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    PCV2 Cap蛋白刺激PBMCs中IL-21和IL-17A基因轉(zhuǎn)錄水平的變化

    2021-07-12 01:35:20朱艷平李文明郭東光孟廣超王選年
    湖南農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年4期
    關(guān)鍵詞:定量峰值熒光

    朱艷平,劉 佳,2,何 勇,岳 鋒,李文明,2,郭東光,孟廣超,王選年,2

    (1.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院 動物疫病分子診斷河南省工程實驗室,河南 新鄉(xiāng) 453003; 2.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南 鄭州 450000)

    豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是目前危害世界養(yǎng)豬業(yè)的主要病毒之一,其致病力與毒株類型直接相關(guān)。PCV2分型的依據(jù)是ORF2的序列差異。PCV2主要包括PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e 5個亞型,其中PCV2b是當(dāng)前主要流行的基因型[1-2]。當(dāng)前國內(nèi)呈現(xiàn)不同基因亞型同時流行的新形勢[1,3-4],PCV2a和PCV2b混合感染增多,PCV2d感染也出現(xiàn)增加趨勢,并且呈現(xiàn)出成為感染主要亞型的趨勢[5]。為控制PCV2引起的相關(guān)疾病,減輕養(yǎng)豬業(yè)的重大經(jīng)濟損失,世界各地都廣泛接種PCV2疫苗。因此,有必要研究新的疫苗或疫苗佐劑,用于PCV2的預(yù)防。

    PCV2基因組包含11個重疊的開放閱讀框(open reading frame,ORF),其中ORF1和ORF2是PCV2復(fù)制和發(fā)病所需的主要結(jié)構(gòu)和功能蛋白[6]。ORF1編碼病毒DNA環(huán)狀復(fù)制所必需的Rep和Rep’蛋白。PCV2的ORF2編碼的Cap蛋白是PCV2的唯一結(jié)構(gòu)蛋白,也是主要免疫原性蛋白,包含若干個主要保護性抗原的線性B細(xì)胞表位及中和性抗原表位,常被研制成PCV2亞單位疫苗應(yīng)用于生產(chǎn)[7]。各公司疫苗的免疫效果各不相同,其中,疫苗抗原和佐劑發(fā)揮了重要作用。目前,PCV2疫苗佐劑的研究主要集中在脂質(zhì)體和細(xì)胞因子等方面[8-9],其中,細(xì)胞因子佐劑是重點研究對象,包括白細(xì)胞介素2(Interleukin-2,IL-2)、IL-18、干擾素γ(Interferon γ,IFN-γ)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等。目前,IL-21作為疫苗佐劑的研究較少,但其具有正向調(diào)節(jié)機體免疫應(yīng)答的功能,可用于疫苗佐劑的開發(fā)。

    PCV2感染時,IL-17表達(dá)水平上升[6],這是IL-6與其受體結(jié)合活化輔助性T細(xì)胞17(Th17細(xì)胞)的結(jié)果。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17和IL-21,而IL-21能夠增強B細(xì)胞分泌抗體的能力,還能促進Th17細(xì)胞分化,分泌IL-17和IL-21[10]。目前,PCV2 Cap蛋白刺激細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平變化的研究,主要包括IL-2、IFN-γ、IL-10等[6,11-12],還未見關(guān)于IL-21和IL-17A的報道。因此,以豬IL-17A和IL-21基因為研究對象,檢測PCV2 Cap蛋白刺激的PBMCs中IL-17A和IL-21的轉(zhuǎn)錄水平,并初步研究調(diào)節(jié)IL-17A和IL-21的機制,為后期開發(fā)疫苗增強劑以及研究PCV2 Cap蛋白刺激過程中IL-21與其他細(xì)胞因子的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 試驗動物 3月齡健康的PCV2抗體陰性的長白仔豬2頭,體重為15 kg,購自新鄉(xiāng)某豬場。

    1.1.2 PCV2 以及PCV2 Cap蛋白 PCV2由新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院和生物技術(shù)研究中心從臨床分離、保存;PCV2 Cap蛋白由新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院和生物技術(shù)研究中心制備、保存。

    1.1.3 主要試劑 RNA抽提試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTPs和TB Green Premix Ex Ⅱ(寶生物工程(大連)有限公司),Trizol(北京索萊寶生物科技有限公司)。

    1.1.4 主要儀器 倒置顯微鏡(德國ZEISS公司)、熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司)、超純水儀(美國MILLIPORE公司)、全自動制冰機(日本Panasonic公司)、大容量水平離心機(美國Thermo Fisher公司)、微型離心機(北京昊諾斯生物有限公司)。

    1.2 試驗方法

    1.2.1IL-21和IL-17A實時熒光定量PCR引物的設(shè)計與合成 根據(jù) GenBank中β-actin、IL-17A、IL-21和PD-L1的基因序列,使用DNAMAN 6.0軟件設(shè)計熒光定量PCR特異性引物,用于擴增目的片段,引物設(shè)計后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1。

    表1 IL-21、IL-17A和 β-actin的實時熒光定量PCR引物序列

    1.2.2 實時熒光定量PCR檢測PCV2感染豬PBMCs中IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄變化 通過前腔靜脈采集健康豬抗凝血,按照何勇等[13]的方法分離PBMCs。將獲得的PBMCs在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用PCV2體外感染PBMCs后,分別在感染后12、24、36、48、60、72 h收取細(xì)胞,采用RNA提取試劑盒提取PCV2感染后PBMCs的RNA,進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄步驟如下:37℃孵育15 min,85℃水浴5 s,4℃冷卻,即為cDNA。利用設(shè)計的實時熒光定量PCR引物,進行β-actin、豬IL-17A和IL-21的實時熒光定量PCR,檢測IL-17A和IL-21的表達(dá)水平。實時熒光定量PCR擴增體系(總體積20 μL):TB Green Premix Ex Ⅱ 10 μL,PCR Forward Primer 0.8 μL,PCR Reverse Primer 0.8 μL,ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL,DNA 2 μL,無菌水6 μL。實時熒光定量PCR擴增程序:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,60℃反應(yīng)34 s,共40個循環(huán)。每次循環(huán)結(jié)束進行熒光信號的檢測,每個樣品3個重復(fù)。以β-actin作為內(nèi)源性對照,采用2-ΔΔCt分析方法計算IL-21和IL-17A的相對表達(dá)值,并將正常對照組時mRNA含量定義為1倍,可得出不同時間點IL-21和IL-17A的轉(zhuǎn)錄水平。

    1.2.3 實時熒光定量PCR檢測PCV2 Cap蛋白刺激豬PBMCs中IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄變化 將PCV2 Cap蛋白按0.2 μg/mL刺激分離的PBMCs,同時設(shè)置細(xì)胞對照,每個樣品3個重復(fù),輕輕搖勻,放入37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中吸附培養(yǎng)60 min;用PBS洗去未吸附的蛋白,將處理后的PBMCs加入RPMI1640培 養(yǎng) 基(包 含 有6 μg/mL的ConA、2%的 胎牛血清、無菌PCV2抗體陰性豬血清)進行培養(yǎng);分別在12、24、36、48、60、72 h收取細(xì)胞,按照1.2.2建立的方法檢測PCV2 Cap蛋白刺激的豬PBMCs中IL-21和IL-17A的轉(zhuǎn)錄水平,分析其轉(zhuǎn)錄水平變化情況。

    1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 PCV2和PCV2 Cap蛋白刺激豬PBMCs中PD-L1基因的轉(zhuǎn)錄水平變化 為研究IL-21和IL-17A基因轉(zhuǎn)錄水平變化的機制,根據(jù)Yue等[14]建立的實時熒光定量PCR方法,檢測PCV2和PCV2 Cap蛋白刺激的豬PBMCs中PD-L1基因的轉(zhuǎn)錄水平變化情況,初步分析IL-21和IL-17A基因轉(zhuǎn)錄水平變化的調(diào)節(jié)機制。

    1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

    采用IBM SPSS Statistics 26軟件進行統(tǒng)計分析,試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,并用獨立樣本t檢驗分析結(jié)果進行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 實時熒光定量PCR檢測PCV2刺激豬PBMCs中IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄變化水平

    如圖1所示,IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào),并且在60~72 h上調(diào)最明顯(P<0.01),其中60 h轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到峰值,48 h轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最低值。IL-21mRNA在12~24 h、60~72 h上調(diào)明顯(P<0.01),其中60 h轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到峰值,如圖1A所示。IL-17A mRNA在12~36 h、60~72 h上調(diào)明顯(P<0.01),其中60 h轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到峰值,48 h達(dá)到最低值,如圖1B所示。因此,由圖1可知,PCV2刺激PBMCs后IL-21和IL-17A的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào),并且在12~24 h、60~72 h上調(diào)明顯(P<0.01),60 h達(dá)到峰值,其中48 h降低至最低。以上結(jié)果說明PCV2在體外能夠提高細(xì)胞因子IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄水平。

    圖1 PCV2刺激豬PBMCs中IL-21和IL-17A的轉(zhuǎn)錄變化

    2.2 實時熒光定量PCR檢測PCV2 Cap 蛋白刺激豬PBMCs中IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄變化水平

    如圖2所示,IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào),并且在60~72 h上調(diào)最明顯(P<0.01),其中60 h轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到峰值,48 h轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最低值。IL-21mRNA在12~24 h、60~72 h上調(diào)明顯(P<0.01),其中60 h轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到峰值,48 h達(dá)到最低值,甚至低于正常細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平,如圖2A所示。IL-17A mRNA在12~36 h、60~72 h上調(diào)明顯(P<0.01),其中60 h轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到峰值,48 h達(dá)到最低,如圖2B所示。因此,由圖2可知,PCV2 Cap蛋白刺激后IL-21和IL-17A基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào),并且在12~24 h、60~72 h上調(diào)明顯(P<0.01),60 h達(dá)到峰值,其中48 h降低至最低。以上結(jié)果說明PCV2 Cap蛋白在體外能夠模擬PCV2提高細(xì)胞因子IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄水平,并且對IL-21轉(zhuǎn)錄水平提高更明顯,幾乎是PCV2刺激后轉(zhuǎn)錄水平的2倍。

    圖2 PCV2 Cap 蛋白刺激豬PBMCs中IL-21和IL-17A的轉(zhuǎn)錄變化

    2.3 實時熒光定量PCR檢測PCV2和PCV2 Cap 蛋白刺激豬PBMCs中PD-L1基因轉(zhuǎn)錄變化水平

    按照Yue等[14]的檢測方法和計算方法檢測PCV2和PCV2 Cap 蛋白刺激豬PBMCs后PD-L1基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果如圖3所示。PCV2刺激PBMCs后PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào),并且在48~72 h上調(diào)最明顯(P<0.01),48 h達(dá)到峰值(圖3A);PCV2 Cap蛋白刺激PBMCs后PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平在12 h和60 h明顯上調(diào)(P<0.01),12 h達(dá)到峰值(圖3B)。但是,比較PCV2和PCV2 Cap蛋白對PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平的影響,發(fā)現(xiàn)PCV2顯著提高PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01),幾乎是PCV2 Cap 蛋白刺激時的2倍,這與前期關(guān)于PCV2自然感染豬時PD-L1的研究結(jié)果相一致[14]。以上結(jié)果說明PCV2 Cap 蛋白能夠模擬PCV2提高PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平,但是轉(zhuǎn)錄水平低于PCV2刺激時的轉(zhuǎn)錄水平。

    圖3 PCV2 和PCV2 Cap 蛋白刺激豬PBMCs中PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平的變化

    3 討 論

    IL-21與其他的細(xì)胞因子如IL-2、IL-4、IL-15等的空間結(jié)構(gòu)一致,其受體為IL-21R(interleukin-21 receptor),與IL-2家族具有相同的結(jié)構(gòu)特征,歸類于IL-2家族。在正常細(xì)胞中IL-21不表達(dá),當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)時IL-21才表達(dá)。鏈霉菌屬的抗生素或其他類似抗體等,都可以誘導(dǎo)IL-21的表達(dá)。IL-21主要是由活化的 CD4+T(主要是Th2)細(xì)胞、NKT細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞分泌[15],Th17細(xì)胞也分泌表達(dá)[16]。IL-21發(fā)揮其各種功能時,需要與他的受體IL-21R結(jié)合。IL-21對所有的淋巴細(xì)胞都有調(diào)節(jié)效應(yīng),主要是影響 CD4+ T細(xì)胞的發(fā)育、促進B細(xì)胞的增殖分化、調(diào)節(jié)B細(xì)胞的類型轉(zhuǎn)換和抗體分泌,還可促進CTL細(xì)胞數(shù)量的增加,誘導(dǎo)CD8+T 和NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)和功能,強化細(xì)胞毒活性等,使其在感染性疾病中發(fā)揮重要作用。豬IL-21基因是在豬第8號染色體上,其cDNA全長共456 bp[17]。豬IL-21基因在同源性上與人和某些動物的氨基酸序列具有相似性,其中,與牛同源性最高,其次是人,最低的是鼠。

    目前PCV2疫苗研究主要集中在疫苗抗原的研究,如通過各種表達(dá)系統(tǒng),獲得PCV2 Cap 的重組蛋白,用于疫苗抗原的制備。武樂祎等[18]通過CHO-K1系統(tǒng)制備了PCV2 Cap蛋白,能夠刺激小鼠產(chǎn)生較高水平的抗體。通過分析比較,發(fā)現(xiàn)PCV2 Cap 蛋白能夠和PCV2一樣刺激PBMCs中IL-21和IL-17A基因轉(zhuǎn)錄水平變化,說明PCV2 Cap蛋白具有PCV2抗原的特性。同時還發(fā)現(xiàn)PCV2 Cap蛋白刺激PBMCs中IL-21基因的轉(zhuǎn)錄水平升高,是PCV2刺激后轉(zhuǎn)錄水平的近2倍。而IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄水平和PCV2刺激后的轉(zhuǎn)錄水平基本保持一致。以上研究進一步表明,前期制備的PCV2 Cap蛋白能夠模擬PCV2的病毒粒子,刺激IL-21和IL-17A基因轉(zhuǎn)錄水平的上升。又由于IL-21發(fā)揮正向免疫調(diào)節(jié)的作用,因此,可以將Cap作為PCV2疫苗抗原的候選抗原,用于PCV2疫苗的研究。

    利用豬IL-21和IL-17A基因的實時熒光定量PCR檢測方法,檢測PCV2和PCV2 Cap蛋白體外刺激后PBMCs中IL-21和IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示,PCV2 Cap蛋白和PCV2刺激后,豬IL-21和IL-17A的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,在第60 h達(dá)到峰值;IL-21的轉(zhuǎn)錄水平在48 h降至最低,甚至低于正常水平,這可能是由于IL-21的表達(dá)水平受PD-1∶PD-Ls通路的調(diào)節(jié),IL-17A的表達(dá)水平又受IL-21的調(diào)節(jié)。PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平在48 h達(dá)到峰值,導(dǎo)致IL-21的轉(zhuǎn)錄水平最低值。這個研究結(jié)果與Zhang等[19]研究流感病毒H9N2病毒粒子感染的結(jié)果一致,當(dāng)感染流感病毒H9N2的病毒粒子后,PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平在24 h達(dá)到峰值,但轉(zhuǎn)錄水平遠(yuǎn)低于流感病毒H9N2感染時的轉(zhuǎn)錄水平。又有研究證明,IL-21和IL-17A的表達(dá)受PD-1∶PD-L1通路的調(diào)節(jié)[17]。PCV2自然感染過程中,PD-L1的表達(dá)水平升高更明顯,發(fā)揮主要作用[14],導(dǎo)致機體的免疫抑制。因此,將PD-L1作為檢測對象,研究PD-L1與IL-21、IL-17A的關(guān)系。通過檢測PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平,發(fā)現(xiàn)PCV2 Cap蛋白能模擬PCV2刺激PD-L1轉(zhuǎn)錄水平變化,但是與PCV2感染時轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢并不完全一致,并且PCV2刺激時PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平更高;PCV2 Cap蛋白與PCV2刺激PBMCs時,PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平變化調(diào)節(jié)IL-17A和IL-21基因的轉(zhuǎn)錄水平。因此,PD-L1轉(zhuǎn)錄水平的升高,刺激IL-17A和IL-21基因的轉(zhuǎn)錄水平升高,當(dāng)升高到一定水平時則發(fā)揮抑制作用。但是,目前PCV2 Cap蛋白刺激時PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平變化與IL-17A和IL-21基因轉(zhuǎn)綠的調(diào)節(jié)機制還不清楚,這需要后期進一步研究證實,這也是目前課題重點研究的內(nèi)容。

    綜上所述,PCV2和PCV2 Cap蛋白在體外能夠刺激PBMCs,導(dǎo)致PD-L1、IL-17A和IL-21基因的轉(zhuǎn)錄水平升高,其中PCV2 Cap蛋白導(dǎo)致IL-21基因的轉(zhuǎn)錄水平升高更多,幾乎是PCV2 刺激時的2倍;IL-17A基因的轉(zhuǎn)錄水平基本和PCV2刺激保持一致,PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有PCV2刺激時的轉(zhuǎn)錄水平高。以上研究為后續(xù)研究PCV2 Cap蛋白刺激的IL-21與IL-17A和其他細(xì)胞因子的關(guān)系以及對機體免疫功能的影響奠定了理論基礎(chǔ)。

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