慢性阻塞性肺疾病大鼠血液、支氣管灌洗液中水通道蛋白及p-c-Jun-N-末端激酶表達情況實驗研究

張卓紅，趙拖利

(1.西電集團醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，陜西 西安 710077；2.榆林市中醫(yī)醫(yī)院藥房，陜西 榆林 719000)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以持續(xù)氣流受限為特征的呼吸系統(tǒng)疾病，氣流受限多呈進行性發(fā)展,主要累及氣道、肺實質(zhì)及肺血管系統(tǒng)[1]。隨著老年人口的增加，有害氣體排放的增加，COPD的患者逐年增加，在60歲以上人群的患病率接近10%，嚴重影響患者的勞動能力和生活質(zhì)量[2-3]。該病的主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、咯痰、喘息、胸悶等，特別是COPD炎癥過程中存在氣道黏液高分泌，黏液中高黏蛋白含量顯著增加，使得黏液中的水與黏蛋白比例失衡，導致痰液黏稠，以致患者成為易感者[4-5]。并且長期的慢性炎癥可導致氣道組織結(jié)構(gòu)反復(fù)損傷及異常修復(fù)，引起肺泡上皮細胞功能障礙，造成氣流受限，導致肺泡壁塌陷，誘發(fā)機體形成肺氣腫[6-7]。不過當前COPD的發(fā)病機制還不明確，探究出一種參與COPD的發(fā)生機制對于改善患者預(yù)后具有重要價值。水通道蛋白-1(Aquaporin，AQP-1)與p-c-Jun-N-末端激酶(P-c-Jun-N-terminal kinase，p-JNK)蛋白與細胞凋亡存在相關(guān)性，可介導細胞膜到細胞核的信號轉(zhuǎn)導，可被細胞應(yīng)激、炎癥、凋亡等多種因素激活[8-9]。本文具體探討與分析了COPD大鼠血液、支氣管灌洗液中AQP-1及p-JNK表達情況,探尋COPD的發(fā)生調(diào)節(jié)機制，為阻止或延緩COPD的病情發(fā)展提供參考，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料 7～8周齡SPF級Wistar雄性大鼠(n=48)購自北京維通利華公司，合格證號SCXK388114，體重(250±20)g。大鼠分籠飼養(yǎng)，由專人管理，每籠5只。實驗動物中心光照充足，普通專用飼料喂養(yǎng)，環(huán)境溫度為18～25 ℃，通風和空調(diào)設(shè)備良好，相對濕度為50%～70%，實驗室按常規(guī)定期消毒。所有大鼠于上述適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗，動物倫理委員批準了此次研究。 非束縛小動物肺功能測量儀購自美國BUXCOBUXCO公司，熏煙箱購自蘇州市馮氏實驗動物設(shè)備有限公司，酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，過濾嘴香煙購自長沙卷煙廠。

1.2 動物分組與建模 將大鼠隨機平分為對照組和模型組。模型組：在實驗第1天和第14天，大鼠各經(jīng)氣管注射脂多糖，其余時間將大鼠置于半封閉的熏煙染毒箱內(nèi)熏煙2次，每次8支長沙牌香煙(分為4次點燃，每次燃盡耗時8～10 min，保持煙霧濃度為5%左右，總共耗時為40 min)，兩次熏煙時間間隔10 h，熏煙完畢后進行正常清潔飼料飼養(yǎng)。對照組：在清潔環(huán)境下進行飼養(yǎng)。對照組、模型組分別為造模第4周、第8周、第12周分別處死8只大鼠進行后續(xù)實驗。

1.3 觀察指標 ①觀察與記錄所有大鼠的一般狀態(tài)，包括行為、外觀、進食進水、癥狀等。②在造模第4周、第8周、第12周穿刺大鼠的頸總動脈并固定，抽取0.2 ml動脈血，采用血氣分析儀檢測二氧化碳分壓(PaCO2)和氧分壓(PaO2)。③在上述時間點夾畢頸總動脈，建立氣管通道，通過生物機能實驗系統(tǒng)測定大鼠肺功能，測定與記錄第0.3秒用力呼氣容積(FEV0.3)、第0.3秒用力呼氣容積占用力肺活量的比值(FEV0.3/FVC)等指標。④取大鼠的頸動脈血，盡量取盡大鼠血液，靜置20 min后離心，分離血清，保存于-20 ℃冰箱。包括大鼠胸腔氣管和肺門，結(jié)扎右主支氣管，回收支氣管肺泡灌洗液，過濾后取上清液保存于-20 ℃冰箱，然后采用酶聯(lián)免疫檢測血液、支氣管灌洗液中AQP-1、p-JNK濃度。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般情況比較 所有大鼠都無死亡情況發(fā)生。對照組大鼠神經(jīng)狀況良好，動作靈活，皮毛有光澤，進食、進水正常。模型組大鼠表現(xiàn)為不同程度的煩躁，出現(xiàn)明顯的腹式呼吸，食欲及活動能力下降。

2.2 兩組造模不同時間點血氣指標比較 模型組造模第4周、第8周、第12周的PaCO2高于對照組，PaO2低于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組造模不同時間點血氣指標比較(mmHg)

2.3 兩組造模不同時間點肺功能比較 模型組造模第4周、第8周、第12周的FEV0.3、FEV0.3/FVC都低于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組造模不同時間點肺功能比較

2.4 兩組造模不同時間點血液、支氣管灌洗液AQP-1、p-JNK表達水平比較 模型組造模第4周、第8周、第12周的血液、支氣管灌洗液AQP-1、p-JNK表達水平都高于對照組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見表3。

表3 兩組造模不同時間點血液、支氣管灌洗液AQP-1、p-JNK表達水平比較(pg/ml)

續(xù) 表

2.5 COPD大鼠血液、支氣管灌洗液中AQP-1及p-JNK表達與血氣指標、肺功能相關(guān)性分析 在模型組中，Pearson相關(guān)分析造模第12周的血液、支氣管灌洗液AQP-1、p-JNK表達水平與PaCO2、PaO2、FEV0.3、FEV0.3/FVC存在相關(guān)性(均P<0.05)，見表4。

表4 COPD大鼠血液、支氣管灌洗液中AQP-1及p-JNK表達與血氣指標、肺功能相關(guān)性(n=8)

3 討 論

COPD是一種高患病率、高病死率的公眾健康疾病，其發(fā)病機制還不明確，不過涉及到蛋白酶-抗蛋白酶失衡、慢性炎癥、氧化應(yīng)激等多個過程，可導致肺實質(zhì)破壞與慢性支氣管炎形成，最終導致持續(xù)性氣流受限[10-11]。隨著醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展，COPD的臨床治療取得了長足的進步，但其病死率仍居高不下，為此繼續(xù)加強發(fā)病機制研究具有重要價值[12]。本研究顯示模型組造模第4周、第8周、第12周的PaCO2高于對照組(均P<0.05)，PaO2低于對照組(均P<0.05)；模型組造模第4周、第8周、第12周的FEV0.3、FEV0.3/FVC都低于對照組(均P<0.05)，表明采用氣管內(nèi)注射脂多糖與被動吸煙法建立COPD大鼠模型具有很好的效果。從機制上分析，脂多糖引發(fā)類脂性肺炎，誘導炎癥介質(zhì)的釋放及激活，可模擬細菌感染和炎癥過程[13]。持續(xù)進行熏煙可導致大鼠小氣道通氣阻力升高與肺動態(tài)順應(yīng)性減少，使得大鼠存在慢性咳嗽咳痰、喘息、呼吸困難等癥狀[14]。

COPD是一種具有氣流受到限制的常見病、多發(fā)病，病情重時不可逆，氣流受限病情輕時可逆，可表現(xiàn)為氣道重新塑造與氣道高反應(yīng)性[15]。COPD 動物模型的評價主要依靠病理學和肺功能觀察，功能從病理生理角度闡釋模型功能學改變，由于大鼠呼吸是被動的，為此在實際檢測中多采用FEV0.3、FEV0.3/FVC等指標。本研究顯示模型組造模第4周、第8周、第12周的FEV0.3、FEV0.3/FVC都低于對照組(均P<0.05)。表明COPD大鼠可出現(xiàn)肺功能下降，也認為本研究建立的COPD大鼠模型是成功的。

已有研究認為氧化應(yīng)激是導致COPD發(fā)生的主要原因之一，氧化應(yīng)激導致的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)多種細胞的未折疊蛋白反應(yīng)，造成抗氧化物質(zhì)過度消耗，還能夠通過多種途徑激活線粒體凋亡通路等多種信號通路[16]。其中p-JNK可通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員分子的活性等機制促使細胞凋亡，加速肺氣腫的發(fā)生，進而參與COPD的發(fā)生與發(fā)展。AQP-1是肺組織中主要的水轉(zhuǎn)運通道，AQP-1表達增加可導致黏蛋白濃度增加與氣道水分泌減少[17]。本研究顯示模型組造模第4周、第8周、第12周的血液、支氣管灌洗液AQP-1、p-JNK表達水平都高于對照組(均P<0.05)，表明COPD大鼠伴隨有血液、支氣管灌洗液的AQP-1、p-JNK高表達。當前也有研究表明AQP-1、p-JNK能夠上調(diào)TNF-α水平，能增加過氧化物的產(chǎn)生，進一步激活巨噬細胞，刺激巨噬細胞脫顆粒，從而加重肺損傷。并且AQP-1、p-JNK被激活后會釋放出蛋白酶、氧化代謝產(chǎn)物等損傷局部組織，使支氣管和肺組織發(fā)生多種病理變化，導致COPD的病情惡化[18]。

本研究Pearson相關(guān)分析COPD大鼠造模第12周的血液、支氣管灌洗液AQP-1、p-JNK表達水平與PaCO2、PaO2、FEV0.3、FEV0.3/FVC存在相關(guān)性(均P<0.05)。從機制上分析，AQP-1、p-JNK在血液與呼吸系統(tǒng)釋放炎癥介質(zhì)，能導致氣道炎癥反應(yīng)，從而破壞患者肺組織，降低了COPD機體的肺功能[19-20]。本研究也存在一定的不足，沒有對大鼠的肺組織進行病理分析，也沒有進行AQP-1、p-JNK蛋白表達的Western blot檢測分析，將在后續(xù)研究中進行探討。

綜上所述，COPD大鼠伴隨有血液、支氣管灌洗液的AQP-1、p-JNK高表達，且與大鼠的血氣指標與肺功能存在相關(guān)性，從而參與COPD的發(fā)生與發(fā)展。