維生素C對酒精性肝損傷大鼠腸道菌群的影響

◎匡逸靜，謝安琪，田 鵬，陶泳兵，沈 奎，李永儒，楊 艷

（1.西南醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院預防醫(yī)學專業(yè)，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗與檢疫教研室，四川 瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，四川 瀘州 646000）

酒精性肝病（Alcoholic Liver Disease，ALD）是指長期攝入酒精所引起的肝臟損傷性疾病，其發(fā)病率和死亡率在全球都處于較高水平。動物實驗和人群研究均顯示，ALD 與腸道菌群紊亂相互影響[1]，腸道菌群紊亂可由酒精誘導產生，而其在ALD 的發(fā)病和轉歸過程中又起著重要的作用，其機制可能與乳酸桿菌等腸道菌群的生長被抑制有關[2-3]。維生素C 作為一種對氧自由基有很強的清除作用的高效抗氧化劑，它可以通過減輕氧化應激反應，促進受損組織細胞的修復，對酒精引起的肝損傷具有保護作用[4]；維生素C還可提高腸黏膜的屏障功能，從而降低腸源性感染發(fā)生率，腸道內細菌移位可被抑制，同時保護腸黏膜[5-6]。實驗采用酒精灌胃法復制大鼠酒精性肝損傷模型，給予低、中、高劑量維生素C 干預，驗證維生素C對酒精性肝損傷保護作用，同時進一步探索維生素C對酒精性肝損傷大鼠腸道菌群的影響，為治療ALD 與發(fā)現(xiàn)新的潛在作用靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物

SD 雄性健康大鼠52 只，體重150～180 g，成都達碩公司提供，實驗動物生產許可證：SCXK（川）2015-030，實驗動物使用許可證：SYXK（川）2018-065。

1.1.2 試劑

56%vol 紅星二鍋頭白酒（北京紅星股份有限公司）；維生素C（分析純，西隴科學股份有限公司）；谷丙轉氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；伊紅美藍培養(yǎng)基（Eosin-methylene blue medium，EMB）、BEA 瓊脂培養(yǎng)基、LBS 瓊脂培養(yǎng)基、BL 瓊脂培養(yǎng)基平板計數(shù)瓊脂（Plate Count Agar，PCA）均購于青島海博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Versamax 連續(xù)波長酶標儀（ 美國Molecular Devices 公司）、5810R 冷凍型臺式大容量高速離心機（德國Eppendorf 公司）、LD4-2A 型臺式低速離心機（北京眾益中和生物技術有限公司）、HH-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）、LRH-150 生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）、GR85DA 全自動高壓滅菌器（美國致微儀器股份有限公司）及HG-9240A 鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）[7]。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

適應性喂養(yǎng)一周后，將52 只雄性SD 大鼠按體重隨機分為5 組，據(jù)實驗經驗，酒精模型組大鼠易死亡，故除酒精模型組為12 只大鼠外，其余每組10 只大鼠，其中4 組復制酒精性肝損傷模型：酒精模型組（以下簡稱模型組），維生素C 低、中、高劑量干預組（以下簡稱低、中、高劑量組），另設正常對照組（以下簡稱正常組）。

1.3.2 造模與干預

有研究顯示，在酒精性肝損傷相關實驗研究中梯度酒精灌胃的造模方式優(yōu)于固定酒精灌胃造模方式[8]，故采用屈勝勝等人所用的梯度酒精灌胃法復制酒精性肝損傷大鼠模型[9]。除正常組以外，其余各組以56%vol 白酒灌胃，白酒灌胃劑量為第1 周6 mL·kg-1，第2 周8 mL·kg-1，3 周～6 周10 mL·kg-1。維C 低、中、高劑量組分別按大鼠體重20 mg·kg-1·d-1、100 mg·kg-1·d-1、500 mg·kg-1·d-1灌胃維生素C。維生素C 溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，5 h后灌胃白酒，持續(xù)6 周。實驗過程中對各組大鼠的一般情況，包括毛色、攝食、精神狀態(tài)及活動情況等進行觀察并記錄，每周稱重。

1.3.3 標本的采集、制備與檢測

按培養(yǎng)基說明書配制不同菌種專用培養(yǎng)基，實驗最后一天，無菌操作采集各組大鼠新鮮糞便，稱重，10 倍系列稀釋至10-7g·mL-1。分別取10-5g·mL-1、10-6g·mL-1、10-7g·mL-1濃度的20 μL 糞便稀釋液涂布于PCA 培養(yǎng)基（檢測需氧菌，37 ℃培養(yǎng)48 h），LBS 瓊脂培養(yǎng)基（檢測雙歧桿菌，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h），BL 瓊脂培養(yǎng)基（檢測乳酸桿菌，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h），分別取10-4g·mL-1、10-5g·mL-1、10-6g·mL-1濃度的20 μL糞便稀釋液涂布于EMB 培養(yǎng)基（檢測大腸桿菌，37 ℃培養(yǎng)48 h）、BEA 培養(yǎng)基（檢測腸球菌，37 ℃培養(yǎng)48 h）；每個稀釋度做兩個重復。按照前述培養(yǎng)條件培養(yǎng)后進行菌落計數(shù)。結果取對數(shù)，表示為lgCFU·g-1。

末次灌胃結束后禁食禁飲12 h，動物稱重麻醉（按體重腹腔注射1%戊巴比妥鈉，4 mL·kg-1），腹主動脈采血，3 000 r·min-1離心10 min 后取血清，按試劑盒說明檢測AST、ALT、SOD、MDA。采血完畢后處死大鼠，迅速取出大鼠完整肝臟，冷生理鹽水沖洗濾干，稱重，并按式（1）計算大鼠肝體比。

1.4 統(tǒng)計學處理

使用Excel 2016 進行實驗數(shù)據(jù)錄入和整理，SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行分析。采用±s作統(tǒng)計描述，單因素方差分析作統(tǒng)計推斷，LSD法（最小顯著性差異法）作兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 維生素C對酒精性肝損傷大鼠一般情況的影響

正常組毛發(fā)光滑，活躍，對外界刺激反應靈敏，食欲佳，體重穩(wěn)定增長。隨著灌胃時間的延長，模型組出現(xiàn)毛色無光澤、反應遲鈍、精神萎靡、食欲不佳、體重減少及嗜睡等現(xiàn)象，甚至翻正反射暫時性消失，0.5～1.5 h 后恢復正常，灌胃時掙扎劇烈，灌胃后站立不穩(wěn)，實驗中模型組2 只大鼠死亡。維生素C 干預組大鼠精神、食欲及活動狀態(tài)較模型組稍好，但比正常組差。

2.2 維生素C對酒精性肝損傷大鼠肝體比的影響

與正常組大鼠相比，模型組、維生素C 干預組肝體比均增高（P＜0.05）；與模型組大鼠相比，維生素C 干預組的肝體比均降低（P＜0.05）；各維生素C 干預組大鼠肝體比無差異（P＞0.05），具體檢測結果見表1。

表1 維生素C對酒精性肝損傷大鼠肝體比的影響表（n=10）

2.3 維生素C對酒精性肝損傷大鼠血清AST、ALT 的影響

與正常組比較，模型組、維生素C 干預組血清AST、ALT 均升高（P＜0.05）；與模型組相比，維C 干預組的大鼠AST、ALT 均降低（P＜0.05）；中劑量組ALT、高劑量組AST、ALT 均低于低劑量組（P＜0.05），其余維C 干預組AST、ALT 兩兩比較無差異（P＞0.05）。具體檢測結果見表2。

表2 維生素C對酒精性肝損傷大鼠血清AST、ALT 的影響表（n=10）

2.4 維生素C對酒精性肝損傷大鼠血清SOD、MDA 的影響

與正常組相比，模型組、各維生素C 干預組血清SOD 均降低，MDA 均升高（P＜0.05）；與模型組相比，低、中、高劑量組SOD均升高，MDA均降低（P＜0.05）；與低劑量組相比，高劑量組SOD 升高，中劑量組和高劑量組MDA 均降低（P＜0.05），高劑量組SOD 高于中劑量組（P＜0.05），其余維C 干預組SOD、MDA 兩兩比較無差異（P＞0.05）。具體檢測結果見表3。

表3 維生素C對酒精性肝損傷大鼠血清SOD、MDA 的影響表（n=10）

2.5 維生素C對酒精性肝損傷大鼠腸道菌群的影響

與正常組相比，模型組大鼠腸道中的需氧菌、大腸桿菌、腸球菌數(shù)量均增加，乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量均減少（P＜0.05）；與模型組相比，維C 干預組需氧菌、大腸桿菌、腸球菌均減少，乳酸桿菌均增加（P＜0.05），雙歧桿菌除低劑量組與模型組之間無差異外，中、高劑量組較模型組均增加（P＜0.05）；與低劑量組相比，中劑量組大腸桿菌減少，乳酸桿菌增多，高劑量組的需氧菌、大腸桿菌、腸球菌均減少，乳酸桿菌、雙歧桿菌均增加（P＜0.05）；高劑量組與中劑量組比較除腸球菌減少（P＜0.05）外，其余菌種均無差異。具體檢測結果見表4。

表4 維生素C對酒精性肝損傷大鼠腸道菌群數(shù)量的影響表（單位：lgCFU·g-1，n=10）

3 結論與討論

酒精進入人體后90%～98%的氧化代謝都是在肝臟中進行，肝臟在酒精代謝過程中至關重要。許多研究顯示，氧化應激是ALD 重要的發(fā)病機制之一[10]，SOD 是細胞內抗氧化酶系中最重要的一種酶，正常肝臟內存在的SOD 能夠清除自由基起到抗氧化的作用，而酒精的攝入引發(fā)自由基攻擊健康肝細胞，消耗大量SOD，產生脂質過氧化物，MDA 是生物體脂質過氧化的標志物。實驗采用梯度酒精灌胃方式復制酒精性肝損傷大鼠模型，將大鼠AST、ALT 升高及大鼠肝體比升高作為判斷肝細胞損傷的標準[11]，將SOD 降低和MDA 增加作為機體抗氧化失衡的標志。實驗中模型組大鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲不佳、毛發(fā)發(fā)黃、肝體比升高現(xiàn)象，血清檢測結果顯示，模型組大鼠AST、ALT、MDA 升高，SOD 降低，說明大鼠肝細胞損傷，出現(xiàn)抗氧化失衡，酒精性肝損傷模型造模成功。實驗結果顯示各維C 干預組大鼠血清AST、ALT、MDA和肝體比均降低，SOD 升高，且呈現(xiàn)一定劑量反應關系，說明維生素C 對于酒精造成的大鼠肝損傷具有保護作用，與相關研究結果一致[1,6,12]。

肝臟具有特殊的生理結構，有動靜脈和門靜脈兩個血液循環(huán)系統(tǒng)，通過門靜脈收集各消化道回流的血液，這使肝臟在吸收腸道營養(yǎng)物質的同時，也暴露于來自腸道的有害微生物產物之中[13]。肝臟特殊的生理結構使其與腸道關系密切，稱為“肝-腸”軸，也說明ALD 的發(fā)病與腸道微生態(tài)失調有密切關系[14-15]。在正常情況下，腸道菌群處于一種動態(tài)的平衡中，腸道中的雙歧桿菌和擬桿菌具有維護腸道黏膜屏障功能和完整性的作用，而大腸桿菌等革蘭氏陰性菌能夠產生內毒素，如脂多糖（LPS）可介導炎癥反應，降低腸道黏膜通透性[16-17]。許多研究已證實長期飲酒的人群和ALD 患者存在體內大腸桿菌、腸球菌等有害菌數(shù)量增加，而雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌數(shù)量減少的現(xiàn)象，在實驗中模型組也出現(xiàn)了同樣的結果，這說明酒精性肝損傷大鼠出現(xiàn)了腸道菌群的失調[4]。酒精進入機體后代謝產生的乙醛，在直接引起肝臟損傷的同時，也可以誘發(fā)腸道的炎癥反應，增加腸道黏膜的通透性，由于腸道菌群結構改變，內毒素生成增多，大量LPS 通過腸道黏膜屏障借助門靜脈循環(huán)到達肝臟，加重肝臟的炎癥反應，從而促進ALD 的發(fā)生。實驗發(fā)現(xiàn)，維生素C 干預組大鼠腸道的乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量較模型組顯著增多，高劑量組甚至恢復到正常組水平，而需氧菌、大腸桿菌和腸球菌顯著減少，各干預組之間呈現(xiàn)一定的劑量反應關系，與相關人群研究結果類似[4]，說明維生素C對酒精性肝損傷大鼠的腸道菌群失衡有改善作用。

維生素C 可有效降低大鼠血清轉氨酶含量，調節(jié)機體抗氧化失衡，改善酒精引起的大鼠肝臟損傷，其作用機制可能是：維生素C 通過調節(jié)腸道菌群結構，增加有益菌（如乳酸桿菌、雙歧桿菌）數(shù)量，減少有害菌（如需氧菌、腸桿菌、腸球菌）數(shù)量，改善腸道菌群失調，保護腸道黏膜，促進肝臟損傷的恢復。