TLR4和SOCS3參與不明原因復發(fā)性流產母胎界面免疫紊亂的機制研究

宋小俠 喻圣鈞 董濤威 梅珊珊

復發(fā)性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）是常見的妊娠合并癥，染色體異常、感染因素、內分泌異常、生殖系統(tǒng)解剖結構異常、血栓前狀態(tài)、自身免疫性疾病、男方精液異常、外界因素如環(huán)境、職業(yè)等均可導致RSA 的發(fā)生，但該疾病仍有50%-75%患者病因不明，稱之為不明原因復發(fā)性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）［1，2］。TOLL 樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）通過多種機制參與URSA 的發(fā)生，但TLR4 的調控因素尚不明確。細胞因子信號傳導抑制因子3（suppressor of cyto?kine signal?3，SOCS3）是機體常見的、具有多項調節(jié)功能的蛋白質分子。而目前，關于TLR4 及SOCS3 在URSA 發(fā)病中的作用研究報道甚少。本次研究通過檢測和比較半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase 3）、TLR4、SOCS3 的表達，以探討其在URSA 發(fā)病機制中的作用，從而為URSA 診治提供一定的理論依據。

1 臨床資料

1.1 一般資料隨機選取2019 年08 月-2020 年01 月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心婦產科就診的孕婦共計60 例，分為研究組（URSA 組）和對照組（正常早孕組），每組各30 例。研究組患者12周以內發(fā)生≥3次自然流產，就診時經病史詢問、查體和B超診斷為胚胎停育，且經系統(tǒng)性流產病因篩查排除遺傳、解剖、感染、內分泌、自身抗體、血栓前狀態(tài)、男方精液異常。對照組患者為同期要求行人工流產的早孕婦女，超聲提示宮腔內可見胚芽和胎心搏動，既往有正常妊娠、分娩史，無自然流產、死胎、死產史。所有患者均無抽煙、酗酒、有毒物品接觸史，無高血壓、糖尿病、腎病病史，近3個月未經任何免疫治療和接種，也未使用過任何調節(jié)免疫功能藥物。

1.2 方法無痛清宮/人流術前經兩組患者知情同意，于術中留取絨毛組織。在無菌條件下，由經驗豐富的手術醫(yī)生實施負壓吸引術，留取相對完整的絨毛組織，組織直徑約2-4 cm，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌標本后，即刻置于-80℃冰柜或液氮罐中，用于Western blot 檢測。

1.3 檢測試劑和儀器Trizol（MRC，TR118?500）、M?MLV Reverse Transcriptase（Promega，M1705）、ChamQ SYBR qP?CR Master Mix（Vazyme，Q341?03），Real?time Quantitative PCR（ABI，StepOne Plus），基因擴增儀（Hema，Hema9600），電泳儀（Tanon，EPS200/300），電泳槽（北京百晶生物技術有限公司，101?510?001）。

1.4 實時定量PCR 檢測絨毛組織中TLR4、SOCS3 的表達采用Trizol 法常規(guī)提取絨毛組織滋養(yǎng)細胞RNA，按照M?MLV Reverse Transcriptase 逆轉錄試劑盒說明，將RNA 逆轉錄為cDNA，以GAPDH作為內參，TLR4、SOCS3特異性引物作PCR擴增，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析儀成像并半定量分析DNA帶的含量，以所測樣品的積分吸光度與內參GAPDH積分吸光度的比值代表半定量值。所有引物設計由上海捷瑞引物合成公司提供，引物序列見表1。

表1 引物序列及其大小

1.5 Western blot 法檢測絨毛組織中Caspase 3 表達取-80℃冰箱中絨毛組織提取總蛋白，用BCA 試劑盒檢測總蛋白濃度，提取細胞蛋白定量后，經SDS?PAGE 電泳后將蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉，將相應的一抗兔抗人Caspase 3（cst 公司，貨號9662s，1∶1000）4℃孵育過夜，用TBST洗滌7 min（2次），以相應的二抗（以1∶5000）室溫下孵育1-2 h，用TBST 洗滌7 min（3 次），進行化學發(fā)光顯影（ECL，F(xiàn)orevergen），用Image J分析目標條帶的光密度值。以GAPDH（HC301，1∶5000）作為內參照，比較兩組蛋白表達的差異。

1.6 統(tǒng)計學分析采用SPSS 25.0 軟件對數據進行統(tǒng)計學處理，計量資料用（）表示，兩組計量資料比較，符合正態(tài)分布和方差齊性的數據采用獨立樣本t檢驗，如不滿足以上條件，則采用兩獨立樣本比較的Wilcoxon 秩和檢驗。設定檢驗水準α=0.05，P<0.05 為有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 臨床一般資料情況比較研究組患者年齡23-34 歲，平均年齡（30.0±2.90）歲，孕周40-56 天，平均孕周（49.0±4.30）天。對照組患者年齡26-35 歲，平均年齡（30.8±2.50）歲，孕周40-64 天，平均孕周（47.3±6.83）天。兩組患者年齡和孕周比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.2 絨毛組織中TLR4、SOCS3 基因表達見表2。

表2 兩組絨毛組織TLR4、SOCS3 基因表達水平比較

2.3 絨毛組織中TLR4、SOCS3 基因的Spearman 相關性分析見圖1。

圖1 研究組TLR4 和SOCS3 基因表達相關性

2.4 絨毛組織中caspase 3 表達差異見圖2。

圖2 兩組caspase 3 蛋白免疫印跡電泳圖

3 討 論

母胎界面是一個獨特的免疫部位，適當的炎性反應有助于母胎免疫平衡的建立和妊娠的維持，過度的炎癥反應導致不良的妊娠結局。

TLR4是目前研究熱點之一，廣泛表達于多種免疫細胞和非免疫細胞。在多數妊娠疾病中，TLR4在免疫細胞或母體來源細胞中的表達上調，導致母胎界面異常，產生促炎癥細胞因子［3］。在本研究中，兩組絨毛組織中均可檢測到TLR4，研究組TLR4表達明顯上調（見表2），我們認為TLR4是導致URSA的原因之一。Li等人［4?6］通過蛻膜、絨毛和外周血標本的研究，亦得出RSA 患者中TLR4 表達上調的結果，與本研究結果一致。但Kolben等人［7］通過胎盤標本研究結果發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠組相比，RSA患者TLR4表達顯著降低。TLR4在胎盤組織中的表達，在整個妊娠過程中并不是連續(xù)的，而具有一定趨勢，并且不同類型的滋養(yǎng)細胞TLR4 表達亦不相同［3］。本研究結果與Kolben 等人的研究結果之所以不同，可能與TLR4差異性表達、實驗取材部位不同等因素有關。

TLR4通過信號轉導導致過量炎性介質的釋放［8］，炎性因子水平的提高會促進凋亡蛋白Caspase 3的表達。如上文中圖2 所示，研究組可檢測到Caspase3 表達，且與對照組相比C?Caspase 3明顯增加，引起滋養(yǎng)細胞凋亡，從而導致胚胎停育。

生理狀態(tài)下，機體存在復雜的調控機制，以維持機體免疫反應平衡，SOCS3 是非常重要的調控因子之一，在妊娠免疫調節(jié)中起重要作用。在本研究中，研究組SOCS3 表達上調，與對照組比較，有統(tǒng)計學差異（見表2），本研究認為SOCS3 亦是導致URSA 原因之一。目前關于SOCS3 對RSA作用機制的研究，都集中于SOCS3 對JAK 激酶/信號轉導和轉錄激活因子通路的調節(jié)。而關于SOCS3 對TLR4 信號通路的調控，國內外研究甚少，且存有有爭議。有研究［9?11］認為該調控是負向調節(jié)，也有研究［12］認為該調控是正向調節(jié)，但在URSA 領域國內外均未見報道。本研究中TLR4 表達和SOCS3表達呈正相關（見圖1），提示SOCS3并非一直是負向調節(jié)，我們更傾向于認為SOCS3 對TLR4 信號通路的調控應該是動態(tài)調節(jié)，但其具體的作用機制尚不完全清楚。

妊娠是一個極其復雜的生理過程，需要母體免疫系統(tǒng)的協(xié)同參與和精準調節(jié)才能成功維持妊娠。在URSA 中，確定母胎免疫耐受的細胞和分子機制對于進行針對性的治療措施具有重要意義。TLR4、SOCS3 的異常表達，可引起母胎界面免疫失衡導致URSA 發(fā)生。在URSA 中，SOCS3如何調控TLR4 信號通路，尚需進一步探索。