肝細(xì)胞來源的肝前體樣細(xì)胞對巨噬細(xì)胞的調(diào)控作用研究

彭媛 周徐 景宏舒 朱雪晶 史瑤平 王濤 崔丹 施東華 丁敏 鄢和新 翟博

人原代細(xì)胞可通過小分子組合逆轉(zhuǎn)化為肝前體樣細(xì)胞(HepLPC)，該細(xì)胞通過旁分泌作用可減輕動物的炎癥反應(yīng)并且促進(jìn)組織再生[1,2]。為了進(jìn)一步探究該細(xì)胞對炎癥損傷環(huán)境及組織修復(fù)潛在調(diào)節(jié)作用及機(jī)制，現(xiàn)采用藥物誘導(dǎo)原代巨噬細(xì)胞極化的體外模型進(jìn)行評價，以期為該細(xì)胞治療肝病的應(yīng)用提供可靠的體外驗證模型及參考依據(jù)。

材料與方法

一、材料與試劑

冷凍保存的原代肝細(xì)胞購自上海瑞德肝臟有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、青鏈雙抗、1640培養(yǎng)基購自上海源培生物科技股份有限公司；Trizol、Sybgreen、紅細(xì)胞裂解液購自上海碧云天生物科技公司；胎牛血清購自以色列Biological Industries公司；相關(guān)引物由上海華津生物合成。0.25% Trypsin-EDTA 購自美國Gibco公司；小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)及白介素4(IL-4)購自上海近岸生物；脂多糖購自美國Sigma公司；F4/80、CD11c、CD206抗體購自美國Biolegend公司；IL6、IL1β、iNOS、IL10 ELISA試劑盒均購自聯(lián)科生物。

二、實驗方法

(一)肝細(xì)胞來源的肝前體樣細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備 將冷凍保存的原代肝細(xì)胞，置于37℃水浴鍋中快速解凍離心處理，將細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和2%青鏈雙抗的肝細(xì)胞增殖培養(yǎng)基(TEM)中，然后將細(xì)胞置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。每2～3天更換一次新鮮TEM培養(yǎng)基；當(dāng)細(xì)胞覆率超過80%時使用0.25%的Trypsin-EDTA進(jìn)行消化，并按照1∶3的比例接種入新的培養(yǎng)皿中。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增到P3時，鏡下觀察細(xì)胞匯合率達(dá)80%，記錄細(xì)胞狀態(tài)，拍照并保存。將TEM培養(yǎng)基更換為無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，24 h后收獲細(xì)胞上清，300×g離心10 min后分裝保存于-20℃冰箱。

(二)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 將8～10周成年C57小鼠脊椎脫臼處死后，立即取股骨，分離后放入培養(yǎng)皿中。去除股骨周圍的其余組織，1640培養(yǎng)基10%胎牛血清和5%青鏈雙抗清洗兩遍。用1 mL注射器吸取1640培養(yǎng)基沖洗股骨髓腔，將骨髓沖洗下來，用移液槍將骨髓團(tuán)塊沖散，用70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，500×g離心5 min。棄上清，用紅細(xì)胞裂解液重懸，靜置5 min，500×g離心5 min。棄上清，用1640培養(yǎng)基重懸，再離心，重復(fù)兩遍。棄上清，用1640培養(yǎng)基重懸后計數(shù)，按(8～10)×105/孔接種入12孔板。接種時加入小鼠GM-CSF 40 ng/mL。接種6～8 h后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入新的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每3天更換新鮮培養(yǎng)基：1640培養(yǎng)基10%胎牛血清和5%青鏈雙抗+小鼠GM-CSF 40 ng/mL。培養(yǎng)至第7天，巨噬細(xì)胞分化成熟。

(三)巨噬細(xì)胞體外定向極化誘導(dǎo)與鑒定 巨噬細(xì)胞經(jīng)7 d誘導(dǎo)分化成熟后，LPS 100 ng/mL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為M1型亞群；IL-4 40ng/mL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為M2型亞群。分別用不同細(xì)胞因子刺激6 h后，胰酶消化巨噬細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表面標(biāo)志物的鑒定，另外收取RNA以及細(xì)胞上清樣本，用于后續(xù)的實驗處理。

(四)HepLPC-CM與不同巨噬細(xì)胞亞群共孵育 將凍存?zhèn)溆玫腍epLPC-CM在4℃條件融化恢復(fù)至室溫，加入10%胎牛血清和2%青鏈雙抗。在LPS/IL4誘導(dǎo)6 h的基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)上清換成HepLPCs-CM，再孵育6 h后，收取RNA樣本和細(xì)胞上清，用于后續(xù)的實驗處理。

(五)流式細(xì)胞術(shù) 巨噬細(xì)胞鑒定：收集細(xì)胞，消化離心后分別加入F4/80抗體與同行對照抗體，4℃避光孵育30 min，加入PBS，離心去上清，加入500 μL PBS上機(jī)。M1型巨噬細(xì)胞鑒定：收集兩種巨噬細(xì)胞亞群，在LPS誘導(dǎo)6 h的巨噬細(xì)胞中同時加入F4/80和CD11c抗體以及同行對照抗體，在IL4誘導(dǎo)6 h的巨噬細(xì)胞中加入F4/80及CD206抗體以及同行對照抗體；4℃避光孵育30 min，PBS清洗，離心去上清，加入500 μL PBS準(zhǔn)備上機(jī)。

(六)實時熒光定量PCR 使用Trizol試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，并以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行內(nèi)部控制計算相關(guān)基因的表達(dá)量。PCR系統(tǒng)設(shè)置參數(shù)為20 μL體系，95℃ 5 min、95℃ 15 s、95℃ 5 min、60℃ 15 s、35 s，共40個循環(huán)；循環(huán)后使用機(jī)器默認(rèn)程序進(jìn)行熔解曲線采樣。后按照ΔΔCt方法分析基因轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)并歸一化到管家基因GAPDH。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

(七)ELISA檢測炎性相關(guān)因子 采用ELISA試劑盒進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL6、IL1β、iNOS、IL10因子的濃度檢測，在說明書指導(dǎo)下進(jìn)行。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、原代巨噬細(xì)胞及其亞群的細(xì)胞鑒別

GM-CSF刺激BMDM貼壁第 7天，顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)良好，見圖1。

(一)不同巨噬細(xì)胞亞群定向分化后表面標(biāo)志物表達(dá) BMDM在GM-CSF刺激第7天時，分別采用LPS(100 ng/mL)、IL-4 (40 ng/mL)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為M1、M2型亞群；刺激6 h后采用胰酶消化巨噬細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)。F4/80+是巨噬細(xì)胞總標(biāo)記抗體，CD11c+是M1表型標(biāo)志物，CD206是M2表型標(biāo)志物。

F4/80+表達(dá)占比92.8%，即總巨噬細(xì)胞占比92.8%，符合BMDM實驗細(xì)胞純度，可在此基礎(chǔ)上進(jìn)行后續(xù)實驗。LPS(100 ng/mL)刺激BMDM 6h時，F(xiàn)4/80+，CD11c+表達(dá)占比88.1%，即M1型巨噬細(xì)胞占比88.1%。IL4(40 ng/mL)刺激BMDM 6 h時，F(xiàn)4/80+，CD206+表達(dá)占比97.0%，即M2型巨噬細(xì)胞占比97.0%。

A:×10；B:×20圖1 GM-CSF刺激BMDM貼壁7 d光學(xué)顯微下表現(xiàn)

(二)不同巨噬細(xì)胞亞群定向分化后相關(guān)基因表達(dá) 細(xì)胞在LPS(100 ng/mL)條件下處理6 h后，M1相關(guān)基因表達(dá)均上調(diào)，LPS(100 ng/mL)處理6 h后的BMDM，IL6表達(dá)上調(diào)為823.200±174.500，IL1β表達(dá)上調(diào)為8.389±0.029，iNOS表達(dá)上調(diào)為24.650±1.196；而未處理的對照組細(xì)胞分別為1.054±0.473、1.000±0.026、1.015±0.244。

將細(xì)胞用IL4(40 ng/mL)處理6 h后，M2相關(guān)基因在IL4刺激下均上升，相對于未處理的BMDM，IL4(40 ng/mL)處理6 h后的BMDM，CD206表達(dá)上調(diào)為114.000±3.579，IL10表達(dá)上調(diào)為2.634±0.028，ARG1表達(dá)上調(diào)為53.260±8.083；未處理的BMDM細(xì)胞中的表達(dá)分別為1.005±0.140，1.098±0.640，1.000±0.027。

二、HepLPC-CM抑制M1型巨噬細(xì)胞的極化

(一)HepLPC-CM共培養(yǎng)后，M1型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因的表達(dá)顯著下降 在誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞的基礎(chǔ)上，用HepLPC-CM處理6h，收集相應(yīng)RNA樣本，進(jìn)行基因表達(dá)分析。相對于陽性對照處理組，在HepLPC-CM處理條件下，M1相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào)。HepLPCs-CM 處理6 h，IL6表達(dá)為346.300±20.810，IL1β表達(dá)為11.290±0.10，iNOS表達(dá)為169.800±9.711；而陽性對照處理組分別為1207.000±115.700、83.500±0.066、807.100±42.190。

(二)HepLPC-CM共培養(yǎng)后，M1型巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎性因子的表達(dá)水平下降 收集上述處理條件的細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本，ELISA檢測上清樣本中相應(yīng)炎性因子的表達(dá)。相對于陽性對照處理組，在HepLPC-CM處理條件后，上清中炎性因子分泌減少。IL6分泌為(138.700±32.130)pg/(mL×105cell)，IL1β分泌為(0.710±0.019)pg/(mL×105cell)，iNOS分泌為(0.095±0.001)pg/(mL×105cell)；而陽性對照處理組分別為242.100±0.187/5.108±0.018、(10.020±0.653)pg/(mL×105cell)。

三、HepLPC-CM可促M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物及基因的表達(dá)

(一)HepLPC-CM促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)標(biāo)志物及基因的表達(dá) 在誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞的基礎(chǔ)下，HepLPCs-CM處理6h，收集相應(yīng)RNA樣本，進(jìn)行基因表達(dá)分析。相對于陽性對照處理組，HepLPCs-CM處理條件下，M2相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。HepLPCs-CM 處理6h，CD206表達(dá)為40.88±0.1768，IL10表達(dá)為22.2±0.1414，ARG1表達(dá)為32.25±0.2121；而陽性對照處理組分別為33.65±0.465、10.277±0.169、25.060±0.585。

(二)HepLPCs-CM促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞組織修復(fù)相關(guān)因子IL-10的表達(dá) 收集上述處理條件的細(xì)胞培養(yǎng)上清樣本，ELISA檢測上清樣本中相應(yīng)炎性因子的表達(dá)。相對于陽性對照處理組，在HepLPCs-CM處理條件后，檢測上清中炎性因子IL10分泌增加。IL10分泌為108.052±0.472 pg/(mL×105cell)

討 論

免疫效應(yīng)細(xì)胞在微環(huán)境因素的刺激下會分化成具有不同表型的亞細(xì)胞型[3]，這些亞型細(xì)胞在不同的免疫微環(huán)境中表現(xiàn)出的不同應(yīng)答狀態(tài)和功能表型，對疾病的發(fā)生發(fā)展起著重要作用。作為免疫細(xì)胞中極為重要的一類細(xì)胞，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為在不同因素誘導(dǎo)下可出現(xiàn)兩種經(jīng)典的細(xì)胞亞群，即M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞[4]。二者功能截然不同，M1型巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎癥反應(yīng)，通過產(chǎn)生大量促炎性細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α、IL-6以及一氧化氮(nitrogen monoxide,NO)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)介導(dǎo)機(jī)體的炎癥反應(yīng)；M2型巨噬細(xì)胞主要產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子IL-10等，參與Th2 細(xì)胞型免疫應(yīng)答，抑制炎癥和纖維化，在組織的修復(fù)過程中具有重要作用[5]。越來越多的證據(jù)表明不同巨噬細(xì)胞亞群在肝病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[6]。在非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪肝炎(NASH)中，巨噬細(xì)胞參與脂肪變性、炎癥和纖維化[7]。在急性肝損傷中，巨噬細(xì)胞被激活，導(dǎo)致細(xì)胞因子和趨化因子的釋放。肝巨噬細(xì)胞根據(jù)損傷的階段發(fā)揮不同的功能，可能加重?fù)p傷或促進(jìn)組織修復(fù)過程[8]。因此通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞亞群介導(dǎo)的炎癥損傷與組織修復(fù)反應(yīng)可能是治療肝病的一種新型策略。

本研究團(tuán)隊在前期工作中，通過小分子組合將人原代細(xì)胞可逆轉(zhuǎn)化為HepLPC。該細(xì)胞在體外可規(guī)模化培養(yǎng)，有望成為治療肝病的細(xì)胞來源。為了進(jìn)一步

探究該細(xì)胞潛在的作用機(jī)制，采用原代巨噬細(xì)胞體外極化模型進(jìn)行了探究。研究顯示，HepLPC的條件培養(yǎng)基可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性活化，顯著減低炎癥相關(guān)因子的基因及分泌蛋白表達(dá)，并且可促進(jìn)IL4誘導(dǎo)的修復(fù)型M2巨噬細(xì)胞基因的表達(dá)以及抗炎因子IL-10小幅度的增高。

本研究顯示，HepLPC可以以旁分泌的形式通過影響巨噬細(xì)胞亞群的變化，起到抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)組織修的作用。本實驗主要通過體外巨噬細(xì)胞的極化模型為HepLPC進(jìn)行體內(nèi)治療應(yīng)用提供了體外評價模型以及參考依據(jù)，不過肝臟病理微環(huán)境十分復(fù)雜，涉及多種免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，后續(xù)可通過動物實驗研究，驗證其對于肝病的治療作用，為廣大肝病患者提供新型的治療手段。