潰瘍性結(jié)腸炎中小鼠腸道菌群和M1型巨噬細(xì)胞異常激活的關(guān)系研究

秦和平，石 喆，韋天靈，萬(wàn) 敏，潘信義，廖耀云，陳祖平

(柳州市人民醫(yī)院，廣西 柳州 545006)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是發(fā)生在結(jié)直腸的一類慢性非特異性炎癥，近10年來(lái)，該病在我國(guó)的發(fā)病率逐年提高[1]。由于UC的致病原因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上無(wú)特異性治療方法，多采用對(duì)癥治療以緩解病情，因此其病情容易反復(fù)，難以根治，且隨著病程增加，結(jié)腸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)也大大提高[2]。目前認(rèn)為腸道菌群失調(diào)及巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答異常在UC的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用，研究者通過(guò)糞便菌群移植(FMT)改善失調(diào)的腸道菌群能在一定程度上改善實(shí)驗(yàn)對(duì)象的黏膜病變情況、疾病活動(dòng)指數(shù)、降低炎癥水平等[3]。同時(shí)，靶向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫活性能有效改善UC患者的臨床癥狀和腸道組織學(xué)病變[4]。研究證實(shí)，M1型巨噬細(xì)胞可以被革蘭陰性菌產(chǎn)物脂多糖(LPS)激活，進(jìn)而釋放大量促炎細(xì)胞因子參與異常的免疫調(diào)控反應(yīng)，參與誘導(dǎo)UC形成[5]。但腸道菌群和M1型巨噬細(xì)胞異常激活在UC發(fā)病中的關(guān)系還不明確。為此，本研究擬從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行研究，旨在探討腸道菌群和M1型巨噬細(xì)胞異常激活的關(guān)系，為UC臨床治療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用雄性BALB/c小鼠( 購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0002) ，7～8周齡，18～22 g，共60只，SPF級(jí)。隨機(jī)數(shù)表法分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各30只，實(shí)驗(yàn)組制備DSS結(jié)腸炎小鼠模型，對(duì)照組無(wú)處理。實(shí)驗(yàn)前所有小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為20～24℃，相對(duì)濕度為55%～60%，自由飲水及日常光照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DSS結(jié)腸炎小鼠模型制備 實(shí)驗(yàn)前24 h小鼠禁食不禁水，24 h后將小鼠空中懸尾，使其通過(guò)掙扎排凈腸道糞便。24 h后實(shí)驗(yàn)組小鼠給予5%DSS溶液(其中DDS購(gòu)自MP Biomedicals公司，將DSS溶于蒸餾水中配制成5%DSS溶液)自由飲用，連續(xù)14 d，形成DSS結(jié)腸炎小鼠模型。

1.2.2 菌群分析 取兩組小鼠的糞便，使用DNA提取試劑盒(北京紐樸生物技術(shù)有限公司)對(duì)糞便菌群進(jìn)行總DNA提取，提取后的DNA樣本送吉?jiǎng)P基因生物有限公司進(jìn)行16SrRNA測(cè)序分析與菌群鑒定，質(zhì)檢合格后使用16S rRNAV4區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)NanoDrop檢測(cè)合格后使用美國(guó)Illumina公司的Solexa第二代高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序。測(cè)序完成后采用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)分析樣本，主要對(duì)腸道菌群進(jìn)行物種對(duì)比和注釋，使用BugBase進(jìn)行表型預(yù)測(cè)，并對(duì)菌群α多樣性進(jìn)行分析。菌群α多樣性指標(biāo)包括菌群豐度指標(biāo)(Chao1和ACE)以及菌群多樣性(Shannon和Simpson指數(shù))，其中，Chao1和ACE值越大代表物種總數(shù)越多；Shannon值越大或Simpson 指數(shù)值越小，說(shuō)明群落多樣性越高。

1.2.3 糞便菌群移植 DSS結(jié)腸炎小鼠模型建立后第1天，將BALB/c健康小鼠糞便菌群移植到DSS結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)，24 h后頸椎脫臼法處死小鼠；同時(shí)，將DSS結(jié)腸炎小鼠的糞便菌群移植到BALB/c健康小鼠體內(nèi)，24 h后頸椎脫臼法處死小鼠。實(shí)驗(yàn)組取病變部位、對(duì)照組小鼠取對(duì)應(yīng)腸段的結(jié)腸黏膜組織切片均行HE染色及免疫組化染色標(biāo)識(shí)M1型巨噬細(xì)胞，對(duì)M1型巨噬細(xì)胞的免疫組化染色情況進(jìn)行評(píng)估。

1.2.4 M1型巨噬細(xì)胞免疫組化染色分析 所取結(jié)腸黏膜組織蠟塊行切片、二甲苯脫蠟、乙醇脫二甲苯、水化等操作。浸入PH6.0的檸檬酸緩沖液加熱至98℃ 12 min修復(fù)抗原，滴加一抗iNOS抗體(EPR16635, Abcam, Cambridge, MA, USA)和通用型二抗IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育30 min,評(píng)估染色情況。iNOS蛋白的表達(dá)模式為細(xì)胞漿。染色強(qiáng)度分值如下：0分(無(wú)染色)、1分(淺黃色，弱陽(yáng)性)、2分(黃棕色，中陽(yáng)性)；3分(棕色，強(qiáng)陽(yáng)性)。陽(yáng)性細(xì)胞百分比分值為：0(無(wú)細(xì)胞陽(yáng)性)、1分(<25%細(xì)胞陽(yáng)性)、2分(25%～50%細(xì)胞陽(yáng)性)和3分(>50%細(xì)胞陽(yáng)性)，染色情況總分?jǐn)?shù)為染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞分值的乘積?？偡种?3分定義為蛋白低表達(dá)，≥3分定義為蛋白高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠糞便菌群的LEfSe分析 16S RNA分析結(jié)果顯示，兩組小鼠的糞便菌群分布存在明顯差異。實(shí)驗(yàn)組中，擬桿菌、克雷伯桿菌、變形桿菌、無(wú)色桿菌屬等占主要優(yōu)勢(shì)(LDA>log10)，而對(duì)照組中以乳酸桿菌屬、小類桿菌屬、埃希菌屬等占主要優(yōu)勢(shì)。

移植前，UC組小鼠腸道中在門水平，擬桿菌門、變形菌門及β-變形亞菌門是優(yōu)勢(shì)菌群，在綱水平，擬桿菌綱是優(yōu)勢(shì)菌群，在目水平，擬桿菌目、放線菌目、芽孢桿菌目是優(yōu)勢(shì)菌群，在科水平，擬桿菌科、布坦堡菌科、鏈球菌科是優(yōu)勢(shì)菌群，在屬水平，擬桿菌屬、微桿菌屬、無(wú)色菌屬、克雷伯氏菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬是優(yōu)勢(shì)菌群；對(duì)照組中在門水平，厚壁菌門、負(fù)菌門(革蘭氏陰性的厚壁菌門)、γ-變形菌門是優(yōu)勢(shì)菌群，在綱水平，梭菌綱、是優(yōu)勢(shì)菌群，在目水平，乳桿菌目、梭菌目、腸桿菌目是優(yōu)勢(shì)菌群，在科水平，普雷沃特菌科、乳桿菌科、毛螺桿菌科、氨基酸球菌科、腸桿菌科是優(yōu)勢(shì)菌群，在屬水平，乳酸桿菌屬、小類桿菌屬、埃希菌屬是優(yōu)勢(shì)菌群。

移植前，UC組小鼠腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群，在屬水平是克雷伯氏菌屬、無(wú)色菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、擬桿菌屬、微桿菌屬，在科水平是擬桿菌科、鏈球菌科、布坦堡菌科，在目水平是擬桿菌目、放線菌目、芽孢桿菌目，在綱水平是擬桿菌綱，在門水平是β-變形菌門及變形菌門；對(duì)照組中優(yōu)勢(shì)菌群屬水平是埃希氏菌屬、小類桿菌屬，在科水平是腸桿菌科、乳桿菌科、氨基酸球菌科、毛螺桿菌科、普雷沃特菌科，在目水平是腸桿菌目、乳桿菌目、月形單胞菌目、梭菌目，在門水平是γ-變形菌門、負(fù)菌門(革蘭氏陰性的厚壁菌門)。

2.2 兩組小鼠糞便菌群α多樣性的對(duì)比 實(shí)驗(yàn)組小鼠的Chao1、ACE指數(shù)及Simpson指數(shù)明顯高于對(duì)照組，Shannon指數(shù)明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組小鼠菌群α多樣性指標(biāo)的對(duì)比

2.3 兩組小鼠糞便菌群移植后腸粘膜M1型巨噬細(xì)胞的病理結(jié)果對(duì)比 將對(duì)照組小鼠的糞便菌群移植到實(shí)驗(yàn)組小鼠后，實(shí)驗(yàn)組小鼠腸黏膜M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著降低，見(jiàn)圖1；將實(shí)驗(yàn)組小鼠的糞便菌群移植到對(duì)照組小鼠后，對(duì)照組小鼠腸黏膜M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 移植前UC組小鼠糞便菌群腸黏膜組織M1型巨噬細(xì)胞的HE(×100)及免疫組化染色結(jié)果(×100)

表2 兩組小鼠糞便菌群移植后腸粘膜M1型巨噬細(xì)胞的病理結(jié)果對(duì)比

2.4 不同病原菌水平與M1型巨噬細(xì)胞水平的相關(guān)性 擬桿菌、克雷伯桿菌、變形桿菌、無(wú)色桿菌等病原菌相對(duì)豐度與小鼠糞便菌群移植前腸黏膜M1型巨噬細(xì)胞的病理評(píng)分對(duì)比均呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同病原菌水平與小鼠糞便菌群移植前腸黏膜M1型巨噬細(xì)胞病理評(píng)分的相關(guān)性

2.5 不同病原菌水平與M1型巨噬細(xì)胞水平的多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析顯示，擬桿菌水平是小鼠糞便菌群移植前腸黏膜M1型巨噬細(xì)胞水平的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表4。

表4 不同病原菌水平與M1型巨噬細(xì)胞水平的多因素Logistic回歸分析

3 討論

腸道菌群失調(diào)和免疫異常在UC發(fā)病中均被認(rèn)為有重要作用。但由于尚未明確UC致病的特定菌種，因此目前認(rèn)為腸道菌群失調(diào)后協(xié)同作用共同參與UC致病[6]。而巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中十分重要的一類免疫細(xì)胞，具有吞噬病原體、抗原呈遞、分泌細(xì)胞因子等多種作用，其M1亞型異常激活被認(rèn)為是UC發(fā)生的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[7-8]。

巨噬細(xì)胞被周圍微環(huán)境中的T淋巴細(xì)胞輔助因子和病原體等極化后可分化為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞。其中M1型巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮促炎作用，LPS是該類巨噬細(xì)胞最有效的激活信號(hào)，LPS通過(guò)與M1型巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體4(TLR4)作用，激活MyD88和MaL/TirapM2依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而促進(jìn)炎性因子釋放，如IFN-b, IL-12,TNF,IL-6和IL-1β等，發(fā)揮促炎作用[9-10]。因此革蘭氏陰性菌在巨噬細(xì)胞極化為M1型巨噬細(xì)胞的發(fā)育中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在UC中，結(jié)腸黏膜的固有層存在較多M1 型巨噬細(xì)胞，這些巨噬細(xì)胞較正常結(jié)腸黏膜內(nèi)的巨噬細(xì)胞有更高的激活狀態(tài)，對(duì)細(xì)菌及其產(chǎn)物表現(xiàn)為高敏感性，能產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子[11-12]。由于UC中同時(shí)存在異常數(shù)量及活性的菌群，我們推測(cè)這些異常的菌群可能通過(guò)LPS等方式異常激活M1型巨噬細(xì)胞，從而在UC發(fā)病中發(fā)揮作用。M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)用于促進(jìn)一氧化氮合成，此外其細(xì)胞表面還特異性表達(dá)共刺激因子CD16/32等，因此這些標(biāo)記物可用于M1型巨噬細(xì)胞的鑒別標(biāo)記[13]。

本研究通過(guò)對(duì)DSS結(jié)腸炎動(dòng)物模型研究，發(fā)現(xiàn)DSS結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群總數(shù)明顯增加，但多樣性明顯降低，提示DSS結(jié)腸炎小鼠存在明確的菌群失調(diào)現(xiàn)象，且失調(diào)菌群中以擬桿菌、克雷伯桿菌、變形桿菌、無(wú)色桿菌屬等占主要優(yōu)勢(shì)。腸道的正常菌群不但可以對(duì)其他菌群產(chǎn)生生物拮抗作用，防止致病菌的異常攻擊，正常菌群之間還存在活性功能等相互制約，保持生物個(gè)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[14]。當(dāng)菌群失調(diào)發(fā)生后，菌群間的制約能力及防御外來(lái)菌的能力均下降，腸道黏膜便成為被攻擊的對(duì)象而產(chǎn)生諸類病理反應(yīng)[15]。此外，通過(guò)對(duì)M1型巨噬細(xì)胞的免疫組化標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，在DSS結(jié)腸炎小鼠的腸道中M1型巨噬細(xì)胞特異性的標(biāo)記物均明顯增多，提示DSS結(jié)腸炎小鼠的M1型巨噬細(xì)胞較正常小鼠黏膜明顯增多。M1型巨噬細(xì)胞即經(jīng)典的巨噬細(xì)胞亞型，主要被微生物產(chǎn)物L(fēng)PS等和炎性因子激活，發(fā)揮高效的抗原呈遞作用，釋放促進(jìn)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，直接發(fā)揮促炎作用或促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答引起炎癥反應(yīng)[16-18]?？梢?jiàn)在UC中，失調(diào)菌群和異常激活的M1型巨噬細(xì)胞均有重要致病作用。

此外，將正常小鼠的糞便菌群移植到DSS結(jié)腸炎小鼠后，其腸黏膜M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著降低，而將DSS結(jié)腸炎的糞便菌群移植到正常小鼠后，其腸黏膜M1型巨噬細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，提示在UC中腸道菌群的變化與M1型巨噬細(xì)胞異常激活存在關(guān)聯(lián)，且相關(guān)性分析證明擬桿菌(在M1型巨噬細(xì)胞異常激活中有更為重要的誘導(dǎo)作用。當(dāng)菌群失調(diào)后，正常菌群對(duì)擬桿菌(原為大腸桿菌)的拮抗作用降低，使得擬桿菌的致病力和侵襲性增強(qiáng)，從而對(duì)腸道黏膜造成攻擊[19]。由于UC是一種非特異性炎癥，因此推測(cè)擬桿菌等致病菌對(duì)UC的致病并非直接感染，而是通過(guò)激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生異常的免疫反應(yīng)。LPS是大腸桿菌的常見(jiàn)產(chǎn)物，其恰好能通過(guò)對(duì)M1型巨噬細(xì)胞的異常激活形成異常的免疫應(yīng)答，繼而促進(jìn)Th1類淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答作用發(fā)揮[20]。國(guó)外學(xué)者Stout等人[21]研究發(fā)現(xiàn)在特定病原體存在情況下，體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)可激活成為M1型巨噬細(xì)胞，提示確實(shí)存在異常的病原菌可以通過(guò)LPS機(jī)制誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞的異常激活，驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。由于本研究結(jié)果尚局限于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物階段，有待于行進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)以證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及推論。

綜上所述，DSS結(jié)腸炎小鼠存在腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象，其菌群失調(diào)，尤其是擬桿菌與M1型巨噬細(xì)胞異常激活有直接相關(guān)性，健康小鼠糞便菌群的移植能夠抑制DSS結(jié)腸炎小鼠M1型巨噬細(xì)胞的異常激活。