漆姑草總黃酮大孔樹脂純化工藝研究

耿亞 趙喜蘭 張強(qiáng)

【摘 要】 目的：探討大孔樹脂純化漆姑草總黃酮工藝。方法：比較 6 種不同型號(hào)大孔吸附樹脂對(duì)漆姑草中總黃酮的吸附和解吸效果，篩選出純化漆姑草總黃酮的最佳樹脂，并對(duì)其吸附和解吸條件進(jìn)行考察和優(yōu)化，應(yīng)用單因素實(shí)驗(yàn)，確定最佳純化工藝。結(jié)果：AB-8 樹脂具有最佳吸附和解吸特性，最佳工藝為上樣液濃度1.076 mg/mL，pH為5.7，上樣體積6 BV，以 3 BV 70%乙醇在流速2 BV/h 洗脫，得黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.50%。結(jié)論：AB-8 樹脂用于純化漆姑草總黃酮，工藝穩(wěn)定可靠。

【關(guān)鍵詞】 大孔樹脂;漆姑草;黃酮;純化

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）08-0035-05

Abstract：Objective To explore the the technique of purifying the total flavonoids of Herba Saginae Japonicae（FHS）by macroporous resin. Method The adsorption and desorption effects of 6 different types of macroporous adsorption resins on FHS was compared to screen out the best resin for purifying FHS， and investigated and optimized its adsorption and desorption conditions. the best optimization process was determined by application single factor experiment. Results AB-8 resin had the best adsorption and desorption characteristics. The best process was the sample concentration 1.076 mg/mL， pH 5.7， sample volume 6 BV， 3 BV 70% ethanol at sampling velocity of 2 BV/h eluting， and the mass fraction of flavonoids was 75.50%. Conclusion The AB-8 resin is used to purify FHS and the technique is stable and reliable.

Key words：Macroporous Resin; Lavender; Flavonoids; Purification

漆姑草（Spergula japonica Sw.）為石竹科植物漆姑草的全草，分布于東北、華北、華東、中南、西南及陜西、廣西等地，具有涼血解毒、殺蟲止癢之功效[1]。文獻(xiàn)顯示[2]，漆姑草總黃酮對(duì)腫瘤具有一定的抑制作用，其中已分離得到的主要黃酮衍生物有：6，8-二-C-葡萄糖基芹菜素、6-C-阿拉伯糖基-8-C-葡萄糖基芹菜素、8-C-葡萄糖基芹菜菜、x″-O-鼠李糖基-6-C-葡萄糖基芹菜素[3]。目前，漆姑草總黃酮多采用溶劑提取法，但該法溶劑用量比較大，所得黃酮含量不高[4]，還需要進(jìn)一步純化。大孔樹脂是一種重要的聚合物吸收劑，常用于自然資源中生物活性化合物的制備分離和純化。由于其高效，低污染和操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，大孔樹脂已被廣泛用于從天然植物中分離和純化活性成分，包括黃酮、生物堿、類萜和皂甙等[5]。本研究系統(tǒng)分析不同極性的大孔樹脂對(duì)漆姑草總黃酮的吸附和解吸能力，在最佳條件下，使用選定的樹脂純化漆姑草總黃酮。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)藥物 漆姑草采集于貴陽(yáng)花溪，經(jīng)漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校趙喜蘭副教授鑒定為石竹科植物漆姑草Spergula japonica Sw.的全草;蘆丁對(duì)照品購(gòu)自南京景竹生物科技有限公司（批號(hào)：20180211）。

1.2 主要試劑與儀器 D101、NKA-9、ADS-5、ADS-17、AB-8及ADS-F8大孔樹脂均購(gòu)自天津南開和成科技有限公司;其余試劑均為分析純。R-220 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠;雙光束紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自上海譜元儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取蘆丁對(duì)照品12.38 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇5 mL，超聲輔助溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.495 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱定漆姑草（粉碎，過40目）1 g，加入75%甲醇50 mL，超聲輔助提取30 min，過濾，置于50 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。分別吸取上述蘆丁溶液0.5 mL與2.5 mL蒸餾水混合，然后加入5%（m/v）的NaNO2溶液（150 μL）。 6 min后，加入250 μL10%（m/v）AlCl3·6H2O溶液，靜置5 min，加入1.0 mL 1.0 M NaOH。用蒸餾水將混合物調(diào)至5.0 mL，并充分混合。使用紫外可見分光光度計(jì)于510 nm處測(cè)量吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度（X）為為橫坐標(biāo)，建立回歸方程，Y=9.847X-0.0059，r=0.9998。線性范圍為0.025～0.198 mg/mL。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，參照“2.1.3”分別于15、30、60、90、120 min測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為0.31%，表明樣品溶液在0～120 min呈色比較穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批漆姑草6份，每份1g，參照“2.1.2” 項(xiàng)制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液，參照“2.1.3” 測(cè)定吸光度，結(jié)果漆姑草中總黃酮的平均含量為2.164 mg/g，RSD為0.48%，表明樣品溶液重復(fù)性較好。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，參照“2.3”連續(xù)6次測(cè)定吸光度值，結(jié)果RSD為0.47%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 加樣回收試驗(yàn) 稱取已知含量的漆姑草（含量2.164 mg/g）粉末9份，每份0.5 g，分別按照已知含量的80%、100%、120%加入蘆丁對(duì)照品溶液（0.495 mg/mL），參照“2.1.2”制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.2 上樣品溶液的制備 將漆姑草自然風(fēng)干至恒重，粉碎，過40目，稱取500 g，加20倍量的 80%乙醇浸泡1 h，然后加熱并在80 ℃回流提取3次，每次2 h。合并濾液，抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮到原體積的1/6，超聲輔助溶解20 min，過濾，定容到100 mL作為樣品溶液，漆姑草總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.82 mg/mL，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樹脂的篩選

2.3.1 靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn) 將3 g（M）樹脂放入250 mL錐形瓶中，加入100 mL（V） 濃度為1.082 mg/mL（C0，樣品溶液稀釋10倍）樣品溶液，25 ℃ 100 rpm振蕩吸附24 h，通過UV分析吸附后總黃酮的總濃度（C1），每種樹脂的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。振蕩吸附24 h后，用100 mL蒸餾水洗滌樹脂，然后用100 mL 70%乙醇解吸。將裝有解吸溶液的錐形瓶在25 ℃ 100 rpm連續(xù)振蕩24 h，分析解吸溶液中總黃酮的濃度（C2）。每種樹脂的靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。其中靜態(tài)吸附量Q（mg/g）=（C0-C1）×V/M，吸附率（%）=（C0-C1）/C0，靜態(tài)解析率（%）=（C2×V）×100%/（M×Q）。

表2顯示，所選的樹脂中，AB-8樹脂的吸附量明顯高于D101、NKA-9、ADS-5、ADS-F8，吸附率和解吸率明顯高于D101、NKA-9、ADS-5、ADS-17、ADS-F8樹脂（P<0.05），因此，選擇AB-8樹脂作為漆姑草總黃酮純化的最佳樹脂[JP]。

2.3.2 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 將3 g AB-8樹脂置入錐形燒瓶中，加入濃度為1.082 mg/mL樣品溶液100 mL，25 ℃ 100 rpm振蕩吸附，分別在30、60、90、120、180、240、300、360 min不同的時(shí)間間隔內(nèi)，監(jiān)測(cè)溶液中總黃酮的濃度，計(jì)算吸附率。

圖1顯示，AB-8樹脂在0～90 min內(nèi)吸附率呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)，120 min時(shí)吸附率最高。然后，伴隨時(shí)間的推移，吸附率變化不大，故AB-8樹脂吸附時(shí)間選擇120 min。

2.3.3 解吸動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 將3 g AB-8樹脂置入錐形燒瓶中，加入濃度為1.082 mg/mL樣品溶液100 mL，25 ℃ 100 rpm振蕩吸附120 min，100 mL蒸餾水洗滌， 100 mL（V） 70%乙醇解吸，分別在30、60、90、120、180、240、300 min不同的時(shí)間間隔內(nèi)，監(jiān)測(cè)解吸液中總黃酮的濃度，計(jì)算解吸率。

圖2顯示，0～120 min黃酮的解吸率呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)，120 min解吸率達(dá)到最高。然后伴隨時(shí)間的推移，解吸率無(wú)明顯的變化。故黃酮解吸時(shí)間選擇120 min。

2.4 純化漆姑草總黃酮工藝

2.4.1 樣品溶液濃度對(duì)吸附率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將濃度分別為8.608、4.304、2.152、1.076、0.586、0.293 mg/mL漆姑草總黃酮樣品液70 mL上樣至預(yù)處理的層析柱（2.6 cm × 40 cm）頂部，室溫（25 ℃）下保持40 min，以達(dá)到黃酮充分吸附。吸附后，用2 BV蒸餾水以2 BV/h體積流量淋洗AB-8樹脂，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮的濃度，計(jì)算吸附率。

圖3顯示，總黃酮濃度在0.293～1.076 mg/mL時(shí)，吸附率較好，并呈現(xiàn)明顯的上升的趨勢(shì)。而總黃酮濃度在1.076～8.608 mg/mL時(shí)，吸附率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)?？赡苁屈S酮濃度較低時(shí)，便于樹脂吸附，而高濃度的黃酮易堵塞樹脂微孔，吸附率下降。故上樣液濃度選擇1.076 mg/mL。

2.4.2 樣品溶液體積對(duì)吸附率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將濃度為1.076 mg/mL漆姑草總黃酮樣品液上樣至層析柱（2.6 cm × 40 cm），上樣體積流量為2 BV/h，收集流出液，每管10 mL，檢測(cè)總黃酮濃度，繪制吸附泄露曲線。

圖4顯示，上樣體積1～6 BV時(shí)，泄漏液中總黃酮濃度較低，且變化不大，而7 BV時(shí)，AB-8樹脂基本達(dá)到飽和狀態(tài)，泄漏明顯。故上樣液體積選擇6 BV。

2.4.3 pH對(duì)吸附率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將70 mL pH分別為3、4、5.7、6、7、8的樣液（總黃酮質(zhì)量濃度1.076 mg/mL）上樣至層析柱（2.6 cm × 40 cm），上樣體積流量為2 BV/h，并在室溫（25 ℃）下保持40 min，以達(dá)到黃酮充分吸附。用2 BV蒸餾水以2 BV/h體積流量淋洗AB-8樹脂，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮的濃度，計(jì)算吸附率。

圖5顯示，pH從3～5.7，總黃酮的解吸率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，然后伴隨pH的增加，解吸率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。其原因可能是酸性過大，容易形成烊鹽，而pH過大會(huì)破壞黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)。故pH選擇5.7，即原液的pH。

2.4.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將70 mL的樣液（總黃酮質(zhì)量濃度1.076 mg/mL）上樣至預(yù)處理的層析柱（2.6 cm × 40 cm），上樣體積流量為2 BV/h，流出液重復(fù)上樣一次，2 BV蒸餾水沖洗，3 BV不同濃度的乙醇（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）以2 BV/h體積流量進(jìn)行解吸，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮的濃度，計(jì)算解吸率。

圖6顯示，伴隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，解吸率呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，解吸率最佳，故乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇70%。

2.4.5 洗脫液體積對(duì)解吸率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將70 mL的樣液（總黃酮質(zhì)量濃度1.076 mg/mL）上樣至預(yù)處理的層析柱（2.6 cm × 40 cm），上樣體積流量為2 BV/h，流出液重復(fù)上樣一次，2 BV蒸餾水沖洗，然后采用1、2、3、4、5 BV體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇以2 BV/h體積流量進(jìn)行解吸，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮的濃度，計(jì)算解吸率。

圖7顯示，伴隨洗脫體積的增加，解吸率呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)，當(dāng)洗脫體積達(dá)到3 BV時(shí)，解吸率最佳，繼續(xù)增加洗脫體積，解吸率變化不大。故洗脫體積選擇3 BV。

2.4.6 洗脫流速對(duì)解吸率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將70 mL的樣液（總黃酮質(zhì)量濃度1.076 mg/mL）上樣至預(yù)處理的層析柱（2.6 cm × 40 cm），上樣體積流量為2 BV/h，流出液重復(fù)上樣一次，2 BV蒸餾水沖洗，然后采用70%的乙醇分別以1、2、3、4 BV/h體積流量進(jìn)行解吸，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮的濃度，計(jì)算解吸率。

圖8顯示，流速為1～2 BV/h時(shí)，解吸率較高。伴隨流速的增加，解吸率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。但流速過低，洗脫時(shí)間將明顯延長(zhǎng)，故流速選擇2 BV/h。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 選擇三份樣品，每份500 g，在最佳純化工藝條件下，分別進(jìn)行吸附-解吸實(shí)驗(yàn)，計(jì)算純化后漆姑草總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果平均總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.50%，RSD 為 1.21%，表明本研究所建立的 AB-8 樹脂純化漆姑草總黃酮的方法穩(wěn)定、可靠。見表2。

3 討論

紫外分光光度法是測(cè)定總黃酮含量比較常用的方法，具有操作簡(jiǎn)便、高效、快速的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于黃酮的定量分析。本研究中，通過方法學(xué)考察發(fā)現(xiàn)，該法穩(wěn)定性較好，溶液在0～120 min呈色比較穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和儀器精密度良好，加樣回收率達(dá)到95.48%～101.25%，可作為測(cè)定漆姑草總黃酮的有效方法。

目前，黃酮類化合物的純化主要應(yīng)用大孔吸附樹脂和聚酰胺樹脂。與聚酰胺樹脂相比，大孔吸附樹脂具有吸附容量大、選擇性好、再生簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在黃酮類化合物的分離純化中得到廣泛應(yīng)用[6]。本研究選擇非極性（D101、ADS-5型）、弱極性（AB-8、ADS-17型）以及極性（NKA-9、ADS-F8型）大孔樹脂，系統(tǒng)地研究和比較6種樹脂的吸附和解吸能力，初步考察不同類型樹脂對(duì)草果總黃酮的富集效果。結(jié)果顯示，AB-8樹脂因其出色的吸附和解吸能力而被選擇為最佳吸附劑，與漆姑草總黃酮極性特征對(duì)應(yīng)。本研究在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)上樣液濃度、上樣液體積、上樣液pH、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫液體積、洗脫流速進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，結(jié)果漆姑草總黃酮純化的最佳工藝條件為：進(jìn)料溶液在pH值為5.7、上樣液體積6 BV，在25 ℃原始總黃酮濃度為1.076 mg/mL的條件下進(jìn)行。靜態(tài)洗脫和動(dòng)態(tài)洗脫溶液選擇為體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇、洗脫液體積3 BV、洗脫流速2 BV/h以提高漆姑草總黃酮的解吸率。通過AB-8樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附和解吸后，最終產(chǎn)品中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.50%。

總之，本研究以漆姑草總黃酮含量為指標(biāo)，以分光光度法作為定量分析手段，利用AB-8樹脂開發(fā)了一種從漆姑草中分離純化黃酮類化合物的可行而有效的方法。

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（收稿日期：2020-10-05 編輯：劉 斌）