Cox A16型手足口病BALB/c乳鼠模型的建立

徐英莉,郭姍姍,耿子涵,龐博,周利潤,王雅欣,崔曉蘭,時(shí)宇靜

(中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所,北京 100700)

柯薩奇病毒A16型是引起手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要病原體之一[1]。COXA16型手足口病感染可以引發(fā)手、足、口腔皰疹,少數(shù)重癥患者可以引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)病變,甚至死亡[2]。目前尚無有效的疫苗和特效藥物,構(gòu)建具有典型臨床癥狀的動(dòng)物模型是藥效及疫苗評(píng)價(jià)方法的重要環(huán)節(jié)之一。

目前已建立較為完備的EV71感染動(dòng)物模型,包括BALB/c[3]、ICR[4]乳鼠模型、恒河猴模型等[5],而COX A16感染動(dòng)物模型仍需完善。目前已建立通過顱內(nèi)注射COX A16感染1日齡BALB/c模型[6]、1日齡ICR乳鼠模型[7]以及樹鼩模型、獼猴模型等。而已建立的BALB/c乳鼠模型,尚未進(jìn)行深入的免疫、病理學(xué)研究。

本實(shí)驗(yàn)借鑒本組EV71型手足口病3日齡BALB/c乳鼠模型[8-9],經(jīng)腹腔注射建立COXA16型手足口病3日齡BALB/c乳鼠模型,并進(jìn)行臨床癥狀、體重變化觀測,組織病毒載量、趨化因子含量、組織病理病變等指標(biāo)檢測,建立了較完整的COXA16型3日齡BALB/c乳鼠模型,為藥物評(píng)價(jià)及疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

遺傳背景清楚,3日齡,SPF級(jí),BALB/c乳鼠65只(整窩鼠,每窩5只),購于維通利華生物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2016-0006】。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所ABSL-2實(shí)驗(yàn)室IVC飼養(yǎng)系統(tǒng)【SYXK(京)2019-0003】。晝夜各半循環(huán)照明,濕度50%,溫度控制在22～25℃,飼喂普通維持飼料。所有操作符合中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動(dòng)物福利倫理委員會(huì)要求(審批號(hào):2020D030)。

1.1.2 細(xì)胞

非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero),購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院(編號(hào):BNCC337868)。腸道病毒Cox A16株購于清華大學(xué)生命科學(xué)院,經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)傳代、保存。

1.1.3 主要試劑與儀器

柯薩奇病毒16型(CA16)核酸測定試劑盒(QR-0439-02,Liferiver);核酸提取試劑盒(Z-ME-0010,Liferiver);BD Cytometric Bead Array(CBA)Mouse/Rat Soluble Protein Master Buffer Kit(558266,BD)、Mouse G-CSF Flex Set(560152,BD)、Mouse MCP-1 Flex Set(558342,BD)、Mouse MIP-1αFlex Set(558449,BD)。DMEM(26418007,Gibco);胎牛血清(35081003,Gibco);PBS(26318001,Gibco);胰酶(06519005,Gibco);生物安全柜(批號(hào):A2型MSC1.2,Thermo Scientific);倒置顯微鏡(OLMPUS CKX41,OLMPUS);CO2培養(yǎng)箱(Thermo-371,Thermo Scientific);流式細(xì)胞儀(BD FACSCelesta,美國BD);PCR儀(QuantStudio 5)。

1.2 方法

1.2.1 病毒毒力測定

將Vero細(xì)胞接種于96孔板,每孔100μL,1×104個(gè)細(xì)胞/孔。在長至單層的Vero細(xì)胞的培養(yǎng)板中,分別加入用培養(yǎng)液做10-1～10-8連續(xù)10倍稀釋的CoxA16株病毒,每孔100μL,設(shè)4個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,每日于倒置顯微鏡下觀察。按照Reed-Muench法計(jì)算50%細(xì)胞毒性濃度(TCID50)。細(xì)胞的病變判斷依據(jù)為:(-)為細(xì)胞生長正常,無病變;(±)為細(xì)胞病變少于整個(gè)單層細(xì)胞的10%;(+)為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的25%以下;(++)為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的50%以下;(+++)為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75%以下;(++++)為細(xì)胞病變約占整個(gè)單層細(xì)胞的75%以上。

3日齡,SPF級(jí)BALB/c乳鼠,經(jīng)腹腔注射100、10-1、10-2、10-3倍比稀釋的Cox A16株病毒,每只100μL,同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組。記錄各組死亡情況及感染程度打分,共觀察14 d。感染程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表1[7]:

表1 癥狀打分表Table 1 Clinical score table

1.2.2 動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)

3日齡,SPF級(jí),BALB/c乳鼠每組10只,腹腔注射3 LD50Cox A16株病毒100μL,于感染后第6天,分別取血清、后肢肌肉、腦組織、心臟組織、腸組織。

1.2.3 CBA法測血清中趨化因子含量

按照BD Cytometric Bead Array(CBA)Mouse/Rat Soluble Protein Master Buffer Kit及Mouse MCP-1 Flex Set、Mouse MIP-1βFlex Set、Mouse G-CSF Flex Set說明書進(jìn)行血清中MIP-1β、MIP-1α、G-CSF濃度測定。將標(biāo)準(zhǔn)品(2500 pg/mL)進(jìn)行2倍梯度稀釋(共9個(gè)稀釋度),同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照;向裝有50μL標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品的EP管中加入50μL捕獲珠混懸液,輕輕吹打混勻,室溫避光孵育1 h。加入配置的檢測抗體,輕輕吹打混勻,室溫避光孵育1 h。每個(gè)EP管中加入1 mL洗滌緩沖液,200 g室溫離心5 min,棄去上清。用300μL洗滌緩沖液重懸,充分混勻后上機(jī)檢測。采用BD FACSDiva 8.0.1.1分析各樣品中趨化因子含量。

1.2.4 后肢肌肉病毒載量測定

精稱每只后肢肌肉組織、心臟、腦、腸20 mg,加入1000μL生理鹽水,于冰上研磨為勻漿。按照Liferiver核酸提取試劑說明書的方法,提取RNA。進(jìn)一步采用柯薩奇病毒16型(A16)核酸測定試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為50℃×30 min;95℃×10 min;95℃×15 s→55℃×40 s,循環(huán)45次;單點(diǎn)熒光檢測55℃,反應(yīng)體系15μL。使用Sequence Detection System軟件分析PCR過程各檢測樣本的Ct(Threshold of cycle)值,采用ΔΔCt法計(jì)算病毒的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 病理檢測

后肢肌肉組織、腦組織使用5%多聚甲醛固定,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟包埋,切片,HE染色,中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理檢查。

后肢肌肉組織鏡下判斷標(biāo)準(zhǔn):“-”:肌肉組織未見有肌組織斷裂、萎縮,間質(zhì)未見有炎癥細(xì)胞浸潤,組織未見有水腫等變化?！?”:肌肉組織未見有明顯斷裂、萎縮,間質(zhì)未見水腫,未見有明顯炎癥細(xì)胞滲出,組織細(xì)胞有成群聚集,不明顯。

“++”:肌肉組織有不同程度斷裂,肌組織有腫脹,間質(zhì)有炎癥細(xì)胞滲出,并有少量瘀血?！?++”:肌肉組織有明顯斷裂、萎縮,肌間質(zhì)有大量炎癥細(xì)胞滲出,水腫明顯,小血管有瘀血;肌肉間質(zhì)有大量細(xì)胞聚集,無規(guī)律。“++++”:肌肉組織大面積斷裂、水腫,間質(zhì)炎癥。病理學(xué)檢查鏡下判斷標(biāo)準(zhǔn):“-”:乳鼠腦組織未見有瘀血,細(xì)胞未見增生?！?”:乳鼠腦組織腦膜有輕度瘀血,局部性。“++”:乳鼠腦組織局部有瘀血,細(xì)胞增生?！?++”:乳鼠腦組織有大片狀腦膜缺損,組織脫落,并有局部腦膜瘀血?！?+++”:乳鼠腦組織大面積組織細(xì)胞軟化,腦膜損傷、瘀血。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0進(jìn)行分析,計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),正態(tài)分布等方差資料采用LSD檢驗(yàn),若方差不齊時(shí)采用Kruskal-Wallis test檢驗(yàn)。等級(jí)資料采用Mann-Whitney檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 Cox A16毒力測定

分別用Vero細(xì)胞及3日齡BALB/c乳鼠測定其毒力,經(jīng)Reed-Muench法計(jì)算,TCID50=10-4.5。如圖1A所示,3日齡BALB/c乳鼠病毒注射劑量與臨床癥狀打分正相關(guān)。用病毒原液攻毒,第4天動(dòng)物全部后肢癱瘓、死亡。用1×10-1稀釋度病毒量攻毒,第3天開始出現(xiàn)臨床癥狀,第11天完全死亡。隨病毒量減少,1×10-2、1×10-3稀釋度動(dòng)物臨床評(píng)分降低(見圖1B)。經(jīng)Reed-Muench法計(jì)算COXA16對(duì)3日齡BALB/c乳鼠模型毒力為每毫升56 LD50。

圖1 3日齡BALB/c乳鼠感染COX A16生存率及臨床癥狀打分Figure 1 Survival rate and clinical score of 3 days old BALB/c sulking mice infected COX A16

2.2 乳鼠生存曲線、臨床得分及體重變化

3日齡BALB/c乳鼠模型經(jīng)腹腔注射3 LD50CoxA16株后,11 d內(nèi)模型組死亡率為100%(見圖2 A),其感染程度積分(見圖2B)、死亡率、生存天數(shù)與正常對(duì)照組比較均具有顯著性差異(P<0.01)。模型組感染6 d后,出現(xiàn)后肢癱瘓,精神萎靡,體重持續(xù)減輕(見圖2C),甚至死亡(見圖2D)。

圖2 CoxA16型手足口病模型的構(gòu)建Note.A.Survival rate.B.Clinical score.C.Weight.D.Typical effected symptom of sulking mice:hind limb paralysis.Figure 2 Establishment of HFMD model infected CoxA 16 in mouse

2.3 趨化因子的檢測

對(duì)感染6 d后CoxA16株3日齡BALB/c乳鼠血清中趨化因子采用CBA法進(jìn)行檢測,模型組乳鼠MCP-1、G-CSF含量均顯著性升高(P<0.01)(見圖3)。

圖3 CoxA16株感染BALB/c乳鼠趨化因子含量Figure 3 Chemokine content of mice infected with Cox A16

2.4 病毒載量

對(duì)3日齡BALB/c乳鼠感染CoxA16株5 d后,乳鼠后肢肌肉組織、心臟、腦、腸進(jìn)行RT-PCR病毒載量測定,病毒載量均顯著升高(P<0.01),表明CoxA16株感染BALB/c乳鼠,并在其體內(nèi)進(jìn)行了有效的復(fù)制和增殖,其中后肢肌肉病毒載量最高,心臟次之(見圖4)。

圖4 CoxA16株感染BALB/c乳鼠組織病毒載量Figure 4 Viral loads in tissue of BALB/c sulking mice

2.5 病理檢測

對(duì)感染6 d后CoxA16株3日齡BALB/c乳鼠后肢肌肉組織、腦組織進(jìn)行HE染色。正常對(duì)照組乳鼠肌肉組織結(jié)構(gòu)正常,病變?cè)u(píng)分為0.00。模型對(duì)照組乳鼠肌肉組織有大面積萎縮、斷裂,間質(zhì)腫脹,炎癥細(xì)胞滲出,大量細(xì)胞聚集,間質(zhì)并有瘀血等病理變化,組織病變?cè)u(píng)分為3.20,病變程度明顯(P<0.01)。

正常對(duì)照組乳鼠腦組織、腦膜結(jié)構(gòu)正常,病變?cè)u(píng)分為0.00。模型對(duì)照組乳鼠腦組織、腦膜有局限性缺損,組織脫落,細(xì)胞局限性增生,局部有瘀血。乳鼠腦組織間質(zhì)有大面積神經(jīng)細(xì)胞軟化區(qū),各級(jí)神經(jīng)細(xì)胞有不同程度的萎縮,腦組織并有局限性缺損,組織病變?cè)u(píng)分為2.70,病變具有顯著性差異(P<0.01)(見表2,圖5)。

表2 CoxA16株感染BALB/c乳鼠后肢肌肉組織、腦組織病理分級(jí)Table 2 Pathological grade of hindlimb muscle and brain of BALB/c sulking mice infected with Cox A16

圖5 后肢肌肉組織、腦組織病理變化Figure 5 Pathological changes of hindlimb muscle and brain

3 討論

柯薩奇A16病毒是手足口病的主要致病病原,其感染也可引起嚴(yán)重心肌炎、急性心力衰竭,甚至死亡。然而其致病機(jī)制研究有限,疫苗及特效藥亟待研發(fā),合適的動(dòng)物模型是藥物評(píng)價(jià)、疫苗研發(fā)及機(jī)制研究必要基礎(chǔ)。BALB/c乳鼠對(duì)腸道病毒敏感,已有較多EV71感染模型研究,且BALB/c乳鼠的生長周期較短、遺傳背景明確、倫理問題少,便于操作。

目前,3日齡Cox A16 BALB/c模型免疫學(xué)及致病性研究國內(nèi)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)腹腔感染建立了Cox A16株感染3日齡BALB/c乳鼠模型。本模型可以引發(fā)乳鼠后肢麻痹、癱瘓,體重降低,死亡。引發(fā)后肢肌肉組織壞死性肌炎,產(chǎn)生大面積萎縮、斷裂,間質(zhì)腫脹,后肢肌肉及腦組織病變顯著,該動(dòng)物模型與Cox A16型手足口病臨床表現(xiàn)基本一致。與任慶杰等[10]11日齡C57BL/6J乳鼠模型僅為腦組織輕微淋巴細(xì)胞浸潤的病理表現(xiàn)相比,本實(shí)驗(yàn)3日齡BALB/c乳鼠腦組織病變較為嚴(yán)重。腦膜有局限性缺損,局部有瘀血;間質(zhì)有大面積神經(jīng)細(xì)胞軟化區(qū),各級(jí)神經(jīng)細(xì)胞有不同程度的萎縮,與重癥HFMD患兒伴有中樞神經(jīng)損害的臨床表現(xiàn)具有一致性[11]。乳鼠感染Cox A16株6 d后,RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明Cox A16各組織病毒載量與正常對(duì)照組比較均有顯著性升高,病毒具有廣泛的組織嗜性,其中后肢肌肉組織、心肌組織較高,病毒入侵后肢肌肉組織及心肌組織并造成損傷。臨床HFMD患兒出現(xiàn)心率失常,心肌酶譜異常,與臨床患兒癥狀一致[12-13]。在乳鼠模型建立中,在操作前應(yīng)注意用醫(yī)用酒精噴灑手套,操作后需用醫(yī)用酒精輕輕擦拭乳鼠,避免母鼠咬傷乳鼠。

Cox A16感染后6 d后,模型組乳鼠血清中MCP-1、G-CSF與正常對(duì)照組相比均顯著性提高(P<0.01)。中性粒細(xì)胞在手足口病致病過程、炎癥形成中發(fā)揮主導(dǎo)作用,大量趨化因子進(jìn)入局部組織,引發(fā)炎癥效應(yīng),形成炎癥風(fēng)暴的級(jí)聯(lián)點(diǎn)[10]。GCSF是調(diào)動(dòng)中性粒細(xì)胞的重要因子,與手足口病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[14],MIP-1α為趨化因子CC家族成員,可以趨化中性粒細(xì)胞,激發(fā)炎癥因子釋放,加重炎癥反應(yīng),可在炎癥早期作為藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[15]。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功建立了Cox A16型3日齡BALB/c乳鼠模型,進(jìn)行了免疫、病理、病毒學(xué)研究,完善了Cox A16現(xiàn)有的動(dòng)物模型,為藥物評(píng)價(jià)及篩選奠定基礎(chǔ)。