等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在克羅諾桿菌屬快速檢測(cè)中的研究進(jìn)展

王亮，張懿翔，劉洋

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（上海），上海200233）

0 引 言

克羅諾桿菌屬營(yíng)養(yǎng)要求低，環(huán)境耐受性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的耐熱、耐寒和抗干燥能力，廣泛存在于大自然中。生活中的各種食品：餅干、巧克力、堅(jiān)果、水果等均會(huì)受到克羅諾桿菌屬的不同程度的污染[1]，它也是嬰幼兒配方乳粉中常見(jiàn)的革蘭氏陰性致病菌，會(huì)對(duì)免疫力低下的人群特別是嬰幼兒的健康造成嚴(yán)重危害，可引發(fā)壞死性小腸結(jié)腸炎、菌血癥和新生兒腦膜炎等疾病，甚至可能留下嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，死亡率高達(dá)高達(dá)40%~80%[2]。

1 克羅諾桿菌屬的分類(lèi)和致病性

克羅諾桿菌屬的分類(lèi)經(jīng)歷了4個(gè)階段：最初發(fā)現(xiàn)時(shí)根據(jù)其能產(chǎn)生黃色素被命名為黃色陰溝腸桿菌，1980年FARMER通過(guò)DNA雜交、生化反應(yīng)、抗生素敏感性檢測(cè)等發(fā)現(xiàn)它與陰溝腸桿菌有所區(qū)別，因此更名為阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)[3]，2007年IVERSEN等利用多種現(xiàn)代分類(lèi)技術(shù)將其劃分為腸桿菌科下克羅諾桿菌屬，該屬包括6個(gè)種[4]。2012年，JOSEPH等在IVERSEN等人的基礎(chǔ)上采用16SrRNA基因序列分析和多位點(diǎn)測(cè)序(Multilkocus sequence typing，MLST)技術(shù)，將克羅諾桿菌屬分為7個(gè)種分別是：阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)、丙二酸鹽克羅諾桿菌(Cronobacter malonaticus)、蘇黎世克羅諾桿菌(Cronobacter turicensis)、莫金斯克羅諾桿菌(Cronobacter muytjensii)、都柏林克羅諾桿菌(Cronobacter dublinensis)、康迪蒙提克羅諾桿菌(Cronobacter condimenti)、尤尼沃斯克羅諾桿菌(Cronobacter universalis)[5]。

克羅諾桿菌屬的7個(gè)種都具有致病性，其致病性與類(lèi)腸毒素、內(nèi)毒素以及外膜蛋白有關(guān)，不同種之間的毒力表型差異較大[6]。據(jù)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)2012年重慶市旗山村4名兒童因克羅諾桿菌屬引起食物中毒，2013年溫州和上海也有嬰兒疑似感染的病例[7]。2019年10月6日和10月30日，加拿大食品檢驗(yàn)局就疑似克羅諾桿菌屬感染問(wèn)題分別發(fā)布警告緊急召回President’s Choice低鐵嬰兒配方奶粉和Parent’s Choice嬰兒配方奶粉。目前，克羅諾桿菌屬已被FAO和WHO共同列為A類(lèi)致病菌，嚴(yán)重威脅著人體的健康，因而建立相關(guān)的檢測(cè)方法尤其是快速檢測(cè)方法，能夠幫助企業(yè)及時(shí)發(fā)現(xiàn)和召回問(wèn)題產(chǎn)品，對(duì)于食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)控制及食品安全監(jiān)管及疾病預(yù)防控制等方面都有極其重要的意義。

2 克羅諾桿菌屬的檢測(cè)方法和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

克羅諾桿菌屬的檢測(cè)方法主要分為國(guó)標(biāo)生理生化檢測(cè)和分子核酸檢測(cè)兩大類(lèi)，早期的生理生化檢測(cè)方法存在針對(duì)性不強(qiáng)、選擇性不佳等諸多問(wèn)題[8-9]，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織和國(guó)際乳品聯(lián)合會(huì)，不斷優(yōu)化和完善后形成了ISO/TS 22964-2006檢測(cè)方法，我國(guó)現(xiàn)行的GB 4789.40-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗(yàn)》也是基于該方法制定而成。常規(guī)生化檢測(cè)，需要經(jīng)過(guò)培養(yǎng)增菌、分離篩選、生化鑒定等步驟，增菌時(shí)間就要2 d之久，整個(gè)檢測(cè)流程至少5 d以上，流程繁復(fù)且耗時(shí)耗力，無(wú)法滿(mǎn)足現(xiàn)代對(duì)致病菌快速篩查的要求?，F(xiàn)代微生物鑒定已不再局限于觀察菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化特性，可以從分子遺傳出發(fā)來(lái)鑒定微生物種屬。分子核酸檢測(cè)具有快速、高效、特異、靈敏度高等特點(diǎn)，主要通過(guò)檢測(cè)目標(biāo)病原體中的特定DNA或RNA序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。綜合目前國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，克羅諾桿菌屬檢測(cè)用到的目標(biāo)靶基因主要有：16SrRNA、ITS、α-葡萄糖苷酶、外膜蛋白(ompA)、rpoB、gyrB等[10-14]。相關(guān)技術(shù)包括：PCR、RT-PCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）、dd PCR、CRISPR、寡核苷酸DNA微陣列等。

在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，由于無(wú)需熱循環(huán)儀等設(shè)備、靈敏度高以及操作便捷等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)食品、環(huán)境等病原微生物的快速檢測(cè)。本文將重點(diǎn)綜述包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)、依賴(lài)解旋酶擴(kuò)增在內(nèi)的不同等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的相關(guān)原理及其在克羅諾桿菌屬快速檢測(cè)中的應(yīng)用情況，旨在為完善和改進(jìn)克羅諾桿菌屬的快速檢測(cè)方法提供相關(guān)理論依據(jù)。

2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

LAMP技術(shù)由日本人Notomi在2000年發(fā)明[15]，通過(guò)針對(duì)目標(biāo)基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，在鏈置換DNA聚合酶作用下，（60~65℃）條件下完成恒溫?cái)U(kuò)增。具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，但引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，存在多條引物相互作用以及氣溶膠造成的假陽(yáng)性問(wèn)題。李莉,陳澤輝采用LAMP法檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LAMP試劑盒對(duì)人工污染的嬰兒配方奶粉中的阪崎克羅諾桿菌的檢出限為20 CFU/mL，其靈敏度明顯高于國(guó)標(biāo)生化鑒定法，同時(shí)該方法從DNA提取到LAMP擴(kuò)增結(jié)束僅需1.5 h[16]，而國(guó)標(biāo)生化鑒定法分離培養(yǎng)到鑒定至少需要3 d以上。石偉雄等人采用了實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，通過(guò)在LAMP反應(yīng)體系中加入熒光染料，利用ESE Quant TS-LAMP擴(kuò)增儀實(shí)時(shí)收集熒光信號(hào)來(lái)監(jiān)控LAMP反應(yīng)的進(jìn)程，其檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌的靈敏度可達(dá)到8×10-2CFU/mL[17]。

2.2 重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）

RPA技術(shù)通過(guò)重組酶與引物結(jié)合形成蛋白-DNA復(fù)合物，一旦同源序列被引物定位即可發(fā)生鏈交換反應(yīng)，DNA合成啟動(dòng)并進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增[18]。該反應(yīng)只需在37℃條件下進(jìn)行，15 min即可完成。該技術(shù)對(duì)PCR抑制劑有一定耐受力，因而被廣泛用于疾病診斷和致病菌的檢測(cè)。陳純陽(yáng)等人將RPA與免疫層析試紙條（lateral flow strip，LF）相結(jié)合，利用生物素和地高辛修飾引物，進(jìn)而形成標(biāo)記的DNA產(chǎn)物，最后擴(kuò)增產(chǎn)物與膠體金標(biāo)記的地高辛抗體及試紙條上固定的鏈霉親和素發(fā)生特異性結(jié)合，只要20 min便可通過(guò)肉眼便觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該方法檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌菌液的檢出限可達(dá)1.7×102CFU/m L[19]。

2.3 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Rolling circle amplification，RCA）

RCA技術(shù)通過(guò)借鑒環(huán)狀質(zhì)粒及病毒的DNA滾環(huán)式自主復(fù)制，其關(guān)鍵步驟在于通過(guò)粘性末端或平末端成環(huán)的方式構(gòu)建環(huán)狀DNA模板[20]。Ju Liu等人建立了利用不對(duì)稱(chēng)拖尾PCR（AT-PCR）觸發(fā)滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）的雙重信號(hào)放大來(lái)檢測(cè)克羅諾桿菌屬的技術(shù)。首先2個(gè)平末端發(fā)卡DNA在T 4DNA連接酶作用下形成啞鈴狀DNA，同時(shí)不對(duì)稱(chēng)拖尾PCR形成大量ssDNA，啞鈴狀DNA與ssDNA雜交觸發(fā)RCA反應(yīng)，進(jìn)而形成大量G-四鏈體結(jié)構(gòu)DNA。該結(jié)構(gòu)能與熒光染料硫黃素T(ThT)特異性結(jié)合，通過(guò)收集熒光信號(hào)得到檢測(cè)結(jié)果[21]。Yunzhe Zhang等人在RCA基礎(chǔ)上創(chuàng)新發(fā)明了SRCA技術(shù)，該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)引物自身不擴(kuò)增而目的基因擴(kuò)增的效果，具有方法簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，省去了RCA中環(huán)化和連接酶構(gòu)建環(huán)狀DNA鏈的關(guān)鍵步驟，1.5 h即可完成反應(yīng)。由于反應(yīng)中d NTPs在合成DNA鏈時(shí)同時(shí)形成焦磷酸根離子，和反應(yīng)體系中的鎂離子形成焦磷酸鎂沉淀。結(jié)果可以通過(guò)添加熒光染料或離心觀察沉淀，可用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，在純培養(yǎng)條件下通過(guò)肉眼觀察的檢測(cè)限為3.4×102CFU/g，染料法的檢測(cè)限為3.4×101CFU/g[22]。

2.4 依賴(lài)解旋酶擴(kuò)增技術(shù)（Helicase-dependent amplification，HDA）

HDA技術(shù)，2004年紐英倫生物實(shí)驗(yàn)室根據(jù)活體細(xì)胞中DNA解旋酶解開(kāi)雙鏈DNA進(jìn)行復(fù)制的機(jī)制，設(shè)計(jì)了一種新型的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)-HAD[23]。HDA反應(yīng)需要DNA解旋酶、DNA聚合酶、輔助蛋白和可選擇的單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）等多種蛋白相互協(xié)作、共同完成DNA擴(kuò)增。依據(jù)擴(kuò)增過(guò)程中解旋酶的不同種類(lèi)，主要分成以下幾種：常溫HDA（Mesophilic form of HDA，m HDA）；耐熱型HDA（Thermophilic helicase dependent amplification，tHDA）；環(huán)狀HDA（Circular HDA，c HDA）。HDA作為簡(jiǎn)單的等溫?cái)U(kuò)增，不需要復(fù)雜的引物，反應(yīng)底物要求低，可以是菌體細(xì)胞、血液樣本等。Xu Di等人采用商品化的tHDA試劑盒，對(duì)經(jīng)過(guò)二氧化硅包裹的磁性納米粒子快速分離獲得的DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，最后通過(guò)加入熒光染料，檢測(cè)熒光信號(hào)，3 h內(nèi)便可完成檢測(cè)，純培養(yǎng)物的檢測(cè)限達(dá)到100 CFU/mL[24]。

表1 近5年包括等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在內(nèi)的分子檢測(cè)方法在克羅諾桿菌屬中的具體應(yīng)用

3 發(fā)展趨勢(shì)

3.1 縮短目標(biāo)菌富集時(shí)間

目前快速檢測(cè)在滿(mǎn)足其檢測(cè)靈敏度條件下如何壓縮檢測(cè)時(shí)間實(shí)效快速的目的是未來(lái)需要解決的技術(shù)難題之一。常規(guī)進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)都需要2 d以上的增菌培養(yǎng)，這雖然一定程度上降低了檢出限并提高了靈敏度，但是耗費(fèi)了大量檢測(cè)時(shí)間。目前已有相關(guān)方法可以有效縮短甚至不用增菌，如：Qiming Chen等人通過(guò)免疫磁珠及磁性納米粒子進(jìn)行快速富集，使用能作用于克羅諾桿菌屬外膜蛋白A（ompA）的多克隆抗體構(gòu)建免疫磁珠，可以迅速分離目標(biāo)克羅諾桿菌屬，有效縮短富集培養(yǎng)時(shí)間[27]。Xu Di等人采用二氧化硅包裹的磁性納米粒子分離技術(shù)，無(wú)需前期增菌富集。二氧化硅包裹的磁性顆粒具有超順磁性能,可吸附溶液中的核酸分子,在外加磁場(chǎng)作用下將負(fù)載核酸的磁性納米顆?？梢詮臉悠啡芤褐蟹蛛x出來(lái)，磁性納米粒子經(jīng)過(guò)溶液洗脫便可獲得純化的核酸，該技術(shù)提取DNA時(shí)間不到半小時(shí)。

3.2 結(jié)果直觀易讀

直接易讀的檢測(cè)結(jié)果便于實(shí)驗(yàn)人員快速作出判斷，也是未來(lái)快速檢測(cè)發(fā)展的方向。對(duì)于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法主要有電化學(xué)和光學(xué)檢測(cè)，后者適用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)，等溫?cái)U(kuò)增通?？梢院蜔晒馊玖?、免疫試紙條法、濁度法及比色法聯(lián)用。其中紙質(zhì)材料由于其具有輕、薄、便宜、來(lái)源廣泛等特點(diǎn)，由此發(fā)展起來(lái)的側(cè)向流層析試紙條技術(shù)和等溫?cái)U(kuò)增等分子檢測(cè)手段聯(lián)用被廣泛用于病原微生物的快速檢測(cè)領(lǐng)域[28]。姜毓君等人利用免疫磁分離和金納米雜交探針策略，開(kāi)發(fā)了一種快速和靈敏的可視化檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中阪崎克羅諾桿菌的方法，直觀結(jié)果和電泳及紫外掃描光譜結(jié)果一致。

3.3 多重技術(shù)融合

采用兩種及以上檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用，進(jìn)而放大檢測(cè)信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度和特異性，降低結(jié)果的假陽(yáng)性。除等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)外，CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）作為2017年新問(wèn)世的檢測(cè)技術(shù)被譽(yù)為“下一代的分子檢測(cè)技術(shù)”，具有“快速、靈敏、高特異、簡(jiǎn)便、低價(jià)”的特性，被廣泛應(yīng)用于病毒及病原菌的檢測(cè)，其靈敏度與Taqman方法的熒光定量PCR接近[29]。與熒光定量技術(shù)相比，具有無(wú)需大型擴(kuò)增檢測(cè)設(shè)備、成本低等優(yōu)點(diǎn)。Chen JS等人基于CRISPR法將Cas12a和Cas14蛋白與RPA結(jié)合用于HPV病毒的快速檢測(cè)，其靈敏度和特異性都顯著提高，靈敏度達(dá)到了attomolar水平，特異性≤7個(gè)堿基[30-31]。所以CRISPR和等溫?cái)U(kuò)增等技術(shù)結(jié)合用于克羅諾桿菌屬的快速檢測(cè)也是非常值得研究一個(gè)重要方向。

4 結(jié)束語(yǔ)

克羅諾桿菌屬作為一種廣泛分布的食源性致病菌，食品加工的任何環(huán)節(jié)，包括原料的選擇、加工、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸、銷(xiāo)售等環(huán)節(jié)都存在潛在污染風(fēng)險(xiǎn)。食品尤其是嬰幼兒配方乳粉的質(zhì)量安全一直是整個(gè)社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)，這急需科研和檢測(cè)人員開(kāi)發(fā)針對(duì)克羅諾桿菌屬等致病微生物的快速、特異、簡(jiǎn)單、便捷的檢測(cè)技術(shù)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，等溫?cái)U(kuò)增等分子檢測(cè)技術(shù)也將不斷迭代更新，如何高效融合各項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)將是未來(lái)致病微生物快速檢測(cè)技術(shù)需要探索的方向。