牛乳清蛋白源脂肪酶抑制肽的制備及影響因素研究

梁莎，暢姝怡，齊元錦，李志成

(西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌712100)

0 引 言

乳源活性肽具有抗氧化、降血壓、增強免疫力等作用[1]，已成為科研工作者研究的一大熱點。乳清蛋白具有抗衰老[2]、提高免疫力[3]、維持腎功能[4]和促進創(chuàng)傷愈合[5]等功效，同時有助于防治心腦血管疾病[6]和消化系統(tǒng)疾病[7]。另一方面，對于熱愛運動的人來說，乳清蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白源，它具有抗氧化作用[8]，并能促進骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，有助于運動員訓練后的體能恢復[9]。

以乳清蛋白為原料制備的活性肽具有降膽固醇、ACE抑制、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗氧化、降血糖等多種有益于人體健康的功效[10-15]。肥胖是由于能量代謝失調(diào)導致脂肪累積而引起的一種不利于人體健康的狀態(tài)[16]。比較常見的減肥方式主要包括運動減肥[17-18]、藥物減肥[19-20]和食療減肥[21-22]。其中食療減肥展現(xiàn)出了許多明顯優(yōu)勢，已受到越來越多肥胖患者的青睞。牛乳作為日常飲品，其乳清蛋白具有較高的可接受度[23-24]。美國農(nóng)業(yè)部Beltsville人類營養(yǎng)研究中心發(fā)現(xiàn)，相比于大豆蛋白以及同等能量的碳水化合物，乳清蛋白具有較好的減肥效果[25]。美國田納西大學營養(yǎng)學院主任Michael B Zemel研究證實：乳品中的乳清蛋白有助于燃燒多余脂肪，合理的控制體重。乳清蛋白中的營養(yǎng)成分可刺激肌肉組織的構(gòu)建，而此過程也是脂肪燃燒的過程[26]。Pilvi等人研究發(fā)現(xiàn)，給肥胖小鼠喂養(yǎng)不同組分的乳清蛋白，可顯著降低體脂含量[27]。Dudgeon等人研究發(fā)現(xiàn)，在運動前、運動中以及運動后給16名男性補充乳清蛋白，與補充碳水化合物相比，減少了體內(nèi)脂肪含量，維持體重并增強肌肉力量[28]。但是乳清蛋白的什么成分如何控制體重的并不清楚。因此，本文將從減肥的角度，以乳清蛋白為材料，通過酶工程技術(shù)制備牛乳清蛋白源活性肽，探究其對胰脂肪酶和α-淀粉酶的抑制作用、影響因素及其模擬胃腸道消化，為減肥功能產(chǎn)品的研發(fā)和應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛濃縮乳清蛋白粉（蛋白質(zhì)含量80%），四川天吉康晟貿(mào)易有限公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶，西安熱默爾生物科技有限公司；胰蛋白酶、胰脂肪酶、還原型谷胱甘肽、α-淀粉酶，北京索萊寶科技有限公司；阿拉伯膠、脫氧膽酸鈉、對硝基苯酚、對硝基苯酚棕櫚酸酯，上海阿拉丁科技股份有限公司；可溶性淀粉，四川省彭州市軍樂化工廠等。

1.2 儀器與設備

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；Sartorius PB-10 p H計，德國Sartorius公司；H 1650高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SB-5200DTD超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；L5紫外分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳清蛋白活性肽的制備

將濃縮牛乳清蛋白粉（質(zhì)量分數(shù)80%）溶于蒸餾水中，可加少量NaOH溶液助溶，制備蛋白質(zhì)濃度分別為10、20、30 mg/mL的牛乳清蛋白溶液。分別按照表1所示的胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及胃蛋白酶等5種蛋白酶的最適酶解條件，對牛乳清蛋白溶液進行酶解，酶解完成后，將酶解液置于90℃水浴中加熱滅酶10 min，然后水浴冷卻至室溫，10 000 g離心20 min，取上清液進行測試或保存于-20℃冰箱中。

表1 5種蛋白酶的酶解條件

1.3.2 胰脂肪酶抑制率的測定

根據(jù)zheng[29]、Gupta[30]、李瑞霞[31]等人的方法以對硝基苯酚棕櫚酸酯(PNPP)為底物采用分光光度法測定胰脂肪酶活性并計算抑制率。

1.3.3 α-淀粉酶抑制率的測定

根據(jù)讓一峰[32]、Yang[33]等人的方法測定牛乳清蛋白源活性肽的α-淀粉酶的活性并計算抑制率。

1.3.4 牛乳清蛋白酶解工藝優(yōu)化

以牛乳清蛋白源活性肽的胰脂肪酶抑制率為指標，篩選出酶解牛乳清蛋白效果最優(yōu)的酶解溫度、酶解時間和加酶量，進而確定脂肪酶抑制肽的酶解工藝。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇酶解溫度、酶解時間和加酶量進行正交試驗，確定牛乳清蛋白源活性肽的最佳制備工藝。

1.3.5 多肽含量的測定

根據(jù)魯偉[34]的方法，并稍作修改。主要是將Gly-Gly-Tyr-Arg四肽修改為還原型谷胱甘肽（GSH），GSH的濃度與其溶液A540nm吸光度的曲線方程為y=10.03x-0.005（R2=0.9997），濃度范圍為0～0.9 mg/mL。

1.3.6 乳清蛋白源活性肽抑制率的影響因素研究

將采用最優(yōu)工藝制備的乳清蛋白源活性肽分別置于不同溫度、pH值、光照、氧氣和金屬離子存在的條件下保持30 min，研究不同因素對乳清蛋白源活性肽活性的影響。

1.3.7 體外模擬胃腸液消化對乳清蛋白源活性肽抑制率的影響

根據(jù)Ruiz[35]等人的方法，并稍作修改。在20 mL乳清蛋白源活性肽溶液中加入3 mL 0.1 mg/mL模擬胃液，37℃水解2 h（模擬胃消化），用40%(w/w)的NaOH溶液調(diào)節(jié)p H到7.5，測定其對胰脂肪酶、α-淀粉酶的抑制率及多肽含量。同時取10 mL模擬胃消化之后的酶解液，在其中加入3 mL模擬腸液，37℃水解2.5 h（模擬小腸消化），沸水浴5 min后，冷卻至室溫，離心后測定其對胰脂肪酶、α-淀粉酶的抑制率及多肽含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016軟件繪圖，用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，用最小顯著性差異法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白酶的篩選

由圖1可知，當牛乳清蛋白溶液中蛋白質(zhì)濃度為30 mg/m L時，五種常見蛋白酶的酶解液對胰脂肪酶都有一定的抑制作用，其中堿性蛋白酶酶解液對胰脂肪酶的抑制率為45.06±9.30%，均顯著高于其他4種酶（P<0.05）。因此選擇堿性蛋白酶進行后續(xù)試驗。

圖1 5種酶解液的胰脂肪酶抑制率

2.2 牛乳清蛋白濃度的選擇

由圖2可知，當牛乳清蛋白的濃度在20~60 mg/m L時，經(jīng)堿性蛋白酶酶解所得的乳清蛋白源活性肽對胰脂肪酶和α-淀粉酶的抑制率隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而增加，乳清蛋白濃度在60~80 mg/mL時抑制率稍有降低，濃度為60 mg/mL與100 mg/mL時抑制率較高。但試驗過程中發(fā)現(xiàn)，當乳清蛋白質(zhì)濃度為100 mg/m L時，酶解液基本呈現(xiàn)凝膠狀，從節(jié)約資源，提高原料利用率的角度考慮，選擇抑制率較高的60 mg/mL為乳清蛋白最適的酶解濃度。

圖2 牛乳清蛋白質(zhì)濃度對酶抑制率的影響

2.3 酶解工藝優(yōu)化

2.3.1 酶解溫度

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，牛乳清蛋白源活性肽對胰脂肪酶的抑制率先增加后降低，酶解溫度為45℃時，胰脂肪酶抑制率最高，達到59.70±0.10%。溫度較低時，酶解速率較慢，溫度較高時，堿性蛋白酶的結(jié)構(gòu)可能遭到破壞[36]，因此選用45℃作為牛乳清蛋白最適酶解溫度。

圖3 酶解溫度對胰脂肪酶抑制率的影響

2.3.2 酶解時間

由圖4可知，當酶解時間為1~4 h時，隨著酶解時間的延長，乳清蛋白源活性肽的抑制率逐漸增大，當酶解時間為4 h時達到最高為60.30±1.44%，可能是酶解物中對胰脂肪酶具有抑制作用的活性肽越來越多；當酶解時間為4~5 h，胰脂肪酶抑制率降低，可能是短鏈的多肽片段被繼續(xù)水解為氨基酸[37]或其他沒有胰脂肪酶抑制活性的肽段。因此，選擇4 h為牛乳清蛋白的最適酶解時間。

圖4 酶解時間對胰脂肪酶抑制率的影響

2.3.3 加酶量

由圖5可知，乳清蛋白源活性肽對胰脂肪酶的抑制率隨著加酶量的增加先增大后減小，當加酶量為750 U/g時抑制率達到最大值60.43±2.35%?？赡苁且驗樵诿附獬跗冢?shù)孜餄舛纫欢〞r，酶與底物的接觸率隨加酶量的增多而增高，體系反應速度也隨之增大，這使得大部分大分子蛋白在短時間內(nèi)被降解為具有抑制作用的小分子肽，但達到一定值后，隨著底物的減少，酶與大分子蛋白的接觸率降低，此時堿性蛋白酶水解的主要底物是乳清蛋白源活性肽，因此，隨著加酶量的增大其對胰脂肪酶的抑制率會降低[38]。

圖5 加酶量對胰脂肪酶抑制率的影響

2.3.4 牛乳清蛋白酶解條件的優(yōu)化

利用正交試驗，測定不同酶解溫度、酶解時間和加酶量對脂肪酶活性的抑制率，優(yōu)化堿性蛋白酶酶解乳清蛋白的酶解條件。

由表2可知，乳清蛋白源活性肽對胰脂肪酶抑制率影響的主次順序為C>A>B，即加酶量影響最大，其次為酶解溫度，酶解時間影響最小。抑制率較高的最佳組合為A2B3C2，即酶解溫度45℃、酶解時間4 h、加酶量750 U/g。由于該組合不在正交試驗中，因此進行驗證試驗，測得該條件下胰脂肪酶的抑制率為60.11±0.14%，符合預期。因此，乳清蛋白源活性肽的最佳制備條件為在60 mg/mL的乳清蛋白溶液中，加入750 U/g堿性蛋白酶，45℃酶解4 h，所得活性肽對胰脂肪酶的抑制率最高。

表2 牛乳清蛋白酶解條件正交試驗設計及結(jié)果

按正交試驗最佳酶解條件酶解，酶解物對α-淀粉酶的抑制率為20.88±0.66%。經(jīng)測定，在最佳酶解條件下，60 mg/mL的乳清蛋白酶解后，酶解液中肽的含量為76.37 mg/mL，折算每毫克肽的胰脂肪酶抑制率為0.78±0.01%，α-淀粉酶的抑制率為0.27±0.01%。因此，利用本方法制備的乳清蛋白源活性肽既可以抑制胰脂肪酶的活性，也可以抑制α-淀粉酶的活性，也說明乳清蛋白是通過抑制胰脂肪酶和α-淀粉酶的活性而達到減肥作用的。

2.4 乳清蛋白源活性肽抑制率影響因素研究

2.4.1 溫度對乳清蛋白源活性肽抑制率的影響

由圖6可知，乳清蛋白源活性肽對胰脂肪酶的抑制率在95℃時最高，并顯著高于25℃時的抑制率（P<0.05），對α-淀粉酶的抑制率在75℃時最高，并顯著高于其他溫度時的抑制率（P<0.05），但總體變化不大，說明溫度會影響乳清蛋白源活性肽的活性，但影響不大，表明乳清蛋白源活性肽可接受常規(guī)殺菌及滅菌處理。

圖6 溫度對牛乳清蛋白源活性肽抑制率的影響

2.4.2 p H對乳清蛋白源活性肽抑制率的影響

由圖7可知，pH過高或過低時，乳清蛋白源活性肽對胰脂肪酶和α-淀粉酶的抑制率均較低，說明過酸或過堿的環(huán)境可能會破壞牛乳清蛋白源活性肽的結(jié)構(gòu)。p H=8時牛乳清蛋白源活性肽對α-淀粉酶的抑制率最高，p H=7時對胰脂肪酶的抑制率最高，因此，牛乳清蛋白源活性肽適宜保存在p H 7~8的環(huán)境中。

圖7 pH值對牛乳清蛋白源活性肽的影響

2.4.3 光照對乳清蛋白源活性肽抑制率的影響

由圖8可知，與避光貯藏相比，乳清蛋白源活性肽在經(jīng)過日光和紫外線照射30 min后對胰脂肪酶的抑制率均顯著增加（P<0.05）。經(jīng)過紫外光條件處理后，乳清蛋白源活性肽對α-淀粉酶的抑制率顯著增加（P<0.05），日光照射對α-淀粉酶的抑制率影響不顯著（P>0.05）。總體來說，紫外線照射能使兩種酶的抑制率保持較高水平。所以紫外光照射在短期內(nèi)不會降低乳清蛋白源活性肽的功能特性，因此，在生產(chǎn)中，可考慮采用紫外線對乳清蛋白源活性肽進行薄膜式滅菌處理。

圖8 光照對乳清蛋白源活性肽抑制率的影響

2.4.4 氧氣對乳清蛋白源活性肽抑制率的影響

由圖9可知，與對照相比，乳清蛋白源活性肽在持續(xù)通入潔凈空氣處理30 min對胰脂肪酶和α-淀粉酶的抑制率無顯著性差異（P>0.05）。因此，乳清蛋白源活性肽短時間暴露于空氣中對其功能特性影響不大，推測乳清蛋白源活性肽有一定的抗氧化作用，在短期保存過程中可以不進行隔氧處理。

圖9 氧氣對乳清蛋白源活性肽抑制率的影響

2.4.5 常見金屬離子對乳清蛋白源活性肽抑制率的影響

由圖10可知，當Na+濃度為1.0%(w/w)時，乳清蛋白源活性肽對胰脂肪酶的抑制率趨向于穩(wěn)定，而對α-淀粉酶的抑制率最大。繼續(xù)增加Na+濃度，胰脂肪酶抑制率無明顯變化，對α-淀粉酶的抑制率則逐漸減小。因此，從減肥作用和人體健康兩方面考慮，選擇金屬離子濃度為1.0%進行后續(xù)試驗，并與其他4種金屬離子進行對比，比較結(jié)果如圖11所示。

圖10 Na+對乳清蛋白源活性肽抑制率的影響

圖11 不同種類金屬離子對乳清蛋白源活性肽抑制率的影響

由圖11可知，不同種類的金屬離子對乳清蛋白源活性肽功能特性的影響不同。對胰脂肪酶的抑制率而言，F(xiàn)e2+與Na+處理組相比無顯著性差異（P>0.05），但Fe2+處理組顯著高于其他處理組（P<0.05）；同時Na+處理組顯著高于Ca2+處理組（P<0.05）。對α-淀粉酶的抑制率來說，K+顯著低于Ca2+處理組，（P<0.05），與其他處理組均無顯著性差異（P>0.05），同時與對照組相比，K+降低了牛乳清蛋白源活性肽對α-淀粉酶的抑制率（P>0.05）。由此可知，F(xiàn)e2+和Na+對乳清蛋白源活性肽的減肥功效有促進作用，其中Fe2+的促進作用最高，K+對乳清蛋白源活性肽的減肥功效有抑制作用。因此，乳清蛋白源活性肽與含F(xiàn)e2+的食品一起被食用可能更好地發(fā)揮減肥作用，但與含K+的食品一起食用可能會減弱其減肥效果。

2.4.6 模擬胃腸道消化對乳清蛋白源活性肽的影響

對經(jīng)過模擬胃腸道消化試驗后的乳清蛋白源活性肽進行抑制率及多肽含量的測定，結(jié)果如表3所示。由表3可知，經(jīng)過模擬胃液消化后，乳清蛋白源活性肽對胰脂肪酶和α-淀粉酶的抑制率先上升。

表3 模擬胃腸道消化對牛乳清蛋白肽抑制率的影響

再經(jīng)過模擬腸液消化后下降，每毫克肽胰脂肪酶抑制率由0.78±0.01%變?yōu)?.80±0.12%，每毫克肽α-淀粉酶抑制率由0.27±0.01%變?yōu)?.26±0.02%，最終得到的模擬胃腸道消化液與未經(jīng)消化的活性肽對脂肪酶和α-淀粉酶抑制率無顯著性差異(P>0.05)。由此可知，乳清蛋白源活性肽經(jīng)模擬胃腸道消化后穩(wěn)定性良好，仍能發(fā)揮減肥功能。

3 結(jié) 論

（1）牛乳清蛋白源活性肽的制備工藝條件，與中性蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶以及胃蛋白酶相比，堿性蛋白酶為制備乳清蛋白源活性肽的最佳水解酶，最優(yōu)酶解工藝為60 mg/mL的乳清蛋白溶液中加入750 U/g的堿性蛋白酶，45℃酶解4 h。在此條件下，酶解液中的多肽含量為75.37 mg/mL，每毫克肽對胰脂肪酶抑制率為0.78±0.01%，對α-淀粉酶抑制率為0.27±0.01%。

（2）乳清蛋白源活性肽的影響因素，光照、氧氣對乳清蛋白源活性肽胰脂肪酶與α-淀粉酶的抑制率影響不大，而相對高溫可以提高其活性。p H和金屬離子是影響乳清蛋白源活性肽活性的重要因素。環(huán)境p H值在7~8時適合乳清蛋白源活性肽的保存。Fe2+能提高乳清蛋白源活性肽對胰脂肪酶和α-淀粉酶的抑制率，K+則相反。當酶解液中Na+質(zhì)量分數(shù)為1.0%(w/w)時，乳清蛋白源活性肽胰脂肪酶和α-淀粉酶抑制率最高。

（3）乳清蛋白源活性肽經(jīng)過模擬胃腸道消化前后對胰脂肪酶和α-淀粉酶抑制率差異不顯著（P>0.05），說明乳清蛋白源活性肽在人體消化道中的穩(wěn)定性較好。