FcRn對新型抗西尼羅河病毒單抗MIL94體內(nèi)藥代動力學的影響

相亞楠，王靈超，高 尤，張文鵬，莊笑梅

(1.天津大學化工學院，天津 300072；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，北京 100850)

西尼羅熱是由西尼羅河病毒引起的一種人畜共患性傳染病，自1999年起首次在北美洲大面積流行[1]。目前無批準上市的疫苗及藥物用于西尼羅河熱的預防和治療。雖然我國尚無該病的病例報告，但作為潛在的傳染性疾病，亟需開發(fā)儲備藥物。MIL94是由軍事醫(yī)學研究院研究的全人源單克隆抗體，前期小鼠染毒試驗結(jié)果顯示能夠全保護病毒感染(數(shù)據(jù)未公開)，正在進行系統(tǒng)的臨床前藥代動力學研究。

單抗藥物(mAB)與傳統(tǒng)的小分子藥物相比，具有完全不同的理化特性，其分子質(zhì)量、體積和極性都遠遠大于小分子。這些特性使得單抗藥物在體內(nèi)吸收、分布和消除等過程與小分子藥物不同[2]。單抗的消除途徑主要有3種：1)蛋白酶水解。單抗藥物因相對分子質(zhì)量較大不會經(jīng)腎臟直接濾過，可在蛋白酶的作用下降解為肽段，被機體重新利用。這種水解是非特異性的，在單抗藥物的消除中貢獻率也比較低。2)免疫系統(tǒng)清除。機體的可溶性抗原與單抗結(jié)合形成免疫復合物，繼而被免疫系統(tǒng)清除。同時單抗藥物可能在體內(nèi)引起免疫反應而產(chǎn)生抗藥物抗體，單抗藥物與之結(jié)合后隨即被免疫系統(tǒng)清除。3)溶酶體水解。單抗藥物可以與細胞表面膜結(jié)合型抗原結(jié)合或與細胞表面Fcγ(可結(jié)合IgG)受體結(jié)合后內(nèi)吞至細胞內(nèi)，也可以非特異性吞飲的方式進入細胞，然后被細胞內(nèi)的溶酶體降解成肽段和氨基酸[3]。

新生兒受體(FcRn)是影響抗體半衰期的主要原因[4]。FcRn是由大小兩個亞基組成的異源二聚體，大亞基分子量為45-53 ku，稱為α鏈；小亞基是β 2微球蛋白(β2m)，分子量為14 ku，稱為β鏈，兩條鏈以非共價鍵的形式結(jié)合在一起。β 2微球蛋白對于FcRn功能有重要的作用，α鏈必須和β 2微球蛋白裝配后才能發(fā)揮轉(zhuǎn)運作用。α鏈與MHC I類分子一樣，具有α1、α2和α3 3個胞外功能區(qū)、1個跨膜區(qū)和1個胞質(zhì)尾區(qū)。由44個氨基酸殘基組成的胞質(zhì)尾區(qū)，可能含有介導胞內(nèi)途徑的信號[5]。FcRn與抗體或蛋白的結(jié)合具有pH依賴性，在生理pH為7.4時，F(xiàn)cRn不與IgG結(jié)合，但是在內(nèi)涵體酸性(pH 6.0-6.5)的條件下，F(xiàn)cRn與核內(nèi)體中IgG的Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合，保護IgG不被降解，從而延長了IgG的血清半衰期。FcRn延長內(nèi)源性IgG和白蛋白的循環(huán)半衰期的作用已經(jīng)在體內(nèi)外研究中廣泛證實，在FcRn敲除小鼠體內(nèi)內(nèi)源性IgG和白蛋白的半衰期明顯縮短[6-7]。IgG的Fc片段與FcRn受體結(jié)合起關(guān)鍵性作用，并且在Fc上特異性變異可以明顯提高與FcRn的親和力[8]，為單抗藥物設計開發(fā)提供了優(yōu)化方向。

本文擬在表達不同種屬FcRn的小鼠體內(nèi)進行MIL94的藥代動力學研究，觀察比較FcRn與MIL94體內(nèi)消除和分布的關(guān)系，預期該抗體在人體內(nèi)的藥代特征。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器酶標儀(德國BMG LABTECH公司)；微量加樣器(德國Eppendorf公司)；低溫離心機(美國Thermo公司)；微量振蕩器(廣州SCILOGEX公司)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；小動物呼吸麻醉機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；洗板機(北京天石天力醫(yī)療器械技術(shù)開發(fā)中心)；96孔板(美國Thermo公司)。

1.2 實驗藥品與試劑MIL94單克隆抗體(浙江海正藥業(yè)有限公司，批號：190401)；包膜蛋白(Envelope Protein，美國Sino Biological公司，批號：40345-V08Y)；羊抗人IgG-HRP(北京Solarbio公司，批號：SE101)，HRP為辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase)；TMB顯色液(四甲基聯(lián)苯胺，3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，美國Invitrogen公司，批號：00-4201-56)；包被液：碳酸鈉碳酸氫鈉緩沖液(碳酸鈉、碳酸氫鈉均為國藥集團化學試劑有限公司)；PBS(美國Gibco公司，批號：C10010500BT)；洗滌液：PBST溶液(含0.05% Tween 20的PBS，Tween 20為國藥集團化學試劑有限公司，批號：120216)；酪蛋白封閉液(美國SIGMA公司，批號：C5890)；促凝采血管(美國BD公司，添加SST Amber高分子凝膠促凝，批號：9136623)；靜脈注射用人免疫球蛋白(IVIG，Intravenous immunoglobulin，河北大安制藥有限公司，批號：B20200201)；1 mL注射器(美國BD公司，批號：5232454)。

1.3 實驗動物雄性C57野生小鼠10只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006。雄性hFcRn小鼠(只表達人FcRn不表達小鼠FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠)20只，購自上海南方模式生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2019-0002。雄性FcRn基因敲除小鼠(不表達FcRn基因的小鼠)5只，購自北京澄天生物科技有限公司，使用許可證號：SYXK(京)2018-0016。所有小鼠體質(zhì)量均為(20-25)g。小鼠購入后飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學研究院動物房，室溫維持在(26 ± 2)℃，相對濕度(55 ± 5)%，12 h/12 h 光照/避光循環(huán)，實驗期間動物自由取食、飲水，小鼠接受的所有操作均符合本單位實驗動物倫理委員會規(guī)定(倫理號：IACUC-DWZX-2020-627)。

1.4 間接ELISA法測定小鼠血清MIL94濃度用包被緩沖液將抗原稀釋到1 mg·L-1，96孔酶聯(lián)板中每孔加入100 μL，4℃包被過夜。每孔加入200 μL封閉液，37 ℃孵育1 h。用空白混合小鼠血清稀釋系列濃度(0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg·L-1)的MIL94制備成標準曲線樣品，0.031 25、16 mg·L-1作為錨定點不參與定量，同法配制0.125、0.8、6.4 mg·L-1的MIL94質(zhì)控樣品，每孔加入100 μL，設置復孔，37 ℃孵育2 h。用二抗稀釋液按1 ∶50 000稀釋HRP標記的羊抗人IgG，每孔加入100 μL，37 ℃避光孵育1 h。加入TMB顯色液，室溫避光放置10 min。最后加入1 mol·L-1的 H2SO4終止液終止反應，用酶標儀于450 nm波長處測定OD值。將標準曲線樣品濃度值(X)與所測定的吸光值(Y)利用 SPECTRO starNano軟件的四參數(shù)法進行擬合。擬合方程為：Y = Bottom +(Top-Bottom)/(1+(EC50/X)^Slope)。其中Top為擬合曲線的上端漸進線的估計值(OD值)，Bottom為擬合曲線的下端漸進線的估計值(OD 值)，Slope為校正曲線的斜率，X為實測濃度，EC50為50%光吸收值所對應的樣品濃度值，通過擬合最優(yōu)的曲線作為校正曲線。

按照生物樣品指導原則的要求，用該ELISA法對特異性、精密度、準確度、選擇性、稀釋線性、鉤狀效應、平行性和穩(wěn)定性等進行全面驗證。

1.5 實驗設計

1.5.1給藥方案 野生型小鼠(WT-C57)隨機分成2組，每組5只，分別為靜脈注射5 mg·kg-1和50 mg·kg-1的MIL94。于給藥前及開始后10 min、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、72 h、120 h、144 h靜脈采血。hFcRn小鼠隨機分成4組，每組5只，分別為靜脈注射5 mg·kg-1的MIL94、靜脈注射50 mg·kg-1的MIL94、腹腔注射IVIG(1 g·kg-1)2 h后+靜脈注射MIL94(5 mg·kg-1)、腹腔注射IVIG(1 g·kg-1)2 h后+靜脈注射MIL94(50 mg·kg-1)。FcRn基因敲除小鼠5只，靜脈注射MIL94(50 mg·kg-1)。hFcRn小鼠(無IVIG組)、FcRn基因敲除小鼠(FcRn-/-)采血點均為給藥前及開始后10 min、1、2、4、8、12、24、48、72 h靜脈采血。hFcRn小鼠(含IVIG組)采血點為給藥開始后10 min、1、2、4、8、12、24、48、72、120、144 h。采血量約30 μL，置于促凝離心管中。

1.5.2血清樣品的制備 全部血樣均于室溫凝固30 min后，4℃，2 500×g轉(zhuǎn)速離心10 min獲得血清，分裝后于-40 ℃凍存，待測。

1.6 數(shù)據(jù)處理

1.6.1藥代動力學參數(shù)計算 應用WinNonlin軟件，按非房室統(tǒng)計矩模型計算靜脈注射給藥后小鼠的主要藥代動力學參數(shù)：曲線下面積(AUC)，清除率(CL)，穩(wěn)態(tài)表觀分布容積(Vss)，消除半衰期(T1/2)和平均駐留時間(MRT)，采用 Microsoft EXCEL(2010)計算均值、標準差(s)，使用 GraphPad Prism 6 作圖。

2 結(jié)果

2.1 MIL94在小鼠血清中ELISA定量方法的建立與驗證MIL94在0.0625-8 mg·L-1范圍內(nèi)，濃度的對數(shù)值與吸光值(OD 值)呈S形曲線，定量下限為0.062 5 mg·L-1。加入Human IgG對MIL94濃度測定無干擾(特異性滿足要求)。批內(nèi)精密度波動在2.53%-7.69%。批間精密度波動在0.01%-8.33%之間。稀釋線性的準確度90.42%-100.32%之間，無明顯的鉤狀效應。選擇性、平行性滿足要求。樣品凍存至14 d穩(wěn)定。該方法靈敏度好，1 μL樣品即可測定樣品濃度，提示該方法可用于小鼠血清中MIL94濃度的定量檢測。

2.2 靜注MIL94(5 mg·kg-1)后不同組小鼠間藥-時曲線及藥代動力學參數(shù)靜注MIL94(5 mg·kg-1)后不同組小鼠間藥-時曲線及藥代動力學參數(shù)見Fig 1及Tab 1。結(jié)果顯示，靜注MIL94(5 mg·kg-1)后野生型小鼠與人源化FcRn小鼠藥-時曲線很相似，但hFcRn小鼠合用IVIG后血藥濃度降低明顯加快(Fig 1)。人源化FcRn小鼠與野生型小鼠相比，平均半衰期增加到2.1倍[(5.19±3.63)d與(2.43±0.25)d]，T1/2、AUC、Vss、CL、MRT差異均有統(tǒng)計學意義，提示在低濃度下，不同種屬的FcRn對MIL94的半衰期有明顯影響。hFcRn小鼠合用IVIG后與hFcRn小鼠未合用IVIG組相比，體內(nèi)暴露量AUC明顯減小，半衰期從5.19 d縮短至0.64 d，清除率從19.26提高至76.28 mL·d-1·kg-1，T1/2、AUC、Vss、CL、MRT差異均有統(tǒng)計學意義，提示hFcRn小鼠注射IVIG后，IVIG與體內(nèi)的hFcRn發(fā)生結(jié)合，導致與MIL94結(jié)合的hFcRn減少，半衰期明顯縮短。

Fig 1 Serum concentration-time curves of MIL94(5 mg·kg-1)injected intravenously in different groups of mice n=5)

2.3 靜注MIL94(50 mg·kg-1)后不同組小鼠間藥-時曲線及藥代動力學參數(shù)靜注MIL94(50 mg·kg-1)后不同組小鼠間藥-時曲線及藥代動力學參數(shù)見Fig 2及Tab 2。結(jié)果顯示，靜注MIL94(50 mg·kg-1)后，hFcRn小鼠與野生型小鼠相比血藥濃度降低略慢，而FcRn-/-小鼠和hFcRn小鼠合用IVIG后的藥-時曲線幾乎重合，藥物體內(nèi)血藥濃度降低速度明顯加快(Fig 2)。與野生型小鼠相比，MIL94在hFcRn小鼠體內(nèi)的清除率降低，暴露量增多，提示hFcRn可能影響MIL94清除進而影響暴露。hFcRn小鼠合用IVIG組與hFcRn小鼠未合用IVIG組相比血藥濃度降低，T1/2、Vss、CL差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示IVIG通過影響FcRn與MIL94結(jié)合進而影響MIL94的分布和清除(Tab 2)。

Tab 1 Pharmacokinetic parameters of MIL94(5 mg·kg-1)injected intravenously in different groups of mice

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of MIL94(50 mg·kg-1)injected intravenously in different groups of mice

Fig 2 Serum concentration-time curves of MIL94(50 mg·kg-1)injected intravenously in different groups of mice n=5)

2.4 FcRn對MIL94體內(nèi)消除和分布的影響將MIL94在不同組別小鼠體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)進行橫向比較，結(jié)果見Fig 3-5。結(jié)果顯示MIL94的消除半衰期與FcRn的種屬和功能密切相關(guān)。在不同品系小鼠相同劑量給藥后半衰期有統(tǒng)計學差異，表達hFcRn的小鼠體內(nèi)半衰期約為野生型小鼠的2倍，而在敲除FcRn基因小鼠體內(nèi)半衰期明顯縮短，與在hFcRn小鼠合用IVIG后的半衰期相當(0.5-0.6 d)。進一步將各組清除率數(shù)據(jù)進行橫向比較發(fā)現(xiàn)，其組間差異的趨勢與消除半衰期的關(guān)系相似。清除率在同種品系小鼠低劑量給藥后無明顯差別，高劑量給藥后明顯降低，總體趨勢為在hFcRn小鼠體內(nèi)清除率略低于野生型小鼠，而在敲除FcRn基因小鼠體內(nèi)的清除率明顯增加，并與在hFcRn的小鼠合用IVIG后的清除率相當(70 ～ 90 mL·d-1·kg-1)，是野生和hFcRn小鼠清除率的3 ～ 9倍。將各組穩(wěn)態(tài)表觀分布容積(Vss)數(shù)據(jù)進行橫向比較發(fā)現(xiàn)，MIL94在各組小鼠的Vss都比較低，說明其組織分布較少。另外，在敲除FcRn基因小鼠體內(nèi)其Vss與野生型小鼠相比降低2倍，在hFcRn的小鼠合用IVIG后Vss比合用前降低不到2倍，提示FcRn也在一定程度上影響MIL94的體內(nèi)分布，進而影響暴露。通過上述比較研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cRn通過影響MIL94的體內(nèi)消除和分布，改變其在不同種屬中的半衰期。

Fig 3 The T1/2 of MIL94 compared in different groups of mice n=5)

Fig 4 CL of MIL94 compared in different groups of mice n=5)

Fig 5 Vss of MIL94 compared in different groups of mice n=5)

3 討論

隨著生物醫(yī)藥在全球范圍蓬勃發(fā)展，單抗藥物已逐漸成為新藥領(lǐng)域的重要組成。截止2020年4月底全球獲批上市的單抗藥品共計91個，并且近幾年單抗藥物上市明顯加速。隨著單抗藥物在臨床研究和應用的日益廣泛，針對這類藥物藥代動力學機制和特征的研究更凸顯其重要性。與小分子藥物相比，單抗藥物作用機制更加明確，其體內(nèi)藥效與藥物暴露關(guān)系更加直接[9]，體內(nèi)藥代動力學特征很大程度上決定其藥效發(fā)揮，因此評價和預測單抗藥物的藥代動力學特征至關(guān)重要。如果單抗藥物在體內(nèi)有效暴露量能夠維持更長時間，可大大提高病人的順應性并降低給藥劑量，因此其體內(nèi)半衰期是決定單抗藥物藥效的重要指標之一。大分子藥物體內(nèi)半衰期受到給藥途徑、藥物體內(nèi)分布及代謝清除等主要因素影響。MIL94是針對西尼羅河病毒設計的全新的人源化單抗藥物，通過靜脈注射入血中和病毒達到防治作用，目前在臨床前研究階段。MIL94體內(nèi)半衰期的特征和機制研究將為其臨床開發(fā)提供重要依據(jù)。

MIL94的分子量72 ku，大于腎臟濾過的低限分子量(50-60 ku)，且難以透過生物膜，其表觀分布容積被細胞外的容積空間所限制[10]。由于其具有IgG結(jié)構(gòu)特征，pH依賴的FcRn循環(huán)機制可能對其體內(nèi)半衰期發(fā)揮重要作用。FcRn基因首次從大鼠細胞中分離出來，隨后，小鼠、人、牛、豬等的同源基因陸續(xù)被分離鑒定，通過基因序列比對發(fā)現(xiàn)具有高度同源性。FcRn在多種組織器官中均有表達，但是其表達模式有一定的種屬差異。鑒于FcRn對單抗藥物半衰期的影響，已建立了體內(nèi)外模型評價FcRn與mAB的親和力，用于篩選和評價單抗藥物。其中表面等離子共振技術(shù)(SPR)作為成熟的評估生物分子間相互作用的工具，是最常用的體外模型[11]。大部分研究結(jié)果表明，單抗藥物與酸性條件下FcRn的結(jié)合作用與體內(nèi)半衰期相關(guān)；但也有結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與中性條件下與FcRn的解離作用更相關(guān)[12]；還有結(jié)果表明，一些單抗藥物的半衰期與體外獲得的FcRn親和力并不相關(guān)[13]。體內(nèi)模型包括應用與人同源性最高的非人靈長類動物以及轉(zhuǎn)基因動物進行藥代動力學研究。由于猴的來源比較有限，基因工程小鼠模型是重要的研究工具，常用的包括表達hFcRn的小鼠和FcRn敲除小鼠。IVIG是注射用免疫球蛋白，可以與hFcRn結(jié)合。研究表明，小鼠注射大劑量的IVIG后由于飽和了體內(nèi)FcRn，也可以間接敲除FcRn功能[14]，并且表達hFcRn的小鼠注射1 g·kg-1的IVIG后，無不良反應，并且可以明顯縮短單抗藥物半衰期[15]。大量研究證明，hFcRn轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)的結(jié)果與猴及人體內(nèi)的結(jié)果更加接近。因此在本研究中，首次同時應用野生型小鼠、FcRn敲除小鼠、表達hFcRn的小鼠以及表達hFcRn的小鼠合用IVIG后比較研究不同劑量MIL94的體內(nèi)藥代動力學特征，證明FcRn的作用及種屬差異。MIL94作為一類新藥，本課題組前期已經(jīng)開展了MIL94在大鼠、食蟹猴體內(nèi)低、中、高3個劑量(0.5-50mg·kg-1)的藥代動力學實驗，結(jié)果均顯示線性清除(數(shù)據(jù)未公布)，推測MIL94在正常小鼠體內(nèi)是線性清除。因此本研究中每組只設計了5-50 mg·kg-1兩個劑量研究FcRn介導的種屬差異。

結(jié)果表明，5-50 mg·kg-1劑量范圍的MIL94在野生型小鼠和hFcRn的小鼠體內(nèi)的藥代動力學基本成線性過程。同時，各組動物體內(nèi)的分布容積均略高于小鼠血漿容積(50 mL·kg-1)，說明其組織分布受限，但FcRn敲除小鼠的分布容積最小，提示FcRn也在一定程度上影響MIL94的分布。體內(nèi)半衰期在不同組別之間有較大差異，提示FcRn參與MIL94的消除，并且有一定種屬差異。在表達hFcRn的小鼠體內(nèi)的半衰期比野生型小鼠更長，可能由于MIL94是全人源化的單抗，與hFcRn的親和力比mFcRn的要強，但是由于FcRn與單抗的結(jié)合過程還受到很多因素的影響，具體機制尚需深入研究。

綜上，本研究在表達不同種屬FcRn的動物模型中研究了MIL94的藥代動力學特征，獲得了FcRn對MIL94體內(nèi)分布和消除的影響，預測MIL94在人體內(nèi)半衰期比動物長。靶點介導的消除(TMDD)是單抗藥物體內(nèi)的特異清除途徑[16]，下一步將在病毒感染動物模型中開展MIL94的藥代動學研究，進一步預測MIL94在臨床患者體內(nèi)的暴露特征。

(致謝：感謝佛羅里達大學生物統(tǒng)計博士Jack Yan在數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理中給予的幫助。)