歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌的寄主范圍調(diào)查及其寄主抗性物質(zhì)的初步分析

李 永，常聚普，郭利民，孫 尚，楊旭琦，樸春根

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所，北京 100091；2. 濮陽市林科所，河南 濮陽 457000)

速生楊是我國人工林的主要樹種，主要栽培品系為美洲黑楊（Populus deltoidesW. Bartram ex Marshall）和 歐 美 楊（Populus×euramericana(Dode) Guinier）雜交楊的品系，屬于楊柳科楊屬黑楊派成員。歐美楊細(xì)菌性潰瘍病是近年來速生楊上新發(fā)生的病害，發(fā)病初期樹皮輕微開裂，流出白色酸臭汁液，隨后樹皮迅速腐爛降解，危害嚴(yán)重的會導(dǎo)致樹木死亡。賀偉等人報道，2005年在河南省濮陽市首次發(fā)現(xiàn)歐美楊細(xì)菌性潰瘍病害[1]。2006年，山東省菏澤市林業(yè)局觀察到了該病害在菏澤大面積發(fā)生和危害。在隨后幾年里，在天津市、河北省南部和寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市也陸續(xù)觀察到了該病害的危害。Li等人研究證實該病害是由細(xì)菌新物種Lonsdalea populi(Tóth et al. 2013) Li et al. 2017侵染引起的[2-3]。

歐美楊細(xì)菌性潰瘍病是廣發(fā)性病害，在歐洲也有該病害發(fā)生和危害的報道。據(jù)Berruete等人報道，他們2002前后在西班牙歐美楊雜交楊上首次觀察到了該病害發(fā)生和危害[4]。匈牙利人Tóth在2005年前后在匈牙利的雜交楊上觀察到該病害危害[5]。2017年，Abelleira等人在葡萄牙雜交楊上也發(fā)現(xiàn)了歐美楊細(xì)菌性潰瘍病[6]。在寄主方面，在柳樹上也有該病害的發(fā)生和危害的報道。Li等人報道，2017年在菏澤的旱柳（Salix matsudanaf.pendula.）上發(fā)現(xiàn)了與歐美楊細(xì)菌性潰瘍病癥狀類似的病害，并證明該病害也是由L. populi侵染引起[7]。目前，柳樹細(xì)菌性潰瘍病主要在山東省菏澤市和寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市發(fā)生和危害，國外尚無相關(guān)報道。

目前，歐美楊細(xì)菌性潰瘍病在我國主要分布在河南省、山東省、河北省和寧夏回族自治區(qū)四省市自治區(qū)的部分地區(qū)大面積發(fā)生和危害，據(jù)菏澤市林業(yè)局統(tǒng)計，菏澤市2007年有3萬公頃楊樹發(fā)生該病害，最嚴(yán)重的地塊發(fā)病率高達70%，對我國楊樹人工林造成了重大威脅[8]。調(diào)查顯示，歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌的自然寄主有中林46楊、107楊、2025楊、中荷1號楊和旱柳。在寄主范圍和抗性研究方面，郭利民等人利用離體枝條接種的方法研究了中林46楊、旱柳、毛白楊、2025楊、107楊、金絲柳的抗病情況，他們認(rèn)為中林46最感病、旱柳和毛白楊感病，而2025楊，107楊，金絲柳抗病[9]。在歐美楊抗性品種的篩選方面尚無相關(guān)報道。

酚類物質(zhì)被認(rèn)為是一類具有真菌和細(xì)菌活性的抗性物質(zhì)，在植物體內(nèi)廣泛存在[10]。張云霞等人發(fā)現(xiàn)在黑腐病菌侵染過程中，酚類物質(zhì)積累與木質(zhì)素含量增加在植物抗性機制中發(fā)揮重要作用[11]。在楊樹抗病物質(zhì)分析研究中，陽傳和等人證明酚類化合物與楊樹對真菌型潰瘍病抗性顯著相關(guān)[12]。理永霞等人研究發(fā)現(xiàn)，沒食子酸、兒茶酸、苯酚與楊樹對真菌型潰瘍病的抗性密切相關(guān)，香豆酸、對羥基苯甲酸、鄰苯二酚、阿魏酸次之，苯甲酸關(guān)系不大[13]。

本研究將開展柳屬、櫟屬以及楊屬黑楊派、白楊派、青楊派的楊樹對歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌（L.populi）抗性實驗，明確該病原菌的寄主范圍，并對該病原菌具有不同抗性的品系開展抗性物質(zhì)分析，研究結(jié)果將為歐美楊細(xì)菌性潰瘍病害的防治提供重要的技術(shù)支持，對我國歐美楊人工林的保護具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗地介紹

試驗苗圃位于河南省濮陽市林科院的實驗林場內(nèi) (115°05′ E, 35°53′ N)。苗圃占地面積1 hm2，樹齡為3～6年，其中包括美洲黑楊、歐美雜交楊品系、歐洲黑楊、毛白楊和三倍體毛白楊品系、青楊派品系以及柳屬品系，株行距為1 m × 2 m。

櫟屬接種實驗地點位于北京市海淀區(qū)中國林業(yè)科學(xué)研究院后山（116°14′ E, 40°0′ N）的柏樹混交林，優(yōu)勢樹種為柏樹，其它樹種包括栓皮櫟、蒙古櫟、桑樹、酸棗等植物。

1.2 樹種選擇

接種樹種的選擇時，重點考慮楊柳科的楊屬和柳屬的種類或品系，共計選取了50個楊柳品系，其中包括黑楊派35個品系、白楊派4個品系、青楊派7個品系、柳屬4個種（品種）和小美旱楊（楊柳雜交楊），具體品系名稱見表1和表2。櫟屬的栓皮櫟、蒙古櫟也選為了接種材料。櫟屬干部潰瘍病是由Lonsdalea quercina(Hildebrand and Schroth 1967) Brady et al. 2012引起的，該菌與本研究的楊樹細(xì)菌性潰瘍病的遺傳關(guān)系較近，2017年前它們均屬于L. quercina，因此櫟屬也有可能是該病原菌的潛在寄主。

表1 病原菌寄生及危害情況Table 1 Host range and disease occurrence

1.3 田間接種實驗

該病害自然發(fā)病時間為每年4月底—10月底，我們選擇6—8月開展接種實驗以提高實驗的重復(fù)性。本研究開展了連續(xù)兩年的田間接種實驗，分別于2015年8月和2016年7月份，在濮陽市林科院苗圃，每個品系隨機選取3株健康楊樹用于接種實驗。接種前，選取2株致病性較強的病原菌用于實驗，并將這2株病原菌轉(zhuǎn)接到TSA培養(yǎng)皿中30℃培養(yǎng)24 h，為恢復(fù)病原菌的致病力，挑取單菌落再連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3代。第4代培養(yǎng)物用無菌水稀釋為108CFU·mL-1菌懸液備用。無菌脫脂棉用無菌水浸泡，以備接種使用。

田間接種方法：75%酒精表面消毒，用無菌手術(shù)刀在樹皮上劃十字形傷口，然后向傷口中注50 μL菌懸液，覆上浸過水的脫脂棉，并用保鮮膜包裹保濕；每個品系接種3棵樹，每棵樹接種3個點（包括2個病原菌和1個對照），對照為浸過無菌水的脫脂棉。

櫟屬接種：2020年5月底—6月初，分別開展連續(xù)兩次接種實驗，接種樹種為栓皮櫟、蒙古櫟。選取直徑1 cm左右枝干作為接種材料，接種方法同上。

1.4 抗性植株的抗性鑒定

根據(jù)2015年田間初步鑒定結(jié)果，2016年，研究團隊截取表現(xiàn)高度抗性植株的1年生枝段扦插擴繁，并在濮陽歐美楊細(xì)菌性潰瘍病的重災(zāi)區(qū)開展了試種實驗，目前已獲得4年生抗性楊50余株，2～3年生1 000余株，生長性狀良好。

2018和2019年8月，連續(xù)兩年利用人工接種的方法對該楊樹進行抗性鑒定。隨機選取6棵健康植株作為接種對象，每株接種3個點，分別接種2株強致病力病原菌和1個對照，接種方法同上。

1.5 發(fā)病情況調(diào)查

根據(jù)前期接種實驗的經(jīng)驗和病害發(fā)生的規(guī)律，設(shè)計的調(diào)查方法如下：接種3天后去掉保鮮膜，第7天時調(diào)查第一次，每隔7天觀察記錄1次，共觀察3次。調(diào)查時，記錄發(fā)病與否，測量和記錄發(fā)病植株病斑長度和寬度。根據(jù)發(fā)病病斑的大小將寄主抗病性分為5個等級，即高抗（＜ 1 cm）、抗?。?～5 cm）、感?。?～10 cm）、中感（10～15 cm）、高感（＞ 15 cm）。

1.6 抗性活性物質(zhì)分析

抗性物質(zhì)分析實驗中，抗病品種選用豫抗1號楊和107楊，高感病品種為2025楊和中林46楊，每個品系采集2年生枝條5段(5個重復(fù))，每段隨機剝下3小塊樹皮，用枝剪剪成小組織塊置于研缽中，倒入液氮研磨碎，稱取1.0 g磨碎樣品置于100 mL三角瓶中，加入25 mL甲醇超聲提取30 min，然后用10 000 r·min-1離心5 min，取上清液備用。配好沒食子酸、兒茶素、鄰苯二酚等12種化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)液備用，具體名稱見表2。

為了解楊樹染病前后的抗性物質(zhì)含量變化，本實驗選取豫抗1號楊（高抗）和2025楊（高感）作為實驗材料，用手術(shù)刀片將2年生的健康枝段劃出多條傷痕，傷口間距盡量小，然后將病原菌懸浮液接種到傷口，并用保鮮膜包裹保持濕度，對照接種無菌水，為確保實驗的準(zhǔn)確性，本實驗設(shè)5個重復(fù)。接種24 h后，將帶有傷口的樹皮取下按照上述方法粉碎，并提取抗性物質(zhì)，然后對鄰苯二酚、苯甲酸等7種含量較高的化合進行了檢測。

HPLC條件：色譜柱：Sunfire 4.6 × 250 mm 5 μm，檢測波長254 nm。沒食子酸、鄰苯二酚、對羥基苯甲酸、兒茶素、香豆酸、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸，檢測流速：1 mL·min-1，流動相：40%甲醇，pH = 3.0；香草酸、苯甲酸、水楊酸、肉桂酸，檢測流速：0.8 mL·min-1，流動相：60%甲醇，pH = 3.0。

1.7 活性物質(zhì)的抑菌實驗

選取抗病與高感品系間差異明顯的活性物質(zhì)配成0.2%, 0.4%和0.8%的水溶液備用（對微溶于水的物質(zhì)，用前加熱溶解）。病原細(xì)菌在TSA培養(yǎng)皿上培養(yǎng)24 h，用無菌水洗脫并稀釋成108CFU·mL-1菌懸液。吸取200 μL懸浮液置于TSA培養(yǎng)皿上涂勻，然后將配置好的活性物質(zhì)滴于已涂病原菌的培養(yǎng)皿上，待液體吸收后倒置培養(yǎng)24 h觀察記錄實驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 寄主范圍調(diào)查

接種實驗結(jié)果顯示，黑楊派品種是易感品系，而且發(fā)病程度較重（圖1A），然而歐洲黑楊表現(xiàn)出高度抗病性，其中美洲黑楊和歐美雜交楊均有一些高感品系，大部分品系接種后表現(xiàn)感??；旱柳發(fā)病嚴(yán)重，金絲柳表現(xiàn)出輕微潰瘍癥狀（圖1E），雜交柳、垂柳則不發(fā)病。研究還發(fā)現(xiàn)毛白楊及三倍體毛白楊則出現(xiàn)單植株發(fā)病情況（圖1F和G），但是再次接種病菌時，多次重復(fù)均未出現(xiàn)典型歐美楊細(xì)菌性潰瘍病的癥狀，這是非常有趣現(xiàn)象，值得我們進一步研究。銀白楊雖然表現(xiàn)為抗病，但是也形成0.5～0.8 cm × 0.7～0.9 cm的病斑，后期不再擴展。

圖1 接種實驗癥狀Fig.1 Systom of the trees inoculated with L.populi

青楊、小美旱楊、櫟屬植物表現(xiàn)為高度抗病性。在青楊派品系中，除小葉楊表現(xiàn)出輕微的癥狀外（圖1C），其它6個品系均表現(xiàn)為高度抗性。小美旱楊是青楊、新疆楊、旱柳的雜交品系，它表現(xiàn)出對歐美楊細(xì)菌性潰瘍病的高度抗病能力。而栓皮櫟和蒙古櫟均表現(xiàn)為高度抗病性（圖1D）。詳細(xì)結(jié)果見表1。

2.2 黑楊派抗病品種篩選及抗性鑒定

研究結(jié)果顯示，5個歐洲黑楊品系均表現(xiàn)出高度抗性，但它們生長較其它歐美楊慢。在美洲黑楊22個品系中，16-11楊表現(xiàn)為高度抗病，品系131楊、03-59楊、02-212楊、03-34楊、16-06楊表現(xiàn)為抗病，而2025楊、313楊、中荷1號楊、16-09楊表現(xiàn)為高度感??；其它12個品系表現(xiàn)為中感和感病。在歐美雜交楊的7個品系均表現(xiàn)為感病狀態(tài)，中林46楊和2001楊表現(xiàn)為高度感病，中度感病品系有4個，107楊表現(xiàn)為輕度感病，詳細(xì)實驗結(jié)果見表2。另外苗圃中發(fā)現(xiàn)1株歐美楊變異植株表現(xiàn)出了高度抗性，命名為歐抗豫抗1。

發(fā)現(xiàn)抗病植株后，研究團隊將抗病植株進行了扦插繁殖和抗病鑒定，連續(xù)兩年的實驗數(shù)據(jù)一致證明該抗病植株具有高度抗病性。在第一次調(diào)查時，接種點形成0.4～0.5 cm × 0.5～0.8 cm的病斑（圖1B），之后兩次調(diào)查不再擴展，而且在第三次調(diào)查時，接種點已經(jīng)開始愈合。說明該楊樹對歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌具有高度抗性。

2.3 抗性物質(zhì)分析

本研究分析了抗、感病和高感的楊樹品種的樹皮12種化合物的含量，化合物的含量見表3。從表中可以看出，鄰苯二酚、苯甲酸、綠原酸在4個品系楊樹樹皮中的含量存在一定差異，這3種化合物在抗病、感病的品種楊樹中含量差異不明顯，但它們含量比高感楊樹品系（中林46楊和2025楊）高15%～20%。除了以上3種物質(zhì)，兒茶素的含量也較高，在50～61 mg·100 g-1之間，但是4個樣品中含量相似。其它8種化合物的含量較低，如香草酸的含量在5～15 mg·100 g-1之間，而沒食子酸、對羥基苯甲酸、香豆酸、阿魏酸、肉桂酸、水楊酸等6個化合物的含量 ＜ 5 mg·100 g-1，而4個品系的樣品中均未檢測到咖啡酸。因此推測樹皮中鄰苯二酚、苯甲酸、綠原酸與楊樹抗病性有一定關(guān)系。

表3 樹皮中12種化合物含量Table 3 Amount of 12 compound in tree bark mg·100 g-1

2.4 染病前后抗性物質(zhì)變化

結(jié)果顯示，抗病楊接種病原菌24 h后，鄰苯二酚和兒茶素含量迅速升高，其含量分別增加了51.7%和32.6%，而香草酸含量有所下降，下降8%，而苯甲酸和綠原酸等4種化合物均沒有明顯變化（見表4）。在高感楊樹樹皮中，鄰苯二酚和兒茶素的含量沒有明顯增加，香草酸含量有增加的趨勢，增加7.5%，其它的化合物含量低，沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化趨勢（見表4）。因此我們認(rèn)為病原菌的侵染導(dǎo)致抗病楊合成鄰苯二酚和兒茶素的數(shù)量增加，說明這兩種化合物在楊樹與病原菌的互作中起到一定的作用。

表4 染病前后樹皮中7種化合物含量變化Table 4 Amount of 7 compound in tree healthy and infected bark mg·100 g-1

2.5 活性物質(zhì)抑菌實驗

鄰苯二酚、兒茶素是樹皮樣品中含量較高的化合物，而且這兩個化合物在病菌侵染過程中其含量明顯增加，因此本研究開展這2個化合物的抑菌活性實驗。結(jié)果顯示，0.8%的鄰苯二酚和兒茶素都能形成抑菌圈（圖2），鄰苯二酚的抑菌圈較大，直徑1.2～1.3 cm（圖2A），而0.8%兒茶素形成抑菌圈小，抑菌效果可能沒有鄰苯二酚效果好（圖2B）。

圖2 兩種化合物的抑菌實驗結(jié)果Fig.2 Inhibition tests of the two compound

3 討論

歐美楊細(xì)菌性潰瘍病是2000年前后，在歐亞大陸上發(fā)現(xiàn)的由新物種L. populi引起的黑楊桿部新病害，表現(xiàn)為典型潰瘍癥狀，危害嚴(yán)重，病斑長度可達3 m。2006—2010年期間，該病害在我國危害極其嚴(yán)重，在河南省北部、山東省菏澤市、濟寧市發(fā)病面積巨大，發(fā)病嚴(yán)重的地塊發(fā)病率高達60%～70%。據(jù)調(diào)查，該病害發(fā)病率高的地塊主要種植感病品種，如在河南省濮陽市人工林的主栽品系為中林46楊和107楊，一般情況下為兩個品系的混交林；在菏澤市則為中荷1號楊純林或者中荷1號楊和107楊的混交林。調(diào)查還發(fā)現(xiàn)中林46楊與107楊混交栽培可促進該病害在107楊的發(fā)生和危害。本研究中已篩選出了歐美楊細(xì)菌性潰瘍病的高感和抗性品系，其中包括一些生長快抗性好的品系，因此建議在歐美楊細(xì)菌性潰瘍病疫區(qū)盡量種植抗病品系，同時避免與高感品系混交種植。種植抗性品系是歐美楊細(xì)菌性潰瘍病防治最經(jīng)濟、有效的防治方法。

對寄主適應(yīng)性能力方面，歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌表現(xiàn)出很強的變異適應(yīng)能力。2016年前，歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌的自然寄主為黑楊和歐美雜交楊。Li等人報道，在2016年和2017年，分別在山東菏澤和寧夏中衛(wèi)市發(fā)現(xiàn)柳樹細(xì)菌性潰瘍病，并證實該病害病原為歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌[7]。目前柳樹細(xì)菌性潰瘍病主要發(fā)生在山東省菏澤市和寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市。歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌用10多年的時間成功的實現(xiàn)了寄主轉(zhuǎn)移和危害，說明該病菌具有較強的寄主適應(yīng)能力。

本研究還發(fā)現(xiàn)一個非常有意思的現(xiàn)象，在人工接種歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌的情況下，毛白楊和三倍體毛白楊都有發(fā)病個體，出現(xiàn)偶然發(fā)病現(xiàn)象，而且表現(xiàn)出歐美楊細(xì)菌性潰瘍病的典型癥狀，危害非常嚴(yán)重，能形成5～10 cm長的病斑，而且導(dǎo)致大面積樹皮腐爛。然而，第二年用同樣的條件和菌株再次接種該發(fā)病樹時，并未表現(xiàn)癥狀，目前尚不明確是什么因子阻止病原菌入侵和致病。郭利民等人研究認(rèn)為歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌可以侵染三倍體毛白楊的離體枝段[9]。因此我們認(rèn)為歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌具有潛在侵染白楊派楊樹的能力。

本研究中我們雖然發(fā)現(xiàn)美洲黑楊和歐美雜交楊中有極少數(shù)高度抗病植株和抗病品系，但大部分品系為感病品系。調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，生長快的楊樹品系抗性普遍差，很多品系表現(xiàn)出了高度感病狀態(tài)。歐洲黑楊對歐美楊細(xì)菌性潰瘍病具有高度抗性特征，但它較感病楊生長慢。那么為什么美洲黑楊和雜交楊有如此多的感病和高度感病品系呢？可能是育種學(xué)家在楊樹選育過程中著重關(guān)注了楊樹快速生長特性，而忽視或遺失了楊樹本身的抗性基因。因此我們建議育種學(xué)家們在品種選育時，把抗逆性也作為一項重要的需要關(guān)注的指標(biāo)。

在楊樹的抗性物質(zhì)檢測方面，本研究檢測了12種在其它植物上已報的抗菌活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌侵染楊樹時，樹皮中的鄰苯二酚和兒茶素含量會增加，說明這兩種物質(zhì)與楊樹抵抗病菌的入侵有著密切關(guān)聯(lián)，而且實驗證實這兩種化合物對歐美楊細(xì)菌性潰瘍病具有抑菌效果，因此推測這兩種化合物在楊樹抗歐美楊細(xì)菌性潰瘍病中可能起著重要的作用。在楊樹抗性機制研究方面還有其它未知的活性物質(zhì)需要進一步研究。除此以外，抗性基因、激素等方面也是研究的熱點，劉振陽等研究認(rèn)為抗病品種‘毛白楊’對歐美楊細(xì)菌性潰瘍病的抗性是通過病菌誘導(dǎo)了基因PR1-1、PR1-2、NPR1-1、NPR1-2、TGA1、TGA2、MYC2-1、MYC2-2的上調(diào)表達以及基因JAZ1、COI1-1、COI1-2的下調(diào)表達，開啟了SA和JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的結(jié)果，基因?qū)用娴难芯恳矁H此一篇報道，因此也需要進一步研究[14]。

4 結(jié)論

楊柳科植物是歐美楊細(xì)菌性潰瘍病菌的主要寄主，楊屬黑楊派中除歐洲黑楊對該病菌具有高度抗性外，美洲黑楊、歐美雜交楊的大部分品系均為高度感病和感病品種；本研究中僅有16-10楊和豫抗1號表現(xiàn)為高抗病；毛白楊和三倍體毛白楊也具有自然發(fā)病的風(fēng)險；除小葉楊外，本研究選用的青楊派品系均為高度抗性；柳屬中旱柳屬于高感病種類；病原菌侵染能夠引起抗病楊樹皮中的鄰苯二酚、兒茶素含量的迅速增加，說明兩種化合物與寄主抗性密切相關(guān)。本研究中明確了高抗和高感楊樹品系，為了有效防治歐美楊細(xì)菌性潰瘍病，我們建議速生楊栽培區(qū)域改種抗病品種，同時避免與高感病品種混交種植。