一株茶渣分解菌Fb的分離及其應(yīng)用

繆伏榮，陳鑫珠，李忠榮，劉 景

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】茶渣是茶飲料、速溶茶和茶單寧產(chǎn)業(yè)等加工茶葉后產(chǎn)生的殘?jiān)?，?jù)統(tǒng)計(jì)，僅茶飲料和速溶茶公司每年產(chǎn)生的茶渣就達(dá)16萬t[1]。研究表明，干基的茶渣粗蛋白質(zhì)含量為17%～25%，是一種良好的蛋白質(zhì)飼料資源[2－4]。日本的佐野滿昭[5]在飼料中添加3%的茶渣喂養(yǎng)肉雞，可提高雞肉的嫩度和脂溶性抗氧化物（VE、VC）含量，降低雞肉脂質(zhì)過氧化物含量。徐瑞等[6]研究表明，在日糧中添加2%的茶葉渣能提高育肥豬的生長性能，改善豬肉的色澤和保水性能。吳慧敏[7]研究發(fā)現(xiàn)在蛋雞的日糧中添加1%～2%的茶渣不僅顯著增加產(chǎn)蛋數(shù)和蛋重觀察蛋雞的生產(chǎn)性能，還能顯著提高血清中的GSH-Px，T-SOD，IgA，IgM含量，同時顯著的降低血清中的膽固醇含量。馬幫軍[8]研究表明，豬日糧中添加茶粉1%～3%會降低豬的平均日增重，但顯著降低豬背膘厚度，減少脂肪在豬胴體中的沉積。潘發(fā)明[9]等則認(rèn)為飼糧中添加茶渣比例過高，會影響適口性，降低綿羊采食量。主要原因是茶渣粗纖維含量高，畜禽纖維素酶活力低，不利于消化吸收；另一原因，剛出產(chǎn)的茶渣水分達(dá)到80%不易儲藏和運(yùn)輸，因此僅有小部分的茶渣作為飼料源利用，絕大部分茶渣被丟棄或掩埋；這不僅造成資源浪費(fèi)，而且造成生態(tài)環(huán)境污染[10－11]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】為了更好利用茶渣資源，劉姝等[12]利用木霉等組合微生物發(fā)酵茶渣，在30 ℃下發(fā)酵4～8 d后發(fā)現(xiàn)，飼料中粗蛋白測定含量＞25%，比對照提高了20%，其營養(yǎng)價值達(dá)到了仔豬配合飼料中粗蛋白的含量。胡桂萍等[13]以提取茶多酚后的茶渣為發(fā)酵原料，利用乳桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和米曲霉菌進(jìn)行常溫（25～35 ℃）的厭氧固態(tài)發(fā)酵5～7 d，測定發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)品中粗蛋白含量達(dá)29.49%。倪星虹[14]以混合菌種經(jīng)溫度28 ℃發(fā)酵7 d后，測定發(fā)現(xiàn)茶渣發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量提高了60.78%。朱飛等[1]利用黑曲霉在添加5%玉米粉的茶渣中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，經(jīng)自然pH、37 ℃、8 d條件下發(fā)酵后，茶渣的營養(yǎng)價值顯著提高。貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）是2005年由Ruiz-Garcia等[15]新命名的一種生防菌，是芽孢桿菌屬的一個新種[16－19]。國內(nèi)外已有學(xué)者研究表明Bacillus veiezensis能產(chǎn)生具有廣譜抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物，包括纖維素酶、蛋白酶以及多種抗菌的活性物質(zhì)，是用來增加作物產(chǎn)量、維護(hù)生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的首選生物藥劑[20－26]。貝萊斯芽孢桿也作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生菌[27]。 Liu X Y等[28]對從海洋微生物中篩選到菌株Bacillus velezensis H3的發(fā)酵培養(yǎng)基和拮抗物質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該菌株的活性物質(zhì)是一種替代性的表面活性素，有較高的研究價值。【本研究切入點(diǎn)】茶渣經(jīng)發(fā)酵后雖然能在一定程度上提高茶渣的營養(yǎng)價值，但發(fā)酵溫度均不超過37 ℃，發(fā)酵效率低，時間長，易被雜菌污染。因此有必要篩選能適合高效分解茶渣的高溫菌株。但鮮見貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）在降解工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究從堆積廢棄茶渣中分離獲得既耐高溫又能產(chǎn)生高酶活的貝萊斯芽孢桿菌Fb，對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化以及分子生物學(xué)鑒定，同時研究其最適的生長條件，分解茶渣的效果，為后續(xù)的茶渣開發(fā)研究奠定理論的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

LB培養(yǎng)液（L）：酵母粉10 g，蛋白胨10 g，牛肉浸膏5 g，NaCl 10 g，pH 5.5～6.0。

純化固體培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)液中時加入20 g瓊脂粉。

分離固體培養(yǎng)基：取新鮮茶渣50 g加蒸餾水500 ml蒸煮30 min，過濾后的茶渣液定容到200 ml，加入4 g瓊脂粉。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：同LB培養(yǎng)液。

茶渣：采集于某地的茶飲料車間。將發(fā)酵前后的茶渣烘干，粉碎并過0.25 mm孔徑篩，用四分法取樣100 g。

主要儀器：LRH-250A生化培養(yǎng)箱，CRY-200恒溫?fù)u床，Multiskan MK3酶標(biāo)儀，F(xiàn)OSS全自動凱氏定氮儀Kjeltec8400，F(xiàn)OSS2010纖維測定儀，menbarPureA300全自動氨基酸分析儀。

試劑：酵母粉、蛋白胨、NaCl等均為AR級、茚三酮染色劑、緩沖液、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液和稀釋液均為 德國menbarPure公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)與分離 從某地多年堆積的茶渣處取樣品10 g，加入盛有50 mL LB培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，在42 ℃、120 r·min－1條件下富集培養(yǎng)24 h，取2 mL培養(yǎng)物接種到新鮮的LB培養(yǎng)液，以相同的條件重復(fù)培養(yǎng)3次。富集培養(yǎng)物在分離固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，42 ℃培養(yǎng)24 h。挑取生長明顯的菌落進(jìn)行復(fù)篩。將初篩菌落在純化固體培養(yǎng)基上劃線分離3次，以獲得純培養(yǎng)物，并依據(jù)菌種在分離固體培養(yǎng)基的生長情況，挑取有不同形態(tài)特征的單菌落，于42 ℃ LB培養(yǎng)基上分別擴(kuò)繁后加20%甘油混勻 ，于－80 ℃條件下保存。

本研究對2016年1月1日—2017年12月31日于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腔鏡科使用超細(xì)鼻胃鏡的患者進(jìn)行回顧性分析，共計(jì)160例，年齡36～91歲，男性136例，女性24例，平均年齡分別為61.54±10.34歲和61.38±10.00歲，包含門診與住院患者，患者均一般狀態(tài)尚可，在清醒狀態(tài)下完成內(nèi)鏡下診療，無術(shù)后并發(fā)癥。病變狹窄類型主要為消化道癌癥、術(shù)后吻合口良性與復(fù)發(fā)性狹窄、外壓性狹窄及不明原因性狹窄等，所有患者均因標(biāo)準(zhǔn)胃腸鏡無法通過狹窄處而使用超細(xì)鼻胃鏡。電子內(nèi)鏡均為奧林巴斯生產(chǎn)，標(biāo)準(zhǔn)胃鏡的外徑≤9.8 mm，標(biāo)準(zhǔn)腸鏡的外徑≤12.9 mm，而鼻胃鏡的外徑≤5.8 mm(表1)。

1.2.2 菌株產(chǎn)酶能力測定 將菌株活化24 h后挑取1環(huán)至液體發(fā)酵培養(yǎng)液中，42 ℃、120 r·min－1條件下培養(yǎng)48 h后，測定發(fā)酵液的蛋白酶、纖維素酶的活力。采用蒽酮比色法測定纖維素酶（CL）催化羧甲基纖維素鈉降解產(chǎn)生的還原糖的含量[29]。每mL樣本每分鐘催化產(chǎn)生1 μg葡萄糖定義為一個酶活力單位（U）。酸性蛋白酶（ACP）、中性蛋白酶（NP）和堿性蛋白酶（AKP）的測定按照GB/T 23527—2 009和相關(guān)文獻(xiàn)[30－31]執(zhí)行。

1.2.3 菌落與菌體形態(tài)特征觀察 菌株平板劃線42 ℃分別培養(yǎng)16 h和25 h，在自然光下觀察菌落形態(tài) ；革蘭氏染色后，觀察菌株形態(tài)[32－33]。

1.2.4 菌株生理生化特性 試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[34－35]進(jìn)行。

1.2.5 分子鑒定 菌株的分子鑒定用16S rDNA和gyrB基因進(jìn)行[36]。利用NCBI網(wǎng)站的BLAST功能對所測的16S rDNA和gyrA序列進(jìn)行同源性分析，確定親緣關(guān)系，使用MEGA 5.0軟件Neighbor-Joining[37－38]構(gòu) 建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次的相似度重復(fù)計(jì)算。

1.2.6 菌株生長特性 測量菌株的生長曲線，判斷最適生長溫度[39]；對其生長條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)如表1方案，分析不同因素對菌株生長的影響，其他培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基相同，間隔2 h取樣用酶標(biāo)儀在波長630 nm測吸光度。每組設(shè)3個重復(fù)。

表1 菌株生長條件單因素試驗(yàn)Table 1 Single factor test on growth conditions of bacteria

1.2.7 茶渣降解分析 用回接方法，驗(yàn)證菌株對茶渣降解效果：對照組不添加菌劑；發(fā)酵組用LB菌株培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)制成種子，將培養(yǎng)好的種子接入新鮮茶渣中，攪拌均勻使其菌濃度約為1×106CFU·g－1；對照組和發(fā)酵組各裝入9個1 L的三角瓶，每瓶裝量200 mg。兩組同時放入42～45 ℃下的培養(yǎng)箱中；每天搖動三角瓶5 s，發(fā)酵7 d結(jié)束測定茶渣營養(yǎng)成分的變化。

常規(guī)成分測定[40]：粗蛋白、粗纖維和粗灰分分別按GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006和GB/T 6438—2007規(guī)定的方法執(zhí)行。纖維的成分測定[40]：中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）和酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）測定根據(jù)GB/T 20806—2006和GB/T 20805—2006方法。氨基酸測定[41]：按GB/T 18246—2000方法，采用全自動氨基酸分析儀 （menbarPureA300）進(jìn)行測定。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 所得數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，F(xiàn)檢驗(yàn)分析；采用氨基酸分析儀自帶軟件處理數(shù) 據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株產(chǎn)酶能力比較

對5株菌的發(fā)酵液進(jìn)行分析，產(chǎn)纖維素酶（CL）活力由高到低分別是DJ、8106、Fb、8116、HLH；酸性蛋白酶（ACP）活力由高到低分別是8106、8116、DJ、HLH、Fb；中性蛋白酶（NP）活力由高到低分別是8106、HLH、8116、DJ、Fb；堿性蛋白酶（AKP）活力由高到低分別是Fb、8116、8106、DJ、HLH（表2）?？梢奆b菌產(chǎn)四種酶的活力均較強(qiáng)。

表2 菌株酶活力比較Table 2 Enzyme activities of selected strains

2.2 菌落與菌體形態(tài)特征

Fb菌在自然光下，LB培養(yǎng)基，42 ℃培養(yǎng)16 h，其菌落淺黃色，圓形，表面干燥，不透明，邊緣不整齊，如圖1。菌體呈桿狀，(0.4～0.6) μm×(0.9～4.0) μm，單個或成對排列，菌體形態(tài)如圖2；芽胞近圓形，近中部生見圖3圓圈標(biāo)記。

圖1 FB菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology (FB)

圖2 菌體形態(tài)Fig. 2 Thallus morphology

圖3 芽孢形態(tài)Fig. 3 Strain morphology

2.3 菌株生理生化特性

由表3可知，F(xiàn)b菌株能水解七葉苷；吲哚試驗(yàn)陽性；可在β-木糖苷酶、苯丙氨酸芳胺酶、α-半乳糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、L-吡咯烷酮芳胺酶等酶中生長；能利用D-甘露醇、D-甘露糖、古老糖、D-海藻糖、D-葡萄糖、D-核糖等多種糖作為碳源生長；但不能利用肌醇、L-鼠李糖、菊粉、環(huán)糊精、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-塔格糖、糖原、麥芽三糖、D-松三糖等。Fb菌株能在低劑量的抗生素中生長，不能在高劑量的卡那霉素耐藥（0.2 g·L－1）、竹桃霉素耐藥（0.1 g·L－1）、多粘菌素B耐藥 （0.031 g·L－1）等培養(yǎng)基生長。

表3 Fb菌株生理生化特性Table 3 Characteristics of Fb

2.4 菌株的分子鑒定

利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast程序分析結(jié)果表明，F(xiàn)b菌株與Bacillus siamensisKCTC 13613T（AJVF 01000043）和Bacillus amyloliquefaciensDSM 7T（FN 597644）菌株的同源性最高，相似性達(dá)到99.93%。采用MEGA 5.0軟件，鄰位鏈接法顯示Fb菌株與相關(guān)種的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。菌株gyrB測序分析表明，序列長1 176 bp。MEGA 5.0軟件分析結(jié)果表明，其與Bacillus velezensisBCRC 17467T（DQ903176）的同源性較高，相似性達(dá)到100%。同理將該菌株與其他種屬明確的10株菌的gyrB基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。

圖4 基于16S rDNA的相似菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strains based on 16S-rDNA differentiation

圖5 基于gyrB的相似菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of strains based on gyrB homologies

結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及16S rDNA和gyrB的序列比較分析，將Fb菌株鑒定為貝萊斯芽孢 桿菌（Bacillus velezensis）。

2.5 菌株生長特征

2.5.1 Fb菌的生長曲線 從圖6可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的提高，菌株的細(xì)胞分裂加快，吸光值增加；Fb菌可在30～60 ℃下生長，其最適的生長溫度 為39～54 ℃。

圖6 培養(yǎng)溫度對菌株生長的影響Fig. 6 Effect of temperature on Fb growth in culture

2.5.2 裝液量和搖床轉(zhuǎn)速對Fb菌生長的影響 搖床轉(zhuǎn)速120 r·min－1時，隨著裝液量的增加，菌液的吸光值升高，至裝液量30 mL時，F(xiàn)b菌的吸光值達(dá)最高：0.97；再提高裝液量，吸光值逐漸降低（圖7）。從圖8可知，裝液量30 mL時，隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，吸光值升高，搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min－1時，F(xiàn)b菌的吸光值達(dá)最高：0.98；再提高搖床轉(zhuǎn)速，吸光值逐漸降低。表明Fb菌液體培養(yǎng)最佳裝液量和搖床轉(zhuǎn)速分 別為30 mL和120 r·min－1。

圖7 裝液量對菌株生長的影響Fig. 7 Effect of liquid volume on Fb growth in culture

圖8 搖床轉(zhuǎn)速對菌株生長的影響Fig. 8 Effect of flask shaking speed on Fb growth in culture

2.5.3 培養(yǎng)時間對Fb菌生長的影響 圖9為Fb菌在培養(yǎng)溫度42 ℃下的生長曲線。0～6 h是菌體適應(yīng)新環(huán)境的遲緩期，細(xì)胞分裂增殖緩慢；6～16 h為生長繁殖迅速的對數(shù)生長期；16 h的菌體吸光值最高0.974；16～18 h為穩(wěn)定生長期；18 h后由于自溶酶作用或有毒代謝產(chǎn)物積累，細(xì)胞進(jìn)入衰亡期裂解菌體吸 光值隨之下降。表明Fb菌的最適培養(yǎng)時間為16 h。

圖9 培養(yǎng)時間對Fb菌生長的影響Fig. 9 Growth curve of cultured Fb

2.5.4 初始pH對Fb菌生長的影響 從圖10可以看出，培養(yǎng)基初始pH 4.0～5.0時，菌體吸光值隨pH的提高而提高；培養(yǎng)基初始pH 5.0～7.0范圍內(nèi)，F(xiàn)b菌生物量較高且各組間差異不顯著，均高0.93；再逐漸提高培養(yǎng)基的初始pH培養(yǎng)時，菌體吸光值隨之下降；表明Fb菌的培養(yǎng)基最適初始pH為5.0～7.0。

圖10 初始pH對Fb菌生長的影響Fig. 10 of initial pH on enzyme production of Fb

2.5.5 鹽度對Fb菌生長的影響 從圖11可以看出，培養(yǎng)液的鹽度從0.0增加到1.0%，菌株的吸光值也從0.46增加到0.92；培養(yǎng)液的鹽度為1.0%～6.0%，菌株的吸光值均大于0.92，無顯著差異；6.0%～7.0%菌 株的吸光值下降至0.81。

圖11 鹽度對菌株生長的影響Fig. 11 Effect of salinity on Fb growth in culture

2.6 菌株對茶渣降解效果

從茶渣常規(guī)營養(yǎng)成分分析看出（表4），發(fā)酵組比對照組粗蛋白提高14.88%，水分和粗纖維分別下降42.06%和9.69%，均存在顯著差異。

表4 茶渣常規(guī)營養(yǎng)成分的變化（n=9）Table 4 Changes in nutritional composition of tea dregs with Fb inoculation (dry base, n=9) （單位：%）

從茶渣纖維成分分析發(fā)現(xiàn)（表5），發(fā)酵組比對照組的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和木質(zhì)素分別下降10.72%、4.47%和11.37%，均存在顯著差異。

表5 茶渣纖維成分的比較（干基, n=9）Table 5 Change on fiber composition of tea dregs by treatment (dry base, n=9) （單位：%）

從茶渣氨基酸的組分和含量可以看出（表6），除胱氨酸、蛋氨酸和組氨酸發(fā)酵前后無差異外，兩組均為谷氨酸含量最高，其次天冬氨酸；除胱氨酸、蛋氨酸和組氨酸發(fā)酵外，其他14種氨基酸含量均顯著提高（P＜0.05）；氨基酸總量的變化與粗蛋白的變化一致，發(fā)酵后其含量提高5.98%，差異顯著。

表6 茶渣處理前后氨基酸含量的比較（干基, n=9）Table 6 Change on amino acid composition of tea dregs by treatment （單位：%）

以上結(jié)果表明Fb菌能高效分解茶渣，顯著提高茶渣的營養(yǎng)價值，更好實(shí)現(xiàn)茶渣飼料資源化利用。

3 討論與結(jié)論

研究表明，在固態(tài)發(fā)酵中，適宜的水分和原料粒度能夠保證發(fā)酵基質(zhì)深層微生物對氧氣的需求，疏松多孔的基質(zhì)能促進(jìn)微生物的代謝廢物及時排出，基質(zhì)內(nèi)部的養(yǎng)分也可隨著自由水通過原料間隙擴(kuò)散到基質(zhì)表面，滿足基質(zhì)表面微生物對營養(yǎng)的需求，有利于微生物正常繁殖并保持高產(chǎn)酶活性狀態(tài)[1,42]。對于含水率高的物料，一般選擇吸水性強(qiáng)的鋪料如麥麩等來降低物料的含水率；或選擇中高溫菌發(fā)酵利于物料中水分蒸發(fā)。劉姝等[12]、胡桂萍等[13]、倪星虹[14]和朱飛等[1]均在茶渣中添加不同種類和比例的鋪料進(jìn)行發(fā)酵。本研究獲得貝萊斯芽孢桿菌Fb屬高溫菌，在不添加任何鋪料條件下，新鮮茶渣茶渣經(jīng)其7 d發(fā)酵后水分下降了42.06%（P＜0.05），可有效解決水分過高的問題。這種利用高溫菌發(fā)酵分解高水分茶渣的方法不僅能降低生產(chǎn)成本，而且能發(fā)酵產(chǎn)生的生物熱加大物料水分蒸發(fā)鮮見報(bào)道。

本研究中，利用高溫特殊生境分離方法，從廢棄茶渣中分離到有分解茶渣作用的高溫菌5株，其中Fb菌能產(chǎn)生具有較強(qiáng)酶活力的纖維素酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶；與胡寶東等[43]從醬香型大曲中分離獲得的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（即貝萊斯芽孢桿菌）FBKL1.0190相似。Fb菌經(jīng)菌落形態(tài)、菌株形態(tài)、生理生化特性的研究及分子鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）；可耐受55 ℃的高溫，最適生長條件為：42～45 ℃、pH 5.0～7.0、16 h、鹽度1.0%～6.0%、裝液量0.12 mL·min－1、搖床轉(zhuǎn)速120 r·min－1。茶渣經(jīng)Fb菌株發(fā)酵后，與對照組比，粗蛋白提高14.88%（P＜0.05）；除胱氨酸、蛋氨酸和組氨酸發(fā)酵外，其他14種氨基酸含量均顯著提高（P＜0.05），且氨基酸總量提高5.98%（P＜0.05）；這與朱飛等[1]的結(jié)果一致，與李芳蓉[44]和張沛[45]的結(jié)果相近。另，本研究中茶渣經(jīng)Fb菌株發(fā)酵后與對照組相比粗纖維及其中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和木質(zhì)素分別下降9.69%、10.72%、4.47%和11.37%（P＜0.05），這與張楠[46]和陳奕業(yè)[47]研究的結(jié)果相似。此外，本研究分離的Fb菌株的生長溫度均高于他們的發(fā)酵菌株，這不僅可減少其他雜菌生長，而且可提高發(fā)酵效率。由此可見，F(xiàn)b菌能有效分解茶渣，提高茶渣的營養(yǎng)價值。但該菌株在發(fā)酵分解茶渣的過程中能否產(chǎn)生一些抗菌的活性物質(zhì)或表面活性素還有待后續(xù)的研究。