屎腸球菌R2培養(yǎng)條件優(yōu)化及酸漿發(fā)酵劑的制備

陳志娜，沈業(yè)橋，葉韜，黃琳

（1.淮南師范學(xué)院生物工程學(xué)院，安徽 淮南 232038；2.資源與環(huán)境生物技術(shù)安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 淮南 232038）

屎腸球菌（Enterococcus faecium）屬于乳酸菌的一種，因?yàn)樵诖x過(guò)程中產(chǎn)生乙酸和乳酸，能夠降低腸道內(nèi)的pH值，可以維持和調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群生態(tài)平衡[1]，特別是在幼齡動(dòng)物腸道保健和疾病的防疫以及治療上有突出表現(xiàn)。屎腸球菌廣泛存在于傳統(tǒng)乳制品[2-4]、泡菜[5]、豆醬[6]、香腸[7]等發(fā)酵食品中，可以影響食品的香氣、風(fēng)味、質(zhì)地，還能產(chǎn)生多種有益成分[8]。課題組前期從泡菜中篩選出一株可用于酸漿發(fā)酵的屎腸球菌E.faecium R2[9]，對(duì)其進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià)[10]，證明了其實(shí)用性與安全性，可用于酸漿發(fā)酵劑的制備，具有廣闊的應(yīng)用前景?；罹鷶?shù)量是衡量發(fā)酵劑性能的主要指標(biāo)，研究表明相對(duì)于厭氧發(fā)酵，乳酸菌利用有氧增殖可顯著提高菌體數(shù)量，減少發(fā)酵劑生產(chǎn)成本。另外，進(jìn)行有氧代謝的乳酸菌的長(zhǎng)期存活能力是發(fā)酵代謝的106倍～108倍，可延長(zhǎng)發(fā)酵劑的貨架期[11]。因此，通過(guò)有氧代謝方式來(lái)提高乳酸菌細(xì)胞數(shù)量，為規(guī)?；l(fā)酵劑制備工藝提供新的思路[12]。

研究表明添加外源血紅素可使腸球菌進(jìn)行有氧呼吸代謝[13-14]。因此，本文以E.faecium R2為研究對(duì)象，驗(yàn)證該菌株是否可進(jìn)行有氧呼吸代謝，進(jìn)而采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其有氧呼吸增殖條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得純種酸漿發(fā)酵劑，并對(duì)該發(fā)酵劑的發(fā)酵性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為酸漿發(fā)酵劑的推廣和大豆黃漿水的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

屎腸球菌（E.faecium R2）CGMCC 14944：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；脫脂乳粉：內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；1-谷氨酸鈉鹽、氯化血紅素：上海麥克林生化科技有限公司；蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、蔗糖：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

0.5 mg/mL血紅素溶液：稱取0.05 g血紅素，將其溶于0.05 mol/L的NaOH水溶液中，4℃下于棕色廣口瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）：蛋白胨 10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖 20.0 g、磷酸氫二鉀 2.0 g、乙酸鈉5.0 g、硫酸錳0.25 g、硫酸鎂0.58 g、檸檬酸二銨2.0 g、吐溫-80 1.0 mL、蒸餾水 1 L，pH 6.2，121 ℃下滅菌20 min。MRS固體培養(yǎng)基再添加瓊脂粉18.0 g，用于培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

取30 mL黃漿水加入到250 mL錐形瓶中，為黃漿水培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上添加60 μL 0.5 mg/mL的血紅素溶液，即得黃漿水血紅素培養(yǎng)基，121℃下滅菌20 min，備用。

1.2 設(shè)備和儀器

JA2203N電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；UV2300紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海天美科學(xué)儀器有限公司；ZHWY-100B恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海智誠(chéng)分析儀器制造廠；LDZF-30KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺(tái)：蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；pHS-3CpH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LRH-250-A生化培養(yǎng)箱：廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司；HZP-250全溫培養(yǎng)振蕩器：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TS-200B臺(tái)式空氣浴恒溫?fù)u床：上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；JYC-21ES55C電磁爐：九陽(yáng)股份有限公司；槳式攪拌器：鹽城市沃特機(jī)械設(shè)備有限公司；RMQYL立式油壓千斤頂：榮美液壓機(jī)械制造有限公司；FD-1A-50臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將屎腸球菌R2接種到MRS培養(yǎng)基中，于37℃下靜置培養(yǎng)14 h，備用。

1.3.2 黃漿水的制備

取700 g黃豆用蒸餾水于25℃下浸泡8 h后，豆水比1∶8（g/mL）打漿，用100目尼龍篩布過(guò)濾除渣，所得生豆?jié){煮沸并維持5 min，當(dāng)降溫至85℃時(shí)，輕輕攪動(dòng)下緩緩加入酸漿，直至出現(xiàn)均勻腦花，添加量為16%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）左右。85℃下蹲腦20 min后，將豆花倒入豆腐模具中于5.5 kPa～6.0 kPa壓力下壓漿30 min，得到黃漿水[9]。試驗(yàn)用酸漿參考葉青等[15]的方法采用三級(jí)豆腐黃腐黃漿水為發(fā)酵基質(zhì)制備而成，以消除原鹵鹽凝固劑的影響。

1.3.3 屎腸球菌R2在傳統(tǒng)發(fā)酵與有氧呼吸條件下的生長(zhǎng)趨勢(shì)

將活化后的屎腸球菌R2按3%的接種量分別接種到黃漿水培養(yǎng)基與黃漿水血紅素培養(yǎng)基中，分別在傳統(tǒng)發(fā)酵（無(wú)氧無(wú)血紅素：靜置培養(yǎng)，黃漿水培養(yǎng)基，用NoOx/NoH表示）、有氧呼吸（有氧有血紅素：150r/min搖床培養(yǎng)，黃漿水血紅素培養(yǎng)基，用Ox/H表示）2種條件下于37℃下培養(yǎng)24 h，于6、12、24 h測(cè)定菌種OD600值。

1.3.4 屎腸球菌R2有氧呼吸增殖條件單因素優(yōu)化

將活化后的屎腸球菌R2按3%接種量接入黃漿水血紅素培養(yǎng)基，通過(guò)測(cè)定OD600值來(lái)比較不同溫度（32、37、42 ℃）、轉(zhuǎn)速（125、150、175 r/min）、血紅素濃度（1.0、2.0、3.0 μg/mL）、初始 pH（5.6、5.9、6.2）對(duì)其增殖效果的影響。

1.3.5 屎腸球菌R2有氧呼吸增殖條件正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇溫度、轉(zhuǎn)速、血紅素濃度、初始pH值4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，以發(fā)酵液培養(yǎng)24 h的OD600值為檢測(cè)指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳增殖條件，因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.6 發(fā)酵劑菌粉的制備

分別以傳統(tǒng)發(fā)酵（No Ox/No H）和最適有氧呼吸（Ox/H）條件對(duì)屎腸球菌R2進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后取菌液置于離心管中，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心10 min后，棄去上清液，加適量生理鹽水溶解菌泥，添加冷凍保護(hù)劑（谷氨酸鈉5%、脫脂乳10%、蔗糖10%）[16]，于-80℃下過(guò)夜冷凍；取凍結(jié)菌泥放于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥，24 h后完全干燥成菌粉狀態(tài)，獲得純種酸漿發(fā)酵劑。

1.3.7 酸漿發(fā)酵劑品質(zhì)評(píng)價(jià)

活菌數(shù)的測(cè)定：參考GB4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[17]，測(cè)定兩種方式制備的發(fā)酵劑中的活菌數(shù)。

發(fā)酵性能的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取兩種發(fā)酵劑菌粉各0.1g分別接種到黃漿水培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)36 h，每隔8 h測(cè)量其pH值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，使用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和方差顯著性分析，圖形數(shù)據(jù)采用Origin2018軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 屎腸球菌R2在傳統(tǒng)發(fā)酵與有氧呼吸條件下的生長(zhǎng)曲線

屎腸球菌R2在傳統(tǒng)發(fā)酵與有氧呼吸條件下的生長(zhǎng)趨勢(shì)如圖1所示。

圖1 屎腸球菌R2在傳統(tǒng)發(fā)酵與有氧呼吸條件下的生長(zhǎng)趨勢(shì)Fig.1 Growth trends of E.faecium R2 under traditional fermentation and aerobic respiration conditions

結(jié)果表明，培養(yǎng)前6 h時(shí)，No Ox/No H與Ox/H兩種培養(yǎng)條件下菌種生長(zhǎng)量無(wú)顯著差異；培養(yǎng)12 h后，兩者出現(xiàn)顯著差異，Ox/H培養(yǎng)條件下的生物量顯著高于No Ox/No H條件下的生物量，說(shuō)明Ox/H培養(yǎng)條件對(duì)屎腸球菌R2的生長(zhǎng)沒(méi)有產(chǎn)生迫害作用，反而有促進(jìn)作用。PATRICK等[18]研究表明，當(dāng)血紅素和氧氣存在時(shí)，乳球菌最初的生長(zhǎng)是通過(guò)發(fā)酵代謝方式實(shí)現(xiàn)的，在培養(yǎng)8 h之后才將代謝方式轉(zhuǎn)換為有氧呼吸代謝，生物量繼續(xù)增加，可能細(xì)胞對(duì)血紅素的攝取等因素限制了對(duì)數(shù)前期細(xì)胞血紅色素的活性。

想要做好高校的內(nèi)部控制工作，從而做好高校的財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)管控，就必須要對(duì)內(nèi)部控制做好有效的監(jiān)督。對(duì)高校內(nèi)部控制進(jìn)行監(jiān)督可以保證高校內(nèi)部控制工作的合理性以及科學(xué)性，然而在我國(guó)的高校中，內(nèi)部控制的監(jiān)督工作基本上都是由財(cái)務(wù)內(nèi)部人員來(lái)進(jìn)行的，沒(méi)有做到讓專業(yè)的人員來(lái)進(jìn)行，從而會(huì)使得監(jiān)督流于形式，而且這種監(jiān)督方式是非常不科學(xué)的，監(jiān)督的結(jié)果也是難以令人滿意的。還有很多高校在內(nèi)部控制工作當(dāng)中沒(méi)有內(nèi)部控制的監(jiān)督機(jī)制，造成對(duì)內(nèi)部控制工作的管理極為不嚴(yán)謹(jǐn)，由于缺少有效的監(jiān)督，內(nèi)部控制工作一旦出現(xiàn)問(wèn)題可能不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)和上報(bào)，最終造成高校的財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)，從而影響到高校的財(cái)務(wù)風(fēng)險(xiǎn)管控工作正常運(yùn)作。

2.2 屎腸球菌R2有氧呼吸培養(yǎng)條件單因素優(yōu)化

2.2.1 溫度對(duì)屎腸球菌R2增殖的影響

在培養(yǎng)過(guò)程中，菌株生長(zhǎng)代謝的培養(yǎng)溫度，一方面直接影響到菌株細(xì)胞內(nèi)的各種酶活性[19]，控制菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用，從而影響菌種生物量。另一方面菌種生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生各種熱量，若發(fā)酵環(huán)境溫度過(guò)高，產(chǎn)生熱量不能及時(shí)消散，則會(huì)對(duì)菌種產(chǎn)生影響，抑制其的生長(zhǎng)。因此控制環(huán)境溫度可以改變菌種培養(yǎng)周期的時(shí)長(zhǎng)。溫度對(duì)屎腸球菌R2生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖2。

圖2 溫度對(duì)屎腸球菌R2生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of temperature on growth of E.faecium R2

從圖2可以看出，溫度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)影響屎腸球菌的生長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)，培養(yǎng)24 h后菌液的OD600值最高，生物量最大。

2.2.2 初始pH值對(duì)屎腸球菌R2增殖的影響

初始pH值可能影響乳酸菌膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和胞內(nèi)酶的活性，當(dāng)發(fā)酵液初始pH值下降到5.3左右時(shí)，菌株可從發(fā)酵代謝轉(zhuǎn)變?yōu)楦欣诰晟L(zhǎng)的有氧呼吸，生物量進(jìn)一步增加[18]。初始pH值對(duì)屎腸球菌R2生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖3。

如圖3所示，培養(yǎng)環(huán)境的初始pH值為5.9時(shí)，菌株有氧呼吸培養(yǎng)24 h后OD600值最高，生物量最大。施為家[19]研究表明，發(fā)酵液pH值會(huì)影響菌株胞內(nèi)積累血紅素的能力，進(jìn)而影響有氧呼吸的效率。

圖3 初始pH值對(duì)屎腸球菌R2生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of initial pH on growth of E.faecium R2

2.2.3 血紅素對(duì)屎腸球菌R2增殖的影響

圖4 血紅素濃度對(duì)屎腸球菌R2生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of heme concentration on growth of E.faecium R2

如圖4所示，在血紅素終濃度為2.0 μg/mL的有氧呼吸條件下培養(yǎng)24 h能獲得最大生物量，而高濃度的血紅素對(duì)菌株的生長(zhǎng)存在一定的抑制。

2.2.4 轉(zhuǎn)速對(duì)屎腸球菌R2增殖的影響

改變搖床的轉(zhuǎn)速可以改變菌株培養(yǎng)環(huán)境的含氧量。轉(zhuǎn)速對(duì)屎腸球菌R2生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖5。

圖5 轉(zhuǎn)速對(duì)屎腸球菌R2生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of rotate speed on growth of E.faecium R2

如圖5所示，恒溫?fù)u床轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)，OD600值最高，高于轉(zhuǎn)速125 r/min和175 r/min條件下的OD600值。研究表明，腸球菌在進(jìn)行有氧呼吸代謝時(shí)，如果通氣過(guò)多，未被利用的氧氣會(huì)對(duì)菌體細(xì)胞造成損傷[13]。

2.3 屎腸球菌R2有氧呼吸增殖條件正交試驗(yàn)優(yōu)化

屎腸球菌R2有氧呼吸增殖條件正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果及極差分析結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

從表2可以看出，以O(shè)D600為檢測(cè)指標(biāo)，按照極差大小各因素對(duì)屎腸球菌R2增殖效果影響的主次順序?yàn)椋篈＞D＞C＞B。按 A1B3C3D2條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示屎腸球菌R2培養(yǎng)24 h的OD600值為2.675，高于A2B3C1D2（正交試驗(yàn)中OD600值最高）。因此，屎腸球菌R2的最適增殖條件為溫度32℃、轉(zhuǎn)速175 r/min、血紅素添加量 3.0 μg/mL、初始 pH5.9。

2.4 發(fā)酵劑品質(zhì)評(píng)價(jià)

2.4.1 活菌數(shù)的測(cè)定

采用平板計(jì)數(shù)法分別測(cè)定Ox/H和No Ox/No H兩種方式獲得的發(fā)酵劑菌粉中的活菌數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 兩種培養(yǎng)條件下制備的菌粉的活菌數(shù)Fig.6 Viable counts of bacterial powers cultivated under condition different condition

結(jié)果表明采用No Ox/No H和Ox/H兩種方式獲得的發(fā)酵劑菌粉中的活菌數(shù)分別為1.22×108CFU/g和1.33×109CFU/g，后者明顯高于前者，說(shuō)明進(jìn)行有氧呼吸代謝的屎腸球菌R2具有更強(qiáng)的生存能力，與PATRICK等[18]的研究結(jié)論一致。

2.4.2 產(chǎn)酸性能的測(cè)定

研究表明，在通氣和添加外源血紅素的條件下，通過(guò)有氧呼吸代謝下生產(chǎn)出來(lái)的乳酸菌發(fā)酵劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)乳制品生產(chǎn)條件下生產(chǎn)的干酪或發(fā)酵乳的品質(zhì)的影響不大[19]。兩種培養(yǎng)方式制備的發(fā)酵劑菌粉的產(chǎn)酸性能如圖7所示。

圖7 兩種培養(yǎng)條件下制備的菌粉的產(chǎn)酸性能Fig.7 Acid-producing ability of bacterial powers cultivated under condition different condition

結(jié)果表明，采用No Ox/No H方式獲得發(fā)酵劑菌粉對(duì)黃漿水的發(fā)酵過(guò)程與采用No Ox/No H方式獲得發(fā)酵劑菌粉基本一致，在發(fā)酵36 h后pH值均下降到3.6左右。說(shuō)明采用No Ox/No H方式獲得的發(fā)酵劑菌粉仍具有較好的發(fā)酵特性。

3 結(jié)論

本文以O(shè)D600為檢測(cè)指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了屎腸球菌R2有氧呼吸增殖條件，并對(duì)屎腸球菌R2酸漿發(fā)酵劑品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。屎腸球菌R2有氧呼吸最適增殖條件為溫度32℃、轉(zhuǎn)速175 r/min、血紅素添加量3.0 μg/mL、初始pH 5.9。在這種條件下培養(yǎng)的屎腸球菌R2經(jīng)冷凍干燥制得酸漿發(fā)酵劑，該發(fā)酵劑的活菌數(shù)達(dá)到1.33×109CFU/g，產(chǎn)酸性能良好，可用于酸漿生產(chǎn)。