapidase PRESS。最佳復配比例為：Pectinase PL添加量0.5%，Rapidase PRESS添加量0.1%，Rohapect B1L添加量0.2%。通過驗證實驗表明，在該條件下茶湯酶解液中Brix可達到3.61%。

2.2 蛋白酶水解條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 蛋白酶的選擇

氨基酸是茶湯的重要組分，一方面氨基酸是茶湯鮮味的重要來源，同時部分氨基酸還與香氣有關(guān)[14]。因此，氨基酸含量與茶濃縮液品質(zhì)高度正相關(guān)。由于氨基酸在天然茶湯中的含量較低，因此提高茶湯中的氨基酸含量，尤其是鮮甜味氨基酸的含量顯得尤為重要。

由圖2可知，使用蛋白酶水解處理后，茶湯中的氨基酸含量均有所升高，這是由于蛋白酶可以促進茶湯和茶葉中蛋白質(zhì)的分解所致。通過比較不同蛋白酶水解后茶湯的氨基酸含量可以發(fā)現(xiàn)，Sumizyme FP酶的水解效果最佳，因此研究選擇該酶進行茶濃縮液的制備。

圖2 不同蛋白酶對水解效果的影響Fig.2 Effect of different protease on hydrolysis

2.2.2 蛋白酶水解時間的選擇

由圖3可知，隨著水解時間的增加，茶湯中氨基酸含量在前6 h有較快的升高，但當水解達到8 h之后，氨基酸含量上升趨勢明顯變緩。因此為了兼顧效率和成本，研究選擇蛋白酶水解時間為8 h。

圖3 水解時間對蛋白酶水解效果的影響Fig.3 Effect of time on hydrolysis

2.2.3 蛋白酶添加量的選擇

由圖4可知，隨著蛋白酶添加量的增加，茶湯中氨基酸含量呈現(xiàn)先上升后趨于平緩的變化趨勢，這表明當加酶量超過1.5%之后，增加加酶量對提升氨基酸含量的效果變得較為微弱。因此，研究選擇蛋白酶添加量為1.5%。

圖4 加酶量對蛋白酶水解效果的影響Fig.4 Effect of adding amount on hydrolysis

2.3 單寧酶澄清效果

澄清度是影響茶飲料品質(zhì)的重要因素之一，但茶湯在儲藏過程中，尤其是在低溫條件下，容易生產(chǎn)乳酪狀的渾濁物。這種茶乳酪是由茶湯中的茶多酚、咖啡堿、蛋白質(zhì)、少量多糖以及疏水性脂質(zhì)、葉綠素、金屬離子等物質(zhì)間相互作用而形成渾濁沉淀的復雜過程[15-16]，茶飲料的渾濁和沉淀問題是目前茶飲料開發(fā)和生產(chǎn)過程中普遍面臨的重要技術(shù)障礙[17]。酶法處理是一種去除茶乳酪的較好方法，尤其以單寧酶效果最佳，它不僅能很好地消除茶乳酪的形成，而且還能改善茶湯的滋味[18]。

研究按照茶葉重量的0.1%添加單寧酶KT05，用以改善茶湯澄清程度。由圖5可以清楚觀察到，未添加單寧酶的茶湯在4℃條件下靜置過夜后會產(chǎn)生大量渾濁物，而添加了單寧酶的茶湯則仍然保持澄清透明，這表明按本研究的方法添加單寧酶能有效保障綠茶濃縮液的澄清度。

圖5 添加單寧酶茶湯澄清程度Fig.5 Clarification degree of tea soup with tanninase

2.4 綠茶濃縮液氨基酸分析

圖6為傳統(tǒng)水提法與復合酶水解法制備的綠茶濃縮液中各種氨基酸含量對比。由圖可知，復合酶水解法制備的綠茶濃縮液中，氨基酸總量比傳統(tǒng)水提法制備的綠茶濃縮液增加了145%。這是由于水解過程中蛋白酶能將蛋白質(zhì)分解為氨基酸，從而導致復合酶水解制備的綠茶濃縮液中氨基酸含量有顯著增加。

圖6 傳統(tǒng)水提法綠茶濃縮液與復合酶水解法綠茶濃縮液氨基酸對比Fig.6 Amino acid comparison between traditional water extraction green tea concentrate and compound enzyme hydrolysis green tea concentrate

天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、絲氨酸（Ser）和精氨酸（Arg）在茶湯中都具有鮮甜的呈味特點[5]，復合酶水解法制備的綠茶濃縮液中這類氨基酸仍然是氨基酸組分中的主體，并且總量比傳統(tǒng)水提法提高了58%。另外，人體必需氨基酸蘇氨酸（Thr）、蛋氨酸（Met）、賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）的總量也比傳統(tǒng)水提法增加了299%。茶氨酸（The）是茶葉中的主要游離氨基酸，但通過酶水解后茶氨酸含量僅略微升高，說明該酶水解法并不能明顯提高綠茶濃縮液中茶氨酸的含量。

2.5 綠茶濃縮液感官評價

研究從香氣、鮮味、甜味、苦澀感、回甘、飽滿感及整體口感7個方面對傳統(tǒng)水提法與復合酶水解法制備的綠茶濃縮液進行了感官評價，結(jié)果如圖7所示。由圖可知，復合酶水解法對綠茶濃縮液感官品質(zhì)有明顯改善作用，尤其在鮮味方面有明顯提高，這是因為在酶解過程中生產(chǎn)了大量鮮味氨基酸。此外，復合酶水解還能有效降低綠茶濃縮液的苦澀感，這是由于在酶解過程中茶多酚等苦澀味成分發(fā)生轉(zhuǎn)化所致。

圖7 傳統(tǒng)水提法綠茶濃縮液與復合酶水解法綠茶濃縮液感官評價Fig.7 Sensory evaluation of traditional water extraction green tea concentrate and compound enzyme hydrolysis green tea concentrate

3 討論

文章以特制龍井綠茶為原料，使用破壁酶、蛋白酶和單寧酶復合水解技術(shù)改善綠茶濃縮液的品質(zhì)與風味，采用正交實驗優(yōu)化了破壁酶的復配比例，采用單因素實驗的方法優(yōu)化了蛋白酶的水解時間和加酶量，并驗證了單寧酶對茶湯的澄清效果。結(jié)果表明，破壁酶最佳復配比例為Pectinase PL添加量0.5%、Rapidase PRESS添加量0.1%、Rohapect B1L添加量0.2%；蛋白酶Sumizyme FP的最佳水解時間為8 h，最佳加酶量為1.5%；按0.1%加酶量添加單寧酶，可有效改善茶湯澄清程度。采用復合酶水解技術(shù)制備的綠茶濃縮液氨基酸含量顯著提高，營養(yǎng)成分更加豐富，鮮味和甜味更加明顯，苦澀感降低，風味得到明顯改善。