骨肉瘤細(xì)胞中miR-215-5p和eIF2a靶向關(guān)系及臨床意義

張 哲，程漠松，莊 鶴，田曉東

(錦州市第二醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

骨肉瘤的形成涉及機(jī)體多種遺傳因子，包括DNA、RNA等分子遺傳改變。近年研究顯示骨肉瘤的發(fā)病率呈明顯的升高趨勢[1-3]。蛋白質(zhì)合成是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和腫瘤細(xì)胞增殖的關(guān)鍵步驟，在蛋白質(zhì)翻譯過程中真核細(xì)胞翻譯起始因子常發(fā)生變化，對于調(diào)控下游的腫瘤性增殖起重要作用。真核細(xì)胞翻譯起始因子2a(Eukaryotic translation initiation factor 2a,eIF2a)參與其中，其對細(xì)胞增殖、腫瘤細(xì)胞遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化均有重要價(jià)值[2]。eIF2a發(fā)揮作用過程中受多種因子的調(diào)控，微小RNA(microRNAs,miRNAs)是eIF2a上游調(diào)控的重要因子[4-7]，本研究經(jīng)數(shù)據(jù)庫初篩和前期實(shí)驗(yàn)的篩選，選擇可能與eIF2a有結(jié)合位點(diǎn)的miR-215-5p進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)基于骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討miR-215-5p與eIF2a的靶向關(guān)系，分析二者表達(dá)的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人骨肉瘤細(xì)胞系Saos2購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。TRIZOL、細(xì)胞培養(yǎng)基PRMI1640及胎牛血清購自美國Gibco公司，ECL顯色液購自美國Thermo公司，eIF2a購自蘇州睿瀛生物技術(shù)公司，GAPDH、DAB和二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。RIPA裂解液、胰酶消化液、質(zhì)粒提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自武漢三鷹生物公司。Lipofetamine 2000和雙熒光素酶試劑盒購自美國Invitrogen公司。引物由上海吉瑪生物合成。酶標(biāo)儀為Thermo公司生產(chǎn)的MK3。PCR儀為美國Bio Rad IQ5。

1.2 研究對象 選擇2018年1月至2020年12月在我院確診為骨肉瘤并行手術(shù)治療的患者38例作為觀察對象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①均有術(shù)后病理診斷，且符合WHO中的標(biāo)準(zhǔn)；②首次發(fā)病并確診；③臨床隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他器官惡性腫瘤；②家族遺傳性疾?。虎坌g(shù)前行放、化療?；颊咧心?0例，女18例，年齡5～78歲，平均(18.1±4.5)歲。留取術(shù)后腫瘤組織新鮮標(biāo)本(-80 ℃保存)和石蠟包埋標(biāo)本。研究經(jīng)醫(yī)院倫委員會(huì)批準(zhǔn)同意，符合《赫爾辛基宣言》中的要求，家屬簽定知情同意書。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人骨肉瘤細(xì)胞系Saos2應(yīng)用10%胎牛血清、1%青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至80%時(shí)進(jìn)行傳代，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml接種于12孔板中，每孔1 ml。構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，建立陰性對照組、無關(guān)序列組、miR-21-5p mimic組、miR-21-5p inhibitor組。操作嚴(yán)格按說明書操作，減少污染及人為誤差。

1.3.2 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)觀察miR-215-5p與eIF2a 3’UTR的結(jié)合情況。將含有eIF2a mRNA 3’UTR的野生型(pGL3-eIF2a-WT)和突變型(pGL3-eIF2a-MT)報(bào)告質(zhì)粒，分別同miR-215-5p mimic、陰性對照組(NC)共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞系Saos2中，4 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察熒光素酶的活性。

1.3.3 miR-215-5p的檢測：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real time fluorescence quantitative PCR,qPCR)檢測miR-215-5p的表達(dá)。TRIZOL提取總RNA并進(jìn)行驗(yàn)證。miR-215-5p引物上游：5’-TCGTGTCGTAGTGTGACTGTGG-3’，下游：5’-GCCTGTATAGGACACGTACT-3’。U6為內(nèi)參，引物上游：5’-GGCAGACGCGAAGATTAGC-3’，下游：5’-TTGGAACGCAAATTCCG-3’。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，31個(gè)循環(huán)后進(jìn)行延伸。讀取Ct值，以2-ΔΔCt法表示結(jié)果。ΔΔCt=[Ct目的基因(未知樣品)-Ct對照(未知樣品)]-[Ct目的基因(校正樣品)-Ct對照(校正樣品)]。

1.3.4 Western blot實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用Western blot法檢測eIF2a的表達(dá)。以GAPDH作為內(nèi)參。依次行蛋白提取、濃度測定、變性、加樣、電泳、電轉(zhuǎn)及免疫雜交進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，取出膜加入發(fā)光液 3 min，顯影20 s。以目的蛋白與GAPDH的比值作為結(jié)果進(jìn)行半定量分析，應(yīng)用Image J分析完成。嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟操作，做好質(zhì)控工作。

1.3.5 免疫組化實(shí)驗(yàn)：組織常規(guī)行取材、脫水、石蠟包埋后，切取4 μm切片，應(yīng)用免疫組化Envision 法檢測eIF2a的表達(dá)，DAB顯色，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟操作，設(shè)陽性對照，做好質(zhì)控工作，減少人為誤差。結(jié)果由病理醫(yī)師進(jìn)行判讀，應(yīng)用盲法，eIF2a的顯色部位是細(xì)胞質(zhì)，以黃色-棕褐色為陽性。應(yīng)用著色強(qiáng)度及陽性率的綜合評分法。著色強(qiáng)度：無著色為0分，弱為1分，中為2分，強(qiáng)為3分。陽性率：選擇熱點(diǎn)區(qū)進(jìn)行觀察，共選擇5個(gè)400倍視野，以陽性率<5%為0分，5%～10%為1分，以11%～25%為2分，以26%～50%為3分，以>50%為4分。兩者相乘為最終評分，總分范圍0～12分。以≤5分為陰性，以>5分為陽性。計(jì)算陽性率。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)庫檢索的結(jié)果 Target Scan數(shù)據(jù)庫顯示miR-215-5p與eIF2a具有可能結(jié)合的堿基序列。見圖1。

圖1 Target Scan數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果

2.2 eIF2a在不同組別細(xì)胞系中的表達(dá) miR-215-5p mimic組中eIF2a的表達(dá)明顯低于陰性對照組和無關(guān)序列組，miR-215-5p inhibitor組中eIF2a的表達(dá)明顯高于陰性對照組和無關(guān)序列組。見圖2。

圖2 eIF2a在不同組別細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示miR-215-5p與eIF2a具有靶向關(guān)系。見圖3。

注:miR-215-5p mimic與eIF2a+WT比較，*P<0.05

2.4 骨肉瘤不同臨床病理特征中miR-215-5p表達(dá)量、eIF2a陽性情況比較 骨肉瘤中miR-215-5p表達(dá)范圍是1.2～3.4，平均2.3±0.3。eIF2a共20例陽性，陽性率為52.63%。由表1可見，miR-215-5p的表達(dá)量、eIF2a的陽性率在骨肉瘤不同腫瘤最大徑和病變級別中的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。而在不同性別、年齡及周圍組織累犯中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1(圖4)。

表1 骨肉瘤不同臨床病理特征中miR-215-5p表達(dá)量、eIF2a陽性情況比較

A：miR-215-5p表達(dá)的擴(kuò)增曲線(PCR)；B：eIF2a在骨肉瘤中陽性表達(dá)(免疫組化,×200倍)

2.5 骨肉瘤中miR-215-5p與eIF2a表達(dá)的相關(guān)性分析 應(yīng)用Spearman相關(guān)分析顯示骨肉瘤中miR-215-5p與eIF2a呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.67,P=0.0146)。

3 討 論

骨肉瘤的發(fā)生與機(jī)體的遺傳物質(zhì)改變有關(guān)，其中包括DNA、RNA和相關(guān)蛋白質(zhì)的異常表達(dá)[8-10]。miRNAs是近年學(xué)者關(guān)注到的非編碼RNA，其主要是通過調(diào)控下游因子發(fā)揮生物學(xué)作用，其異常表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展相關(guān)[11-13]。本研究基于骨肉瘤細(xì)胞系及骨肉瘤術(shù)后的病變組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示miR-215-5p mimic組中eIF2a的表達(dá)明顯低于陰性對照組和無關(guān)序列組，miR-215-5p inhibitor組中eIF2a的表達(dá)明顯高于陰性對照組和無關(guān)序列組，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示miR-215-5p與eIF2a具有靶向關(guān)系，且經(jīng)骨肉瘤組織中的相關(guān)分析得以進(jìn)一步明確，提示miR-215-5p與eIF2a具有明確的靶向關(guān)系，miR-215-5p可能作為上游因子調(diào)控下游因子eIF2a的表達(dá)，參與eIF2a調(diào)控的細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用。研究顯示骨肉瘤中miR-215-5p的表達(dá)量、eIF2a的陽性率在不同腫瘤最大徑和臨床分期中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由于上述兩個(gè)指標(biāo)均為腫瘤進(jìn)展的重要指標(biāo)，提示miR-215-5p低表達(dá)、eIF2a高表達(dá)參與腫瘤的進(jìn)展過程。miR-215-5p對腫瘤的調(diào)控具有直接作用。有研究顯示miR-215-5p低表達(dá)時(shí)對腫瘤細(xì)胞增殖因子和凋亡相關(guān)因子有調(diào)節(jié)作用，認(rèn)為miR-215-5p具有抑癌基因樣的生物學(xué)作用[14-17]。miR-215-5p對細(xì)胞增殖的調(diào)控與對細(xì)胞周期的作用有關(guān)[18]。miR-215-5p可能對調(diào)控G0/G1期有一定作用。有研究顯認(rèn)為miR-215-5p異常表達(dá)使腫瘤細(xì)胞增殖的周期縮短，有效提高腫瘤細(xì)胞增殖的速度，其可能是通過靶因子EGFR發(fā)揮調(diào)控作用的[19]。抑制凋亡是miR-215-5p低表達(dá)時(shí)的經(jīng)典作用，使細(xì)胞自身的程序性死亡細(xì)胞減少，腫瘤細(xì)胞具有“永生化”的特點(diǎn)。骨肉瘤病變的分級與預(yù)后直接相關(guān)，而病理學(xué)形態(tài)診斷中病變的分級常缺少客觀指標(biāo)，即往認(rèn)為Ki67等增殖指標(biāo)可能有助于分級，但是其臨界值學(xué)者很難達(dá)成共識。本研究發(fā)現(xiàn)的miR-215-5p的表達(dá)與骨肉瘤病變的級別相關(guān)，提示miR-215-5p可能為臨床病理診斷中判斷病變分級提供客觀的參考指標(biāo)。EIF2a作為miR-215-5p調(diào)控的下游因子，可以引起Cyclin D1的增殖，并通過ATF4等途徑調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)，從而增加了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。也有研究認(rèn)為PERK是eIF2a的上游信號分子，共同調(diào)節(jié)VEGF發(fā)揮腫瘤的促血管生成的作用，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[20]。但是關(guān)于miR-215-5p/eIF2a調(diào)控的具體通路及作用機(jī)制有待更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

總之，骨肉瘤細(xì)胞中miR-215-5p和eIF2a具有靶向關(guān)系，miR-215-5p與eIF2a的異常表達(dá)可能參與腫瘤的進(jìn)展。