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    超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中的百草枯

    2021-07-21 01:13:24劉相真石琳王靜葉美君
    中國茶葉加工 2021年2期
    關(guān)鍵詞:百草甲酸質(zhì)譜

    劉相真,石琳,王靜,葉美君

    (中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院,浙江杭州310016)

    百草枯(Paraqua)是一種速效觸殺型滅生性季銨鹽類除草劑,具有廣譜速效和觸殺作用,對綠色植物有很強的破壞作用,并且具有在土壤催化下快速失活的特點,失活后無毒素殘留,對環(huán)境影響極小[1],在農(nóng)業(yè)中被廣泛推廣使用。目前,百草枯的使用遍及全世界100多個國家和地區(qū)[2]。但是如不按照指導(dǎo)使用,百草枯對人畜有很強的毒性[3],且無特效解毒藥,是導(dǎo)致人類急性中毒死亡率很高的除草劑[4]。由于百草枯具有高毒性和廣泛使用性的特點,因此建立一種快速、高效、高靈敏度的檢測方法至關(guān)重要。

    目前,百草枯的檢測方法主要有氣相色譜(GC)[5]或氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[6-7]、高效液相色譜法(HPLC)[8-11]或高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)[12-14]、分光光度法(UV)[15-16]等方法[17-18]。氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜法具有分離效果好、靈敏度高、選擇性強等優(yōu)點,是分析檢測中較常用的方法,但在百草枯檢測中存在極性強、難以汽化需衍生以及前處理操作復(fù)雜等問題;高效液相色譜法是百草枯檢測的常用方法,一般用反相色譜柱或親水性色譜柱分離,可保留堿性化合物、無需使用離子對試劑,但存在靈敏度不高,對本底復(fù)雜樣品定性不準(zhǔn)等問題;超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)作為近年來得到廣泛應(yīng)用的技術(shù),具有高選擇性、高靈敏度和痕量檢測等特點,成為檢測分析的重要技術(shù)。

    百草枯為強極性化合物,極易溶于水,采用水浸法提取效率高;在酸性、中性溶液中穩(wěn)定,在堿性溶液中易分解,提取液中加入一定量的酸,可防止百草枯的降解。現(xiàn)有文獻(xiàn)報道主要針對生物樣本(血液或尿)、環(huán)境樣品(水或土壤)及蔬菜水果,而茶葉基體復(fù)雜,含有大量酚類、糖類及生物堿,對質(zhì)譜的霧化電離有著較大的抑制作用。試驗基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法,在SN/T 0293—2014《出口植源性食品中百草枯和敵百快殘留量的測定液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》方法的基礎(chǔ)上,針對茶葉樣品,進(jìn)一步優(yōu)化前處理、色譜條件等,建立了一種準(zhǔn)確、快速、高靈敏度的測定方法,且測定結(jié)果滿足各項質(zhì)控要求。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    市售茶葉樣品紅茶、綠茶、普洱茶和烏龍茶,茶葉磨碎樣品按照GB/T 8303—2013制備。

    1.2 儀器與試劑

    UPLC/TSQ Quantum Access MAX超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國Thermo Fisher-scientific公司);分析天平(感量0.0001 g,瑞士Mettle Tolede公司);FJ-12固相萃取裝置(上海京孚儀器有限公司);SC-3610低速離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);漩渦混合器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

    甲醇(色譜純,美國Tedia公司);甲酸銨和乙酸銨(色譜純,美國Fluka公司);甲酸和37%鹽酸 (色譜純,德國Merck公司);百草枯標(biāo)準(zhǔn)品(100μg/mL,AccuStandard,Inc);200 mg/3 mL C18SPE Cartrideg(島津技邇商貿(mào)有限公司);60 mg/3 mL WondaSepWCX固相萃取柱(島津(上海)實驗器材有限公司);60 mg/3 mL Poly-sery MCX固相萃取柱(ANPEL Laboratory Technologies(Shanghai)Inc);60 mg/3 mL Poly-sery HLB固 相 萃 取 柱(ANPEL Laboratory Technologies(Shanghai)Inc)。

    1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

    準(zhǔn)確移取1 mL百草枯標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度為10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4℃冰箱中避光保存。使用時,用甲醇-水-甲酸溶液(29∶70∶1,V/V/V,含0.5 mol/L甲酸銨)逐級稀釋成5、10、25、50、100、200μg/L標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

    1.4 樣品前處理

    1.4.1 提取

    稱取磨碎茶樣5.0 g(精確至0.001 g)置于50 mL具塞聚乙烯離心管中,加入20 mL甲醇-0.1 mol/L鹽酸溶液 (3∶7,V/V), 旋渦提取1 min后,再超聲提取15 min,以4200 r/min離心5 min,取上清液至50 mL容量瓶中,殘留物繼續(xù)加入20 mL甲醇-0.1 mol/L鹽酸溶液(3∶7,V/V)重復(fù)提取一次,合并兩次提取液于同一容量瓶中,并用水定容至刻度,搖勻,待凈化。

    1.4.2 凈化

    移取10 mL提取液過預(yù)活化后的MCX強陽離子固相萃取柱,棄去流出液;分別用2 mL水、乙腈-甲酸溶液(99∶1,V/V)和甲醇淋洗,然后置于SPE固相萃取裝置-真空泵系統(tǒng)中,將殘留的試劑抽干。 最后用3 mL甲醇-水-甲酸溶液(29∶70∶1,V/V/V,含0.5 mol/L甲酸銨)洗脫,收集洗脫液于5 mL塑料離心管中,旋渦混勻后,過0.22μm有機濾膜,待測。

    1.5 儀器條件

    1.5.1 色譜條件

    色譜柱為Thermo SyncronisTMHILIC(100 mm×2.1 mm,1.7μm,賽默飛世爾科技);流動相A為0.2%甲酸水溶液(含50 mmol/L甲酸銨),流動相B為甲醇,梯度洗脫條件見表1;柱溫40℃;進(jìn)樣量2.0μL。

    表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of the gradient elution

    1.5.2質(zhì)譜條件

    電離模式:電噴霧離子化(ESI);電離源極性:正模式;霧化氣:N2;離子噴霧電壓:4000 V;霧化室溫度120℃;離子傳輸管溫度380℃;碰撞氣:Ar,0.12 Pa;掃描模式為SRM多反應(yīng)監(jiān)測掃描,掃描時間段為3.5~5.5 min。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

    表2 百草枯的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS/MS parameters for paraqua

    2 結(jié)果與分析

    2.1 前處理條件優(yōu)化

    2.1.1 提取溶劑的選擇

    百草枯極易溶于水,用純水、0.1 mol/L鹽酸溶液、甲醇-0.1 mol/L鹽酸以及甲醇對茶葉中的百草枯進(jìn)行提取,發(fā)現(xiàn)單獨用純水、0.1 mol/L鹽酸溶液、甲醇對茶葉中百草枯的提取率不高,通過在鹽酸溶液加入一定比例的甲醇可以顯著提高提取率。分別對純水、0.1 mol/L鹽酸溶液、甲醇以及不同比例的甲醇-0.1 mol/L鹽酸溶液 (1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5,V/V)的提取效率進(jìn)行了比較,結(jié)果如圖1所示。甲醇-0.1 mol/L鹽酸溶液(3∶7)提取回收率最高,為96%,故選為試驗的提取試劑。

    圖1 不同提取試劑對茶葉中百草枯的回收率比較Fig.1 Comparison of recoveries with different extraction reagents for paraquat in tea

    2.1.2 凈化方式的選擇

    百草枯在酸性溶液中主要以離子形式存在,可采用離子交換固相柱凈化。試驗對C18(疏水性反相硅膠基質(zhì)吸附柱)、HLB(親水性反相吸附柱)、MCX(強陽離子交換柱)和WCX(弱陽離子交換柱)的凈化效果進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)用C18和HLB凈化,茶葉中的茶多酚、咖啡堿及色素等均無法除去,雜質(zhì)較多,影響質(zhì)譜檢測的靈敏度,檢出限為0.1μg/mL,無法滿足質(zhì)控的需要;用WCX凈化,在過柱前需用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)提取液pH值至7.0±0.1,茶葉提取液會產(chǎn)生絮狀沉淀影響過柱效果,百草枯回收率較低,特別在低濃度時,0.01、0.05μg/mL的回收率分別僅有32%和60%,造成該結(jié)果的原因可能是加入NaOH溶液打破了原有提取液的電解質(zhì)平衡,在離子效應(yīng)、電解質(zhì)作用和共沉效應(yīng)等共同作用下,茶多酚、氨基酸、糖類等聚合成大分子物質(zhì)形成絡(luò)合物而沉淀,影響百草枯的回收率。

    由于百草枯的pKa大于10,MCX柱在酸性條件下對百草枯有很強的相互作用力,可以直接在酸性條件下直接過柱,無需調(diào)節(jié)pH值,并且可以用水、甲醇、乙腈-甲酸溶液(98∶2,V/V)或氨水-甲醇(5∶95,V/V)、氨水-乙腈(5∶95,V/V)淋洗柱子去除茶多酚、咖啡堿、糖類及色素等雜質(zhì),且不會造成百草枯的損失,達(dá)到較好的凈化效果;采用離子強度更大的甲醇-水-甲酸溶液洗脫,洗脫強度隨著甲酸銨緩沖液的濃度增大而增大,洗脫體積隨之減少,但考慮高濃度的鹽易造成色譜柱堵塞和對質(zhì)譜離子化效果的減弱,試驗采用甲醇-水-甲酸溶液(29∶70∶1,V/V/V,含0.5 mol/L甲酸銨)實現(xiàn)了較完全洗脫,其洗脫效果如圖2所示。

    圖2 百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液在MCX小柱上的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of paraquat on MCX column

    2.2 檢測條件優(yōu)化

    2.2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

    根據(jù)百草枯的結(jié)構(gòu)特征,采用ESI+模式。用10μg/mL百草枯的單體標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化,選擇準(zhǔn)分子離子[M+H]+作為母離子,進(jìn)行MRM模式優(yōu)化各質(zhì)譜參數(shù)(包括碰撞能量、透鏡補償電壓等),以獲得穩(wěn)定性好、信號強度高的碎片離子。100 ng/mL的百草枯提取色譜圖、空白茶葉樣品提取色譜圖和茶葉樣品中添加0.3 mg/kg的百草枯提取色譜圖如圖3所示。

    圖3 百草枯的質(zhì)譜圖Fig.3 MRM chromatograms of paraquat

    2.2.2 色譜柱的選擇

    由于百草枯極性較強,在反相色譜柱上的保留時間極短,難以與干擾物有效分離。實驗選用Thermo SyncronisTMHILIC色譜柱進(jìn)行分析,能夠有效實現(xiàn)百草枯的保留以及與干擾物的分離。

    2.2.3 流動相的選擇

    試驗考察了有機相乙腈與水相中不同pH值的甲酸水溶液和不同濃度的甲酸銨對百草枯的分離效果的影響,結(jié)果表明,水相中不同濃度的甲酸銨含有的甲酸濃度低于0.2%時,峰型裂峰或拖尾,并且檢測靈敏度低;在水相中添加0.2%甲酸時,百草枯的靈敏度高,分離效果滿意。可能因為在正離子模式下,酸性能夠促進(jìn)化合物的離子化,提高化合物的離子化效率和靈敏度。

    試驗在0.2%的甲酸水溶液的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步添加不同濃度的甲酸銨。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在一定范圍內(nèi),隨著甲酸銨濃度的升高,峰寬變窄,峰高升高,信噪比增大,靈敏度提高,峰型對稱性變得更好。當(dāng)甲酸銨濃度大于50 mmol/L時,靈敏度無明顯提升,但高濃度的甲酸銨會造成泵的損壞、色譜柱和管路系統(tǒng)的堵塞。因此,實驗選擇甲醇0.2%甲酸-甲醇溶液(含50 mmol/L甲酸銨)作為流動相。

    2.3 方法驗證

    2.3.1 線性關(guān)系和方法檢出限

    按“1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制”和“1.5儀器條件”進(jìn)行測定,根據(jù)3倍信噪比(S/N)確定百草枯的檢出限為3μg/kg,10倍信噪比(S/N)確定百草枯的定量限為10μg/kg。百草枯在標(biāo)準(zhǔn)系列范圍內(nèi)峰面積與樣液濃度呈線性相關(guān),百草枯的計算回歸方程為y=0.0197x-0.0179,R2=0.9994,線性關(guān)系良好。

    圖4 百草枯的標(biāo)準(zhǔn)曲線(0.005~0.200μg/mL)Fig.4 Standard curve for paraquat(0.005~0.200μg/mL)

    2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度

    選取市售綠茶、紅茶、普洱茶、烏龍茶樣品,分別作空白及添加相當(dāng)于定量限、2倍定量限及0.2 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品,按上述方法進(jìn)行分析檢測,采用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線外標(biāo)法定量,每個加標(biāo)水平平行測試6次,加標(biāo)回收率與精密度如表4所示。結(jié)果顯示,方法的回收率為81.4%~93.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%~5.6%,其準(zhǔn)確度與精密度均能滿足茶葉中百草枯檢測的要求。

    表4 茶葉中百草枯的加標(biāo)回收率和精密度Table 4 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of paraquat in tea

    2.3.3 基質(zhì)效應(yīng)

    為考察茶葉的基質(zhì)效應(yīng),以空白綠茶、紅茶、普洱茶、烏龍茶為基體,按照1.4所述方法進(jìn)行前處理,用收集的基質(zhì)配置標(biāo)準(zhǔn)系列溶液制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,與以無基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線作對比。結(jié)果顯示,以空白綠茶、紅茶、普洱茶、烏龍茶為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與無基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的比值分 別 為1.03、1.12、1.05、1.08, 其 斜 率 比 值 均 在0.8~1.2之間,認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)較低[19],故文章采用甲醇-水-甲酸溶液(29∶70∶1,V/V/V,含0.5 mol/L甲酸銨)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

    3 結(jié)論

    茶葉中的化學(xué)成分復(fù)雜,含有色素類、生物堿、多酚類等物質(zhì)會干擾樣品的檢測,對檢測結(jié)果造成影響。文章根據(jù)MCX柱填料與百草枯具有很強的相互作用力,采用在酸性條件下,提取后直接過柱,用水、乙腈-甲酸溶液和甲醇淋洗柱子去除大部分色素、多酚等物質(zhì)后,用甲醇-水-甲酸溶液(含0.5 mol/L甲酸銨)洗脫,操作簡便、凈化效果好,且準(zhǔn)確度與精確度均能滿足植物源性食品中農(nóng)藥殘留檢測的需要,可作為農(nóng)藥殘留分析的日常檢測方法。

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