平板計數(shù)法檢測肉制品中單核增生李斯特氏菌的不確定度分析與評定

◎劉胤璇，王劍飛，楊蕊銀，何 磊，白秀珍

（紅河州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 蒙自 661199）

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytocytogenes，LM）是一種革蘭氏陽性桿狀細菌，簡稱單增李斯特菌。單增李斯特菌是引發(fā)食物中毒的重要病原菌[1-2]，菌株即使在低溫和酸性環(huán)境中也能夠生存[3]，且李斯特菌可在食物表面形成生物膜，導(dǎo)致食物交叉污染[4-5]。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)[6]，主要反映測量結(jié)果的可信程度，為測定結(jié)果的準確性分析提供技術(shù)支撐[7]，因此評定測量不確定度是衡量測量結(jié)果質(zhì)量的重要指標[8]。本研究在肉制品中定量添加單增李斯特菌標準菌種，通過分析計算檢驗過程的不確定度，建立平板計數(shù)法測定肉制品中單核增生李斯特氏菌的不確定度評定方法，在具體檢測中提高科學(xué)性和準確性[7,9-10]。

1 材料和方法

1.1 樣品

以即食火腿腸為測試樣品，加入單增李斯特菌（編號ATCC19111，第2 代工作用菌種）菌懸液，用拍擊式均質(zhì)器拍擊2 min 制備成1∶10 的樣品勻液。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

T500 電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）、PREVI Color Gram 全自動革蘭氏染色儀（法國梅里埃公司）、1 mL/10 mL 移液器（德國普蘭德公司）、BD115 培養(yǎng)箱（德國BINDER 公司）、HBM-400C 樣品均質(zhì)器（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）及數(shù)顯溫濕度計（德國testo 公司）。

1.2.2 試劑

LB 肉湯、李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、木糖、鼠李糖、TSA-YE 培養(yǎng)基、SIM 動力培養(yǎng)基、過氧化氫酶、單增李斯特氏菌干制生化鑒定試劑盒。以上試劑生產(chǎn)企業(yè)均為北京路橋技術(shù)股份公司。

1.3 檢驗方法

依據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB 4789.30—2016）[11]第二法進行檢驗。在相同實驗條件下，兩名檢驗人員分別對相同的10 份樣品進行檢驗，合計進行20 次實驗。參照《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[6]、《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》（RB/T 151—2016）[12]對結(jié)果進行不確定度分析評定。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立數(shù)學(xué)模型

選擇菌落數(shù)在15～150 CFU 的條件下建立數(shù)學(xué)模型（1）。

式（1）中，T-樣品中單核增生李斯特氏菌菌落數(shù)，單位為CFU·mL-1（g）；A-某一稀釋度典型菌落的總數(shù)，單位為CFU；B-某一稀釋度鑒定為陽性的菌落數(shù)，單位為CFU；C-某一稀釋度用于鑒定試驗的菌落數(shù)，單位為CFU；d-稀釋因子。

2.2 測量不確定度分析

依照“黑匣子”的方法，確定和分析單增李斯特氏菌不確定度的分量來源[7,9,12-16]，不確定度分量來源見圖1。

圖1 不確定度分量來源圖

2.3 不確定度分量的計算

2.3.1 稱量樣品引入的相對不確定度urel（Ws）

稱量樣品引入的不確定度來源：①天平校準的不確定度。T500 電子天平（d=0.1 g） 檢定證書最大允許誤差為±0.5 g，按矩形分布，。②天平可讀性引入的不確定度。天平最小有效數(shù)字為0.1 g，按矩形分布，。③天平稱量重復(fù)性引入的不確定度。電子天平檢定證書給出的重復(fù)性誤差為0，故u（WR3）=0。

2.3.2 制備樣品均液引入的相對不確定度urel（Vs）

制備樣品均液使用量筒量取225 mL 稀釋液，引入的不確定度來源：①溫度引起變化的不確定度u（Td）。實驗室溫度為21.5 ℃，與20 ℃相差1.5 ℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃[7]，假設(shè)矩形分布，則。②量筒容量允差引入的不確定度。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[17]規(guī)定，250 mL 量筒的容量允差分別為±2.0 mL，假設(shè)矩形分布，u（V1-1）=1.154 7 mL。③量筒分辨率的不確定度，225 mL 量筒分辨率為5 mL，假設(shè)三角分布，u（V1-2）=1.020 6 mL。

2.3.3 樣品10 倍稀釋引入的相對不確定度urel（X1）

樣品稀釋至1∶100，使用1 mL 移液器移取1 mL的1∶10 樣品均液至9 mL 稀釋液（使用10 mL 移液器移取），引入的不確定度來源：①溫度引起體積變化的不確定度u（Td2）。實驗室溫度21.5 ℃：

②移液器允差的不確定度u(VR2)。根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）[18]規(guī)定，1 mL、10 mL 移液器容量允差分別為1.0%、0.6%。假設(shè)三角分布，1 mL移液器移取1 mL不確定度u(VR2-1mL)=0.004 1 mL，10 mL移液器移取9 mL 不確定度u(VR2-9mL)=0.022 0 mL。

綜合上述兩個不確定度，移液器引入的合成不確定度為：

相對不確定度：urel(V2-1mL)=0.004 1÷1=0.004 1，u(V2-9mL)=0.022 1÷9=0.002 5。因此，10 倍稀釋引入的相對不確定度urel(X1)=0.004 8。

2.3.4 樣品加樣體積引入的相對不確定度urel(X2)

1∶10、1∶100 兩個稀釋度分別用1 mL 移液器移取0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 三個平板，假設(shè)三角分布，相對不確定度分別為：0.004 1、0.004 1、0.004 1，合成單次不確定度為

兩次加樣引入的相對不確定度

2.3.5 重復(fù)試驗引入的相對不確定度urel(N)

由于重復(fù)實驗結(jié)果的數(shù)值偏離比較大，采用統(tǒng)計學(xué)對數(shù)的方法對其結(jié)果的數(shù)值進行不確定度計算，檢驗結(jié)果見表1、表2。重復(fù)試驗引入的相對不確定度來源：

表1 重復(fù)檢測單增李斯特氏菌含量表（單位：CFU·g-1）

表2 重復(fù)檢測單增李斯特氏菌含量對數(shù)結(jié)果表

①重復(fù)檢驗引入的不確定度，

②不同人員實驗組間變化引入的相對不確定度：

2.4 相對合成不確定度uc,rel

比較各不確定度分量，分析其產(chǎn)生的原因，計算相對合成不確定度

2.5 擴展不確定的u95rel

實驗中，取包含因子k=2，置信概率為95%，則樣品中單增李斯特菌含量對數(shù)的擴展不確定度u95rel=0.115 0。本次實驗測得單增李斯特菌含量對數(shù)均值為3.868 4，結(jié)果報告為103.8684±0.1150，即單增李斯特菌含量為5 700～9 600 CFU·g-1。

3 結(jié)論

食品安全問題是當今社會普遍關(guān)注的焦點，如何快速分析食品安全隱患及提高檢測準確度是解決食品安全問題的關(guān)鍵。測量不確定度是評價測量值可信度的重要參數(shù)。從本次實驗結(jié)果可以看出，樣品稱量、稀釋、加樣、重復(fù)實驗等都會對實驗結(jié)果準確度產(chǎn)生影響，其中占主要部分的是重復(fù)試驗引入的不確定度分量。考慮到不同菌種均勻性、設(shè)備、培養(yǎng)基等對結(jié)果不確定度均會產(chǎn)生影響，建議對每種目標菌均進行不確定度評定；當更換設(shè)備、培養(yǎng)基時應(yīng)重新對不確定度進行評定[9]。