潰瘍性結(jié)腸炎與濕熱證潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型的比較研究

李沁媚,王玉涵,呂菲菲,徐百昌,崔瑤,彭小敏,王潁,司紅彬

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,南寧 530004)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)屬于炎性腸病之一,主要病理變化為乙狀結(jié)腸和直腸黏膜及黏膜下層的炎性損傷。UC在歐洲和北美的平均患病率超過0.3%,其中挪威的發(fā)病率高達(dá)0.5%[1]。值得注意的是,亞洲國(guó)家的炎性腸病發(fā)生率和患病率較歐美地區(qū)偏低,然而90年代成為亞、非等國(guó)的炎性腸病發(fā)病率的轉(zhuǎn)折點(diǎn),尤其是韓國(guó)和中國(guó)香港等亞洲地區(qū)的發(fā)病率明顯增加[2-3]。UC已經(jīng)發(fā)展成為一種全球性疾病,因其反復(fù)發(fā)作和長(zhǎng)期治療的特性被稱為“綠色癌癥”,因此受到了越來越多的關(guān)注。

濕熱證(damp-heat syndrome,DH)是中醫(yī)常見證候,多因感受濕熱外邪、喜食肥甘厚膩、嗜酒、飲食不節(jié)等因素引起機(jī)體內(nèi)釀濕生熱、濕熱交蒸。2017年《潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)診療專家共識(shí)意見》中指出活動(dòng)期UC多屬實(shí)證,主要病機(jī)為濕熱蘊(yùn)腸[4],大腸濕熱證是UC活動(dòng)期最重要的證型[5]。盡管目前有少量關(guān)于濕熱病因所致UC的免疫標(biāo)識(shí)物的報(bào)道[6],然而濕熱因素在UC疾病發(fā)展進(jìn)程中的影響及機(jī)制尚不完全清晰。

目前國(guó)際較為認(rèn)可的造模方法是葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS),其誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型因其簡(jiǎn)單性和與人類潰瘍性結(jié)腸炎的許多相似性而被廣泛使用[7-9],前期總結(jié)了近年來中藥防治濕熱證的藥效作用及機(jī)制研究[10],為進(jìn)一步研究UC發(fā)病機(jī)制及中藥療效機(jī)理,選擇使用“DSS”和“DSS+復(fù)合因素”分別構(gòu)建普通UC大鼠模型和濕熱證UC大鼠模型,通過對(duì)比這兩種模型,試圖說明普通UC與濕熱證UC的區(qū)別與聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只7～8周齡SPF級(jí)SD大鼠,雌雄對(duì)半,體重200～220 g,由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供【SCXK(湘)2019-0014】。飼養(yǎng)于廣西植物研究所生物技術(shù)中心屏障環(huán)境動(dòng)物室【SYXK(桂)2020-0002】,飼養(yǎng)環(huán)境保持12 h的明暗循環(huán),溫度(24±2)℃,相對(duì)恒定的濕度(50%±10%)。大鼠維持飼料購(gòu)自北京科澳協(xié)力飼料有限公司,常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng),自由飲水。所有操作均遵守廣西大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和倫理委員會(huì)準(zhǔn)則(審批號(hào):2019-084)。

1.1.2 主要試劑與儀器

DSS(MP Biomedicals,Q8378),冠生園蜂蜜(上海冠生園,SC12731012000317),牛欄山二鍋頭(北京順鑫,56%vol),豬油購(gòu)自南寧大康惠超市,二甲苯(國(guó)藥集團(tuán),10023418),中性樹膠(國(guó)藥集團(tuán),10004160),HE染液(上海照華,G1005),分化液(上海照華,G1005-3),返藍(lán)液(上海照華,G1005-4),大便隱血檢測(cè)試劑盒、二胺氧化酶(DAO)、髓過氧化物酶(MPO)測(cè)試盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物公司(C027-1-1,AO88-1-1,A044-1-1,A006-2-1,A003-1-2),大鼠皮質(zhì)醇(Cortisol)、大鼠熱應(yīng)激蛋白(HSPs)、總蛋白定量測(cè)定、大鼠白細(xì)胞介素10(IL-10)、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、大鼠巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、大鼠巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β(MIP-1β)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司(MM-0574R1,MM-0686R1,MM-2002577,MM-0195R1,MM-0104R1,MM-0180R1,MM-2002577)。

高速組織研磨儀(塞維爾,KZ-II,武漢),酶標(biāo)儀(賽默飛世爾,Multiskan FC,上海),洗板機(jī)(Thermo Labsystems,AC8,芬蘭),離心機(jī)(Eppendorf AG,810R,德國(guó)),分析天平(菁海,FA1004,上海),恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療,HH-S4,金壇),正置光學(xué)顯微鏡(尼康,Nikon Eclipse E100,日本),紫外分光光度計(jì)(津島制作所,UVmini-1240,日本),恒溫生化培養(yǎng)箱(精宏,BPH-9162,上海),智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱(生元,LHS-250,鄭州),全自動(dòng)動(dòng)物生化分析儀(優(yōu)利特,URIT-8021Vet,桂林)。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模

24只SD大鼠,在1周適應(yīng)期結(jié)束后,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、UC組、UC+DH組,每組8只。實(shí)驗(yàn)周期29 d,各組造模方式(圖1)如下:

圖1 造模方式Figure 1 Modeling method

(1)空白組自由采食與飲水,飼養(yǎng)環(huán)境的溫濕度和明暗度與適應(yīng)期一致,直至試驗(yàn)期結(jié)束。

(2)UC組大鼠在實(shí)驗(yàn)周期前22 d與空白組一致,第23天起自由飲用5%DSS溶液。

(3)UC+DH組大鼠在前14 d里,自由飲用蜂蜜水,單號(hào)管飼4 mL豬油,給與充足飼料,雙號(hào)禁食不禁飲,經(jīng)受饑飽交替;第15～22天,自由飲用蜂蜜水,自由采食普通飼料,每日管飼2 mL二鍋頭,每日需進(jìn)入恒溫恒濕箱中33℃～35℃,濕度為(95±3)%6 h;第23天開始,自由飲用5%DSS溶液,自由采食高糖飼料,每日需進(jìn)入恒溫恒濕箱中33℃～35℃,濕度為(95±3)%6 h。

1.2.2 一般情況觀察

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,進(jìn)行造模。注意飲用DSS期間的體重變化,飲用DSS前1 d給大鼠稱體重,將其作為原始體重,每日早上10:00測(cè)體重,尤其記錄體重增長(zhǎng)率,觀察每日的糞便性狀、血便情況、腹瀉程度,進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)評(píng)分[11]。

1.2.3 樣本采集及處理

戊巴比妥(40 mg/kg,BW)麻醉大鼠后,用無菌EP管收集血液,室溫下靜置0.5 h后放入4℃冰箱,冷藏1 h后經(jīng)2000 r/min轉(zhuǎn)速離心取淡黃色澄清上清液,備用。采用二氧化碳窒息法處死大鼠,用手術(shù)刀剪剖開腹腔,完整取出盲結(jié)腸段,記錄結(jié)腸長(zhǎng)度,收集結(jié)腸樣品,經(jīng)液氮冷凍后,轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。

1.2.4 結(jié)腸病理組織學(xué)檢測(cè)

模型組大鼠結(jié)腸組織病變明顯處取1.5 cm環(huán)狀腸腔,其余組取該組大鼠結(jié)腸對(duì)應(yīng)位置,選材部位盡量保持一致,然后置于10%中性福爾馬林緩沖液中,24 h后進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、石蠟切片、脫蠟、蘇木素染色、伊紅染色、脫水封片、鏡檢集圖。病理生物學(xué)切片采用盲法評(píng)估,根據(jù)既往研究依據(jù)以下參數(shù)進(jìn)行評(píng)分:僅結(jié)構(gòu)改變、炎癥、固有層中性粒細(xì)胞、上皮中性粒細(xì)胞、隱窩破壞、糜爛或潰瘍。通過病理切片觀察腸道黏膜損傷程度,進(jìn)行Geboes標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)評(píng)分[12]。

1.2.5 血清生化檢測(cè)

用1000μL移液槍從上述血清,抽取400μL放入生化檢測(cè)杯中,將血清樣品放入全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清中的甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、血糖(GLU)、膽固醇(CHOL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)含量。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)皮質(zhì)醇和熱應(yīng)激蛋白的表達(dá)

根據(jù)酶免試劑盒說明書檢測(cè)血清中的皮質(zhì)醇和結(jié)腸HSPs的含量。

1.2.7 血清DAO含量的測(cè)定

采用南京建成試劑盒說明書方法,檢測(cè)血清中的DAO含量。

1.2.8 結(jié)腸MPO、MDA、GSH的測(cè)定

4℃冷藏的0.86%生理鹽水與結(jié)腸組織按9∶1比例混合,經(jīng)研磨儀研磨后,低溫離心機(jī)轉(zhuǎn)速2000 r/min,在離心15 min后取勻漿上清,制備成不同濃度的結(jié)腸上清液,采用南京建成試劑盒說明書方法,檢測(cè)結(jié)腸中MPO、MDA、GSH含量。

1.2.9 ELISA法檢測(cè)結(jié)腸細(xì)胞因子變化

稱取1 g結(jié)腸組織,加入9 mL的pH=7.2～7.4的PBS,用研磨儀將標(biāo)本勻漿充分。離心20 min左右(2000～3000 r/min),仔細(xì)收集上清。根據(jù)組織總蛋白定量測(cè)定試劑盒說明書提取蛋白樣品,采用BCA法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量,按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)大鼠IL-10、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0和Graph Pad Prism 8軟件處理,數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布,方差齊性的情況下,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行兩兩比較,假定方差齊性使用LSD法分析,假定方差不齊使用Dunnett’s T3法分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,以P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

造模前,所有大鼠精神良好、毛色整潔光亮、飲食量飲水量俱佳、糞便干燥、無腹瀉及肉眼血便情況,取新鮮糞便經(jīng)南京建成大便隱血檢測(cè)試劑盒檢測(cè)均呈陰性,無隱血便可能。造模開始后,前22 d,正常環(huán)境下的大鼠,食欲良好,體重持續(xù)增加,濕熱環(huán)境下的大鼠食欲由起初良好轉(zhuǎn)為不佳,體重持續(xù)增長(zhǎng),但體重增長(zhǎng)幅度由大轉(zhuǎn)小。第23～30天,UC組與UC+DH組開始飲用5%DSS,飲用DSS初期,體重均有所增長(zhǎng)(圖2A),隨著DSS刺激機(jī)體腸道產(chǎn)生炎癥,糞便性狀改變,出現(xiàn)腹瀉血便等癥狀。與空白對(duì)照組相比,兩類模型組大鼠體重增長(zhǎng)幅度呈現(xiàn)不同程度的改變甚至下降,DAI指數(shù)顯著升高;與UC組相比,UC+DH組的體重降低程度更為嚴(yán)重,DAI指數(shù)進(jìn)一步顯著升高(圖2B)。

2.2 結(jié)腸長(zhǎng)度

與空白對(duì)照組比較,兩組模型大鼠結(jié)腸的長(zhǎng)度顯著縮短,具有顯著性差異(P<0.05)(見圖3A);與UC組比較,UC+DH組結(jié)腸的長(zhǎng)度顯著性縮短(見圖3B)。

圖3 各組結(jié)腸長(zhǎng)度變化Note.A.Length of the colon shown here has been removed from the anus.B.Compared with control group,***P<0.001.Compared with UCgroup,###P<0.001.Figure 3 Changes in colonic length in each group

2.3 結(jié)腸組織病理學(xué)改變

正常大鼠結(jié)腸黏膜由柱狀上皮、黏膜下層、黏膜肌層及外膜組成,如圖4A所示,空白對(duì)照組大鼠結(jié)腸形態(tài)完整,腸腺排列規(guī)則,固有層內(nèi)杯狀細(xì)胞豐富,黏膜下層未見充血水腫、潰瘍,未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與DAI評(píng)分和臨床癥狀發(fā)現(xiàn)一致,DSS引起明顯的炎癥并破壞了結(jié)腸隱窩結(jié)構(gòu),UC組大鼠出現(xiàn)的結(jié)腸腸腺大面積消失,腺體變形,杯狀細(xì)胞丟失,黏液減少,炎細(xì)胞浸潤(rùn),造成嚴(yán)重的腸上皮損傷。與UC大鼠相比,UC+DH組大鼠結(jié)腸的腸腺幾乎消失殆盡,腸上皮空泡隨處可見,由此可知濕熱環(huán)境與DSS能夠協(xié)同加劇腸上皮結(jié)構(gòu)的破壞。UC組與UC+DH組大鼠的Geboes指數(shù)顯著高于空白組大鼠(P<0.001),說明單純飲用DSS溶液與濕熱環(huán)境下飲用DSS溶液造成了大鼠結(jié)腸黏膜的嚴(yán)重?fù)p傷。與UC大鼠相比,UC+DH組大鼠的Geboes指數(shù)顯著增加(P<0.05)(圖4B)。

圖4 各組結(jié)腸黏膜病理變化及評(píng)分Note.Compared with control group,***P<0.001.Compared with UC group,#P<0.05.Figure 4 Pathological changes and Geboes score of colonic mucosa in each group

2.4 血脂水平的變化

與空白組相比,UC組大鼠血清中的TG、CHOL、HDL_C、LDL_C、GLU濃度無顯著性差異(P>0.05)。與空白組和UC大鼠相比,UC+DH組大鼠TG、CHOL、LDL_C顯著增加(P<0.001),GLU含量有所增加(P<0.05),HDL_C含量顯著降低(P<0.001)(圖5)。

圖5 血脂水平變化結(jié)果Note.Compared with control group,**P<0.01,***P<0.001.Compared with UC group,#P<0.05,###P<0.001.Figure 5 Changes in lipid levels in each group

2.5 肝功能的變化

與空白組相比,UC組大鼠的ALP、LDH、ALT、AST顯著增加(P<0.05),UC+DH組ALP、LDH、ALT、AST濃度顯著提升(P<0.05)。與UC組大鼠相比,UC+DH組的ALP、ALT、AST含量進(jìn)一步顯著升高(P<0.01)(見圖6)。

圖6 肝功能變化結(jié)果Note.Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.Compared with UCgroup,###P<0.001.(The same in the following figures)Figure 6 Results of liver function changes

2.6 皮質(zhì)醇、熱應(yīng)激蛋白和DAO的變化

與空白組相比,UC組和UC+DH組大鼠血清中的皮質(zhì)醇含量顯著增加(P<0.001),說明DSS能顯著增加大鼠血清中皮質(zhì)醇含量。其中,與UC組大鼠相比,UC+DH組的皮質(zhì)醇含量進(jìn)一步增加(P<0.001)(圖7A),說明濕熱證能進(jìn)一步增加血清皮質(zhì)醇含量。

與空白組相比,UC組大鼠結(jié)腸中的HSPs含量無顯著性差異(P>0.05),說明DSS對(duì)HSPs的表達(dá)沒有明顯的影響。與空白組和UC組大鼠相比,UC+DH組大鼠結(jié)腸中的HSPs含量顯著增加(P<0.001)(圖7B),說明濕熱因素能顯著增加大鼠血清中皮質(zhì)醇含量。

與空白組相比,UC組和UC+DH組大鼠血清中的DAO含量顯著增加(P<0.001),說明DSS能顯著增加大鼠血清中DAO含量。其中,與UC組大鼠相比,UC+DH組的DAO含量進(jìn)一步增加(P<0.001)(圖7C),說明濕熱因素能協(xié)同DSS進(jìn)一步增加血清DAO含量。

圖7 大鼠血清皮質(zhì)醇、DAO濃度和結(jié)腸熱應(yīng)激蛋白表達(dá)情況Figure 7 Serum cortisol and diamine oxidase concentrations and colonic heat stress protein expression in rats

2.7 結(jié)腸氧化應(yīng)激反應(yīng)及抗氧化能力結(jié)果

經(jīng)DSS誘導(dǎo)后,與空白組相比,UC組和UC+DH組大鼠的MPO、MDA含量顯著升高(P<0.001),結(jié)腸中的GSH含量顯著降低(P<0.001),說明DSS能導(dǎo)致機(jī)體的脂質(zhì)過氧化,降低大鼠抗氧化能力;與UC組大鼠相比,UC+DH組的MPO、MDA含量進(jìn)一步增加(P<0.001)(圖8A、B),結(jié)腸中的GSH含量進(jìn)一步降低(P<0.01)(圖8C),說明濕熱因素能協(xié)同DSS過度激活氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制機(jī)體抗氧化能力。

圖8 各組大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)及抗氧化能力Figure 8 Oxidative stress reaction and antioxidant capacity of rats in each group

2.8 結(jié)腸炎癥細(xì)胞因子的水平

與空白組相比,UC組和UC+DH組大鼠的TNF-α、MIP-1α、MIP-1β 表 達(dá) 顯 著 升 高(P<0.001),結(jié)腸中的IL-10含量顯著降低(P<0.001),說明DSS具有促炎作用;與UC組大鼠相比,UC+DH組的TNF-α、MIP-1α、MIP-1β濃度進(jìn)一步增加(P<0.01)(圖9A、B、C),結(jié)腸中的IL-10含量進(jìn)一步降低(P<0.001)(圖9D),說明濕熱因素能協(xié)同DSS加重腸道炎癥程度。

圖9 大鼠細(xì)胞因子的表達(dá)情況Figure 9 Expression of cytokines in rats

3 討論

中醫(yī)將潰瘍性結(jié)腸炎歸屬于“痢疾”“久痢”和“腸澼”等病范疇[4,13]。UC表現(xiàn)為血性腹瀉、腹痛、黏液性膿便、里急后重、體重減輕等,這些癥狀可導(dǎo)致患者身體狀況和心理的衰弱,并加重全球經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[14]。伴隨UC確診而來的是患結(jié)直腸癌及手術(shù)切除、術(shù)后并發(fā)癥和UC腸外并發(fā)癥(肝膽疾病、骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎、皮膚病等)的風(fēng)險(xiǎn),數(shù)據(jù)表明,DSS與DSS協(xié)同濕熱因素可引起不同程度的肝功能損傷和腸黏膜損傷,其中DSS協(xié)同濕熱因素給機(jī)體造成的損傷尤為嚴(yán)重。

DAO是一種催化二胺氧化的細(xì)胞內(nèi)酶,位于腸黏膜上層絨毛膜上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中,與腸黏膜內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)。DAO大部分來源于腸黏膜,正常狀態(tài)下血清中的含量極少,當(dāng)腸上皮細(xì)胞破損時(shí),腸黏膜中的DAO經(jīng)受損部位入血,因此血清DAO水平可作為腸黏膜損傷的理想指標(biāo),可作為IBD的主要診斷指標(biāo)[15-16]。本研究中兩種模型大鼠的血清DAO含量升高的結(jié)果也支持了這一理論。熱應(yīng)激引起肉雞腸道屏障功能紊亂并提高腸道通透性,導(dǎo)致血清DAO水平升高[17]。在本研究中,濕熱證UC大鼠的血清DAO遠(yuǎn)高于UC大鼠的水平,可能與濕熱證UC大鼠受到的濕熱刺激有關(guān),說明濕熱應(yīng)激和UC在促炎和損傷腸屏障方面可能具有協(xié)同作用,具體機(jī)制需要進(jìn)一步的研究證明。

在本研究中,發(fā)現(xiàn)UC模型大鼠與濕熱證UC模型大鼠最明顯的區(qū)別在于血脂和熱應(yīng)激蛋白的表達(dá)水平差異。通過復(fù)合因素“高脂高糖飲食+飲酒+饑飽交替+高溫高濕環(huán)境+5%DSS”構(gòu)建的濕熱證UC大鼠表現(xiàn)出高脂血癥和熱應(yīng)激反應(yīng)。與前人報(bào)道一致[18],本研究中濕熱證UC大鼠血清中的TG、CHOL、LDL_C、GLU水平顯著高于普通環(huán)境下的UC大鼠(P<0.05),且血清中的HDL_C低于普通環(huán)境飼養(yǎng)的UC大鼠(P<0.05),說明實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)的高脂高糖酗酒的飲食習(xí)慣配合高溫高濕的生活環(huán)境,能成功打造高血脂癥狀的大鼠,高脂血癥可能是濕熱證潛在的生物基礎(chǔ)之一。熱休克蛋白(HSPs)的誘導(dǎo)被稱為熱休克反應(yīng)(HSR)。HSR在細(xì)胞防御系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用,在該系統(tǒng)中,HSP充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)伴侶,覺察到氧化損傷并修復(fù)未折疊或折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì),保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激誘導(dǎo)的傷害,有助于提高預(yù)處理刺激后產(chǎn)生的細(xì)胞存活率[19]。HSPs是細(xì)胞內(nèi)高度保守的蛋白,在應(yīng)激條件下可以存在于細(xì)胞外液中。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也表明濕熱應(yīng)激能增加大鼠結(jié)腸組織中的HSPs表達(dá)。HSP參與了多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑,包括氧化應(yīng)激途徑[20]。Dangi等[21]認(rèn)為HSPs的高峰表達(dá)是山羊長(zhǎng)期熱應(yīng)激期間的一種適應(yīng)機(jī)制,抗氧化劑可能會(huì)通過降低氧化應(yīng)激而減弱HSPs表達(dá)。因此檢測(cè)了結(jié)腸中的MPO、MDA、GSH濃度的變化。

既往研究表明,腸道黏膜損傷的關(guān)鍵因素之一是氧化-抗氧化失衡[22]。氧化應(yīng)激反應(yīng)過度激活可以抑制抗氧化酶,促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞中活性氧增多,活性氧本身具有細(xì)胞毒性,引起蛋白質(zhì)變性和酶激素失活。同時(shí)活性氧可使不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),造成生物膜損傷。MPO是一種存在中性粒細(xì)胞中的酶,活性大小與炎癥區(qū)域中的中性粒細(xì)胞濃度成正比,MPO活性增加是嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥的指標(biāo)[23]。因此,MPO活性的測(cè)量被認(rèn)為是急性腸道炎癥的定量和靈敏測(cè)定法。MDA可以通過蛋白質(zhì)變性交聯(lián)作用影響膜蛋白,使其無法用作受體或酶,它是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物[24-25],本研究中MPO、MDA活性的增加與結(jié)腸腸上皮層的大量喪失、漿膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、黏膜下層水腫、出血、壞死性潰瘍的出現(xiàn)有關(guān)。ROS的清除主要依靠體內(nèi)的抗氧化酶完成,數(shù)據(jù)表明濕熱因素協(xié)同DSS共同抑制了結(jié)腸組織中的GSH活性,導(dǎo)致過量的ROS堆積,生物氧化失衡,從而加重濕熱證UC的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

目前普遍認(rèn)為,UC機(jī)體存在腸黏膜炎癥免疫耐受紊亂,腸黏膜免疫反應(yīng)異常激活是UC發(fā)生、發(fā)展的重要因素。1988年Wolpe等[26]采用脂多糖刺激小鼠后,從小鼠巨噬細(xì)胞中分化得到炎性蛋白MIP-1。這種趨化性細(xì)胞因子在內(nèi)毒素血癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)中具有廣泛的生物學(xué)活性,能觸發(fā)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過氧化氫,協(xié)同其他活性氧,過度激活氧化應(yīng)激反應(yīng);同時(shí)MIP-1α可特異性地趨化單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞增殖并向炎癥部位遷移,誘導(dǎo)其釋放TNF-α、IL-6、IL-1等炎癥因子[27],具有潛在的促炎作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重發(fā)炎的腸粘膜中,表達(dá)MIP-1α和MIP-1β的細(xì)胞頻率明顯高于對(duì)照組[28]。在IBD中,抗原呈遞給抗原呈遞細(xì)胞(APC)以及APC與T輔助細(xì)胞的相互作用導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的活化?；罨木奘杉?xì)胞產(chǎn)生廣泛活性的炎性細(xì)胞因子的混合物,包括TNFα、IL-1β,它們通過NF-kB途徑進(jìn)一步增強(qiáng)炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致各種白介素以及細(xì)胞因子和趨化因子的上調(diào)[29-30]。在本研究中,推測(cè)DSS協(xié)同濕熱因素通過TNF-α將循環(huán)血中炎癥細(xì)胞募集至局部組織,誘導(dǎo)腸黏膜循環(huán)障礙,與MIP-1α和MIP-1β協(xié)同放大炎癥效應(yīng),破壞腸上皮固有層,誘導(dǎo)腸黏膜局部潰瘍,可導(dǎo)致UC的發(fā)生。

腸道中IL-10的主要來源是調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞,IL-10可控制腸道中微生物和食物抗原的慢性刺激并保持免疫系統(tǒng)平衡[31]。因此被認(rèn)為是人類最重要的抗炎細(xì)胞因子之一,IL-10可以限制促炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12的分泌,防止對(duì)腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)重要的Th1/Th17致病反應(yīng)[32-33]。近日的一項(xiàng)研究表明,IBD中的抗TNF治療通過巨噬細(xì)胞IL-10信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮治療作用[34]。反之,IL-10或其信號(hào)通路中降低或消除其抗炎特性的突變被認(rèn)為參與了高炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制,如炎癥性腸病[35]。本研究中發(fā)現(xiàn)兩種環(huán)境下的UC大鼠結(jié)腸中的IL-10活性下降,與前述研究一致。Kühn等[36]在1993年開發(fā)IL-10缺陷(IL-10-/-)小鼠模型,顯示出與人IBD相似的組織學(xué)、生理學(xué)和生化特征。在IL-10-/-的情況下,幼稚T細(xì)胞分化為Th1或Th17以及增加引起自發(fā)性結(jié)腸炎的炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[37],另一項(xiàng)研究評(píng)估了IL-10-/-BALBC小鼠12周齡時(shí)自發(fā)性結(jié)腸炎的預(yù)期發(fā)生率約為69%[38]。上述研究提供了可能的推理,濕熱環(huán)境協(xié)同DSS干預(yù)IL-10的信號(hào)傳導(dǎo),加重腸道炎癥。

綜上所述,UC與濕熱UC模型既有區(qū)別又存在聯(lián)系,區(qū)別在于僅濕熱證UC模型存在高脂血癥與熱應(yīng)激反應(yīng);聯(lián)系在于濕熱證UC模型的臟器損傷(肝、腸)嚴(yán)重程度高于UC模型,尤其是腸黏膜損傷。濕熱能加重UC的腸黏膜損傷,可能與濕熱促炎、促進(jìn)脂質(zhì)過氧化、抑制抗氧化、提高腸黏膜滲透性有關(guān)。相比經(jīng)DSS誘導(dǎo)的普通UC大鼠模型,本研究通過復(fù)合因素構(gòu)建的濕熱證UC模型更切合嶺南地區(qū)濕熱證UC患者實(shí)際,一定程度上為濕熱體質(zhì)人群的UC辨證與防治提供參考。