CP-25抑制Th17細(xì)胞分化改善MRL/lpr狼瘡小鼠腎損傷

黃李娜，王盛付，王 祥，徐 靚，袁曉陽，蒯佳婕，魏 偉，嚴(yán)尚學(xué)

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，安徽抗炎免疫藥物協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種病因復(fù)雜的全身性疾病[1]，其異常免疫產(chǎn)生的大量自身抗體與自身抗原形成免疫復(fù)合物沉積，可導(dǎo)致多種臟器和結(jié)締組織損傷。腎臟是SLE病情發(fā)展變化過程中常見的受累臟器，多發(fā)展為狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)，LN不僅是影響SLE預(yù)后的重要因素，也是引起終末期腎臟病的常見原因，需要進(jìn)行積極防治。輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17)在SLE和慢性炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)是Th17細(xì)胞分泌的一種促炎細(xì)胞因子，與多種自身免疫病發(fā)病機制有著密不可分的聯(lián)系[2-3]。在SLE患者和易患狼瘡的小鼠中發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞數(shù)量增加和IL-17水平升高，患者血漿中IL-17水平與腎臟病變及狼瘡活動指數(shù)呈正相關(guān)[4]，這些都提示Th17和IL-17的水平與SLE疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

芍藥苷-6′-O-苯磺酸酯(CP-25)為本課題組合成的新型化合物。研究發(fā)現(xiàn)，CP-25 可調(diào)節(jié)T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞功能，對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征等自身免疫性疾病動物模型均具有較好的治療作用[5]。SLE以T細(xì)胞、B細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞功能紊亂造成的自身免疫為特征，臨床主要以激素類和免疫抑制劑治療，缺少高效、低毒的治療藥物。CP-25作為天然藥物來源的小分子化合物，是否可以通過抑制Th17細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)對SLE發(fā)揮治療作用尚未見報道。MRL/lpr小鼠由于Fas基因缺失，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞異常增殖、腎功能損傷、抗雙鏈DNA(anti-dsDNA)水平升高，表現(xiàn)與人類狼瘡樣臨床特征類似，故常用作SLE的動物模型?；诖耍緦嶒灁M探究CP-25對MRL/lpr狼瘡小鼠腎臟損傷的治療作用及調(diào)控Th17細(xì)胞分化的機制，為CP-25臨床用于LN防治提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑CP-25為純度大于98%的白色粉末，由安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所提供，使用時溶解于羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)中。醋酸潑尼松(批號：180505)為浙江仙琚制藥產(chǎn)品；抗小鼠CD3-PE(批號：8051834)、CD4-FITC(批號：8361803)、IL-17A-PE(批號：8302116)、CD69-PE-cy7(批號：8046564)流式抗體為BD Biosciences公司產(chǎn)品；STAT3(批號：7)和p-STAT3(批號：34)抗體為CST公司產(chǎn)品；抗RORγt抗體(批號：NBP2-24449)為Novus公司產(chǎn)品；CD3(批號：B302116)、CD28(批號：B308009)單克隆抗體、重組小鼠TGF-β(批號：B302236)、IL-6(批號：B309018)和IL-23(批號：B304416)為Biolegend公司產(chǎn)品；抗小鼠IL-17A預(yù)包被ELISA檢測盒(批號：1211702)購自達(dá)科為生物技術(shù)公司、小鼠抗雙鏈DNA(IgG)Elisa檢測盒(批號：M10014300)購自武漢華美生物技術(shù)公司；佛波肉豆蔻醋酸(PMA)(批號：B302116)、離子霉素(批號：FMS20190819001)、布雷非德菌素A(BFA)(批號：FMS2019122301)和刀豆蛋白(ConA)(批號：FMS20190619001)購自福麥斯公司。

1.2 動物SPF級MRL/lpr小鼠，♀，40只，(25-35)g，10-12周，購自上海斯萊克有限責(zé)任公司,SCXK(滬)2017-0005；SPF級BALB/c小鼠，♀，8只，(20-25)g，10-12周，購于安徽醫(yī)科大學(xué)SPF級實驗動物中心,SCXK(皖)2017-001。本實驗已通過安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所動物實驗倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.3 主要儀器瑞士Tecan公司全波長多功能酶標(biāo)儀(型號：Infinite M1000 Pro)、美國Beckman公司流式細(xì)胞儀(型號：CytoFLEX)、美國GE公司熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號：ImageQuant LAS 4000)、ABI公司實時熒光定量PCR系統(tǒng)(型號：7500)。

2 方法

2.1 實驗分組與給藥將MRL/lpr小鼠隨機分為5組，分別為模型組、CP-25組(20、40、80 mg·kg-1)和醋酸潑尼松(5 mg·kg-1)組，另設(shè)BALB/c小鼠為正常對照。動物飼養(yǎng)在SPF級動物實驗室，給予正常飲食飲水，采用半定量尿蛋白試紙測量小鼠的尿蛋白水平，當(dāng)尿蛋白大于1 μg·L-1時開始給藥，正常組和模型組均給予等量溶媒。給藥6周后，眼眶取血，頸椎脫臼處死小鼠。將眼眶血靜置2 h，2 000 r·min-1離心10 min，收集上清，即為血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 組織病理學(xué)檢查處死小鼠，打開腹腔，取出腎臟，置于組織固定液中24 h，石蠟包埋后，制成薄的組織切片，HE染色。置于40倍物鏡下觀察，拍照，分析各組小鼠腎臟組織病理學(xué)改變情況。

2.3 脾臟指數(shù)以及T細(xì)胞增殖的檢測無菌環(huán)境中取出脾臟，稱量脾臟重量，按照每100 g體質(zhì)量的脾臟質(zhì)量比，計算脾臟指數(shù)。

將脾臟置于無菌培養(yǎng)皿中，加淋巴細(xì)胞分離液研磨，過200目篩后800×g離心30 min，取中間玻璃層，加生理鹽水洗滌，離心，得到的淡黃色沉淀即是脾臟淋巴細(xì)胞。加生理鹽水重懸，調(diào)整脾臟淋巴細(xì)胞懸液濃度(1×1010個·L-1)，在96孔培養(yǎng)板上每孔加入100 μL細(xì)胞懸液(終濃度為5×109·L-1)和ConA(終濃度3 mg·L-1)，終容積為200 μL，各設(shè)3個復(fù)孔，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，加入20 μL CCK-8試劑，避光37 ℃孵育1-3 h，酶標(biāo)儀檢測A450 nm值，分析統(tǒng)計。

2.4 體外誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化制備小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液并調(diào)整適宜細(xì)胞濃度。先用抗CD3單抗(5 mg·L-1)包被96孔板，37 ℃孵育2 h后置于4 ℃?zhèn)溆谩Ｔ诳装逯邢燃尤?00 μL細(xì)胞，再加入CD28(2.5 mg·L-1)、TGF-β(20 mg·L-1)、IL-6(10 mg·L-1)和IL-23(30 μg·L-1)建立誘導(dǎo)Th17分化條件，最后分別加入不同濃度的CP-25(1×10-5，1×10-6和1×10-7mol·L-1)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，定向誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。另設(shè)立分化對照組，不加CP-25。培養(yǎng)5 d后離心取上清，下層細(xì)胞團(tuán)加入TRIzol置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞亞群常規(guī)制備小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞至適宜濃度，分別加入CD3-PE、CD4-FITC和CD69-PE-cy7流式抗體，4 ℃孵育40 min后洗滌離心，重懸后上機檢測CD3+細(xì)胞及CD4+CD69+細(xì)胞比例。

Th17細(xì)胞比例檢測：收集小鼠脾臟淋巴細(xì)胞和體外誘導(dǎo)后的細(xì)胞，用PMA、離子霉素和BFA混合物刺激處理4 h后，離心，收集細(xì)胞團(tuán)重懸，加入CD4-FITC，4 ℃避光孵育45 min；經(jīng)固定破膜處理后加入IL-17A-PE，4 ℃避光30 min，洗滌離心，重懸上機，檢測CD4+IL-17A+細(xì)胞比例。

2.6 熒光定量PCR檢測IL-17A的mRNA水平用TRIzol一步法獲取小鼠脾臟和體外誘導(dǎo)后細(xì)胞中的總RNA，定量合成cDNA，將擴增試劑、引物和cDNA按照說明書混合，按說明書設(shè)定程序擴增，以GAPDH為參照，采用相對定量法=2-ΔΔT分析熒光定量結(jié)果。相關(guān)引物序列如下：

IL-17A：F 5′-TTCAGGGTCGAGAAGATGCT-3′，R 5′-AAACGTGGGGGTTTCTTAGG-3′；

GAPDH：F 5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3′，R 5′-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3′。

2.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)收集小鼠脾臟組織和實驗細(xì)胞，按比例(組織裂解液 ∶蛋白酶抑制劑 ∶磷酸酶抑制劑=100 ∶1 ∶1)加入，充分研磨，冰上裂解30 min后離心取上清得到總蛋白，BCA蛋白定量；電泳；轉(zhuǎn)膜；室溫5%牛奶封閉90 min；加入一抗(STAT3、p-STAT3、RORγt和β-actin)4 ℃孵育過夜；次日洗滌后加入二抗37 ℃孵育90 min；洗膜顯影。采用Image J軟件進(jìn)行目的蛋白的灰度值檢測并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.8 ELISA法檢測自身抗體與細(xì)胞因子水平檢測小鼠血清中抗dsDNA、IL-17A水平以及細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-17A的水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行實驗操作，將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入酶標(biāo)板中，設(shè)空白對照，加檢測抗體，孵育，洗滌，加酶孵育，再次洗滌，加顯色液反應(yīng)5-30 min后，加終止液，10 min內(nèi)，采用酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm波長處的IOD值，依據(jù)說明書以及蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度。

2.9 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件分析實驗所得數(shù)據(jù)，采用One-Way ANOVA分析方法比較多組間數(shù)據(jù)，使用 GraphPad Prism 6.0軟件繪制結(jié)果統(tǒng)計圖。

3 結(jié)果

3.1 CP-25對MRL/lpr小鼠腎臟病理的影響檢測小鼠腎臟組織病理學(xué)(Fig 1)結(jié)果顯示，MRL/lpr小鼠腎臟體積明顯增大，鏡下可見腎小球球體增大變形，腎小球基底膜斷裂(a)，入球小動脈玻璃樣變性(b)，腎間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤(c)，系膜細(xì)胞異常增生(d)；CP-25給藥可明顯抑制腎小球形變，減輕腎小球炎性細(xì)胞浸潤，抑制系膜細(xì)胞的異常增生，對小鼠腎臟病理有明顯改善作用。

Fig 1 Effect of CP-25 on renal pathology in MRL/lpr mice(×400)

3.2 CP-25對MRL/lpr小鼠脾臟指數(shù)和T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響脾臟指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果(Fig 2A)顯示，與正常組比較，MRL/lpr小鼠的脾臟指數(shù)明顯增高(P<0.01)；CP-25(20、40、80 mg·kg-1)和醋酸潑尼松(5 mg·kg-1)給藥均可明顯降低小鼠脾臟指數(shù)(P<0.01)。T細(xì)胞增殖能力統(tǒng)計結(jié)果顯示(Fig 2B)，與正常組比較，模型組動物的T細(xì)胞增殖能力增加(P<0.01)，CP-25和醋酸潑尼松給藥可不同程度地抑制T淋巴細(xì)胞增殖(P<0.05，0.01)。

Fig 2 Effect of CP-25 on spleen index and T cell proliferation of splenic lymphocytes of MRL/lpr mice n=6)

3.3 CP-25對MRL/lpr小鼠T細(xì)胞亞群百分比的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果(Fig 3)顯示，與正常組相比較，MRL/lpr小鼠總T細(xì)胞(CD3+)、活化T細(xì)胞(CD4+CD69+)與Th17細(xì)胞(CD4+IL-17+)的比例均明顯升高(P<0.05)；CP-25(20、40和80 mg·kg-1)及醋酸潑尼松(5 mg·kg-1)給藥均可不同程度地降低其比例(P<0.05,0.01)。

3.4 CP-25對MRL/lpr狼瘡鼠脾臟組織中IL-17A的mRNA水平的影響qPCR檢測結(jié)果表明(Fig 4)，與正常組比較，MRL/lpr小鼠脾臟組織中的IL-17A mRNA表達(dá)升高(P<0.01)；與模型小鼠比較，CP-25和醋酸潑尼松給藥均可降低IL-17A的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)。

3.5 CP-25對MRL/lpr小鼠血清中抗dsDNA和IL-17A水平的影響檢測小鼠血清中抗dsDNA和IL-17A水平(Fig 5)發(fā)現(xiàn)，模型小鼠血清中抗dsDNA和IL-17A水平均明顯升高(P<0.01)；CP-25和醋酸潑尼松給藥可降低小鼠血清中抗dsDNA(P<0.01)和IL-17A水平(P<0.01)。

Fig 3 Effect of CP-25 on T cell subsets in splenic lymphocytes of MRL/lpr mice n=6)

Fig 4 Effect of CP-25 on IL-17A mRNA expression level in spleen tissues of MRL/lpr mice n=6)

Fig 5 Effect of CP-25 on serum level of anti-dsDNA and IL-17A in MRL/lpr mice n=6)

3.6 CP-25對MRL/lpr小鼠脾臟中RORγt和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響檢測小鼠脾臟組織中的RORγt和p-STAT3的蛋白表達(dá)水平，模型小鼠RORγt和p-STAT3水平升高(P<0.01)，但總的STAT3水平無明顯差異(Fig 6A)；CP-25和醋酸潑尼松給藥后，各給藥組脾臟組織中上述目的蛋白表達(dá)相對于模型組均有不同程度降低(P<0.05,P<0.01)(Fig 6B)，各組總STAT3無明顯變化。

3.7 CP-25體外給藥對Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響

3.7.1CP-25體外給藥對誘導(dǎo)Th17細(xì)胞百分比的影響 為了進(jìn)一步觀察CP-25對Th17細(xì)胞分化的影響，體外采用TGF-β、IL-6和IL-23誘導(dǎo)小鼠脾臟單個核淋巴細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示(Fig 7)，誘導(dǎo)刺激后的Th17細(xì)胞百分比明顯升高(P<0.01)，體外給予CP-25(10-5、10-6、10-7mol·L-1)后，Th17細(xì)胞亞群比例減少(P<0.01)。

3.7.2CP-25體外對誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞中RORγt和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 進(jìn)一步檢測體外誘導(dǎo)的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的RORγt和p-STAT3蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示(Fig 8)，與非刺激誘導(dǎo)組比較，誘導(dǎo)刺激細(xì)胞的RORγt(P<0.01)和p-STAT3(P<0.05)的蛋白表達(dá)水平明顯升高，CP-25均可不同程度降低RORγt(P<0.05)和p-STAT3(10-5、10-6mol·L-1，P<0.05)蛋白表達(dá)水平，各組總STAT3水平無明顯變化。

Fig 6 Effect of CP-25 on expression of p-STAT3 and RORγt protein in spleen tissues of MRL/lpr mice n=3)

Fig 7 Effect of CP-25 on Th17 cell percentage in vitro

Fig 8 Effect of CP-25 on expression of p-STAT3 and RORγt protein in mouse splenic lymphcytes n=3)

3.7.3CP-25體外對誘導(dǎo)脾臟淋巴細(xì)胞的IL-17A mRNA水平和上清培基中細(xì)胞因子IL-17A的影響 在刺激劑誘導(dǎo)細(xì)胞向Th17方向分化后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-17A水平相對于對照組明顯上升(Fig 9A)，CP-25(10-5、10-6、10-7mol·L-1)可明顯降低IL-17A水平(P<0.01)。收集細(xì)胞，檢測IL-17A mRNA水平結(jié)果顯示(Fig 9B)，刺激劑誘導(dǎo)后IL-17A mRNA水平明顯升高，CP-25(10-5、10-6、10-7mol·L-1)同樣可以降低IL-17A mRNA水平(P<0.01)。

Fig 9 Effect of CP-25 on level of IL-17A cytokines and expression of IL-17A mRNA in n=4)

4 討論

SLE是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫病，由先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的異常激活引起。大量自身抗體的生成并沉積于臟器可導(dǎo)致多器官損傷，尤其是腎臟的損傷，出現(xiàn)蛋白尿、腎臟衰竭，嚴(yán)重的可危及生命。CP-25對小鼠膠原性關(guān)節(jié)炎、大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎以及小鼠干燥綜合征等自身免疫病模型具有明顯治療作用[6]。MRL/lpr小鼠是經(jīng)典的自發(fā)性SLE動物模型，以T細(xì)胞激活、產(chǎn)生大量自身抗體等免疫功能紊亂為特征、導(dǎo)致脾臟病理性腫大和明顯的間質(zhì)性腎炎。本研究結(jié)果表明，CP-25可降低MRL/lpr小鼠脾臟指數(shù)，降低血清中抗dsDNA水平，抑制腎小球形變，減輕腎小球炎癥性細(xì)胞浸潤，抑制系膜細(xì)胞的異常增生，提示CP-25對MRL/lpr小鼠的腎臟病變具有明顯的治療作用。

在SLE發(fā)病過程中，T細(xì)胞亞群比例和功能明顯異常，在促進(jìn)炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生和浸潤靶組織等方面發(fā)揮重要作用[7]。作為主要的促炎性T細(xì)胞亞群，Th17細(xì)胞主要分泌特異性促炎細(xì)胞因子IL-17，參與了SLE治療中的糖皮質(zhì)激素抵抗，募集單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞并刺激產(chǎn)生各種炎性介質(zhì)，促進(jìn)生發(fā)中心的形成和自身免疫發(fā)展[8]。SLE患者血清中IL-17水平與疾病活動度、抗dsDNA水平之間也存在正性相關(guān)。維A酸相關(guān)孤獨受體γ-t(retinoic acid-related orphan nuclear hormone receptor γ-t，RORγt)是一種特異性轉(zhuǎn)錄因子，參與Th17細(xì)胞分化和功能調(diào)控，缺少RORγt會導(dǎo)致Th17細(xì)胞活性下降，IL-17表達(dá)水平嚴(yán)重降低。本研究中，CP-25給藥可明顯降低MRL/lpr小鼠總T細(xì)胞(CD3+)、活化T細(xì)胞(CD4+CD69+)以及Th17細(xì)胞(CD4+IL-17+)比例，降低小鼠血清中IL-17A水平，同時，還可以降低脾臟組織中IL-17A的mRNA表達(dá)水平以及RORγt的蛋白表達(dá)水平，這些結(jié)果均表明CP-25可有效降低MRL/lpr小鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞的比例。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription proteins，STAT3)可調(diào)控IL-17分泌、T細(xì)胞分化和促進(jìn)T細(xì)胞遷移，抑制STAT3信號可以延遲狼瘡易發(fā)小鼠自身免疫的發(fā)生[9]，降低淋巴細(xì)胞積累，抑制T細(xì)胞遷移，從而改善腎臟損傷。STAT3信號在狼瘡患者中明顯異常，腹腔注射小分子STAT3抑制劑可延緩MRL/lpr小鼠的蛋白尿發(fā)作并降低自身抗體滴度[10]，在T細(xì)胞中不表達(dá)STAT3的狼瘡小鼠也不會發(fā)展為淋巴結(jié)病、脾腫大或腎小球腎炎[11]。通過使用基因敲除小鼠模型，已證明STAT3能與Th17細(xì)胞的IL-17啟動子直接結(jié)合[12]，提示T細(xì)胞特異性STAT3缺失可顯著影響IL-17的表達(dá)。在本研究中，MRL/lpr小鼠脾臟組織中STAT3蛋白的磷酸化水平明顯升高，給予CP-25治療后的小鼠p-STAT3降低。在體外誘導(dǎo)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞向Th17分化，加入CP-25后，STAT3磷酸化水平亦降低，RORγt轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達(dá)減少，從而降低Th17比例，IL-17A mRNA相對表達(dá)水平下降，上清分泌的IL-17A細(xì)胞因子明顯減少。這些結(jié)果提示CP-25可抑制T淋巴細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，降低Th17細(xì)胞比例和IL-17產(chǎn)生。

綜上所述，CP-25可明顯改善MRL/lpr小鼠腎臟病變，其機制與降低p-STAT3水平，抑制Th17分化和IL-17產(chǎn)生有關(guān)。