麩炒枳實(shí)炮制工藝研究及質(zhì)量分析

彭致鋮，蔡盛康，羅思妮，魏梅，孫冬梅，朱德全

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

枳實(shí)為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensisOsbeck的干燥幼果，具有破氣消積、化痰散痞的功效。枳實(shí)歷代有清炒、炒黃、炒黑、麩炒、面炒、醋炒、酒炒、土炒、蜜炙等多種炮制方法。歷代醫(yī)藥典籍中枳實(shí)使用主要以炒（炙）或麩炒為主，臨床上多以麩炒枳實(shí)入藥。枳實(shí)主要含揮發(fā)油、黃酮類化合物和辛弗林等化學(xué)成分，其中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等黃酮類化合物屬于枳實(shí)的有效成分，辛弗林屬于枳實(shí)的活性成分[1-3]。辛弗林對(duì)于胃、腸運(yùn)動(dòng)具有調(diào)節(jié)作用，有較強(qiáng)的擴(kuò)張氣管和支氣管的作用[4]。謝杞等[5]研究發(fā)現(xiàn)，辛弗林對(duì)CUMS大鼠具有抗抑郁的作用。2020版《中國藥典》中僅收載了麩炒枳實(shí)，且只規(guī)定了輔料用量范圍，無具體炮制工藝參數(shù)[6]，故有必要對(duì)麩炒枳實(shí)炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化。本研究以特征圖譜作為定性指標(biāo)，飲片性狀為炮制程度判斷指標(biāo)，柚皮苷、新橙皮苷、辛弗林質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為定量指標(biāo)，采用L9（34）因素水平表與主成分分析法，優(yōu)選麩炒枳實(shí)最佳炮制工藝，以期為其大生產(chǎn)的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Arc高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；XP26百萬分之一天平、ME204E萬分之一天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；HF-25型多功能炒果子機(jī)（萬江富順機(jī)械廠）。

1.2 試藥

辛弗林（批號(hào)：1107023-201608）、柚皮苷（批號(hào)：110722-201714）、橙皮苷（批號(hào)：110721-201617）、新橙皮苷（批號(hào)：111857-201703）對(duì)照品均購于中國食品藥品檢定研究院；液相色譜用甲醇、乙腈、磷酸為色譜純；其余試劑為分析純；水為超純水。

1.3 樣品

15批枳實(shí)藥材采自江西吉安市、九江市、宜春市與湖南益陽市，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥幼果。15批藥材與輔料經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心檢測(cè)，均符合2020版《中國藥典》規(guī)定，詳見表1。

表1 15批枳實(shí)生品、炮制品樣品信息Table 1 The Information of 15 batches of raw Fructus Aurantii immaturus and processed products

2 方法與結(jié)果

2.1 麩炒枳實(shí)特征圖譜與黃酮類質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：224 nm；進(jìn)樣量：對(duì)照品溶液10μL，供試品溶液5μL；乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸和0.05%十二烷基硫酸鈉溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫程序詳見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林對(duì)照品適量，置50 mL量瓶中，加50%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇溶解并稀釋至刻度，即得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林質(zhì)量濃度分別為0.038、0.051、0.054、0.042 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

另精密稱取柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品適量，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得柚皮苷、新橙皮苷質(zhì)量濃度分別為0.113、0.110 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過65目篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4 .1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取質(zhì)量濃度為18.08、72.33、144.65、289.31、578.63、1 157.25μg/mL的柚皮苷對(duì)照品溶液10μL與質(zhì)量濃度為19.06、76.23、152.45、304.91、609.82、1 219.64μg/mL的新橙皮苷對(duì)照品溶液10μL，按“2.1.1 ”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品的量對(duì)峰面積進(jìn)行回歸分析，得柚皮苷回歸方程y=15 040x+56 907（r2=0.999 3），新橙皮苷回歸方程y=12 065x+167 573（r2=0.999 6），柚皮苷在18.08～1 157.25μg/mL范圍內(nèi)具有良好相關(guān)性，新橙皮苷在19.06～1 219.64μg/mL范圍內(nèi)具有良好相關(guān)性。2.1.4 .2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，按“2.1.1 ”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，以新橙皮苷峰為參照峰，計(jì)算其余各特征峰相對(duì)峰面積RSD值為0.29%，柚皮苷RSD為1.03%，新橙皮苷RSD為0.89%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 .3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，按“2.1.1 ”項(xiàng)色譜條件，分別于0、3、6、9、12、18、24 h測(cè)定。以新橙皮苷峰為參照峰，計(jì)算其余各特征峰相對(duì)峰面積RSD值為1.48%，柚皮苷RSD為1.22%，新橙皮苷RSD為1.22%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.1.4 .4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取麩炒枳實(shí)樣品6份，分別按“2.1.3 ”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1.1 ”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以新橙皮苷峰為參照峰，計(jì)算其余各特征峰相對(duì)峰面積RSD值為1.00%，柚皮苷RSD為0.52%，新橙皮苷RSD為0.48%，表明樣品具有良好的重復(fù)性。

2.1.4 .5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量麩炒枳實(shí)樣品9份，每份0.2 g，分別加入柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品適量，分別按“2.1.3 ”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1.1 ”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果測(cè)得柚皮苷平均加樣回收率為100.84%，RSD為0.94%，新橙皮苷平均加樣回收率為98.54%，RSD為0.76%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.1.5 特征圖譜的建立 吸取“2.1.2 ”項(xiàng)下柚皮苷、橙皮苷、新橙皮與辛弗林混合對(duì)照品溶液和“2.1.3 ”項(xiàng)下供試品溶液和空白溶劑各5μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。經(jīng)與對(duì)照品進(jìn)行比較，確認(rèn)峰3為柚皮苷、峰4為橙皮苷、峰5為新橙皮苷、峰7為辛弗林。

圖1 麩炒枳實(shí)特征圖譜Figure 1 The characteristic chromatograms of stir-fried Fruc‐tus Aurantiiimmaturus with bran

2.1.6 枳實(shí)特征圖譜共有模式的建立 取“1.3”項(xiàng)15批不同來源的枳實(shí)與麩炒枳實(shí)，按“2.1.3 ”項(xiàng)方法制備供試品溶液，再按“2.1.1 ”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，選擇7個(gè)峰面積穩(wěn)定且分離度較好的色譜峰，確定其為共有峰。15批枳實(shí)與麩炒枳實(shí)HPLC特征圖譜疊加圖見圖2和圖3。

圖2 15批枳實(shí)特征圖譜共有模式Figure 2 The common pattern of 15 batches of Fructus Aurantiiimmaturus

圖3 15批麩炒枳實(shí)特征圖譜共有模式Figure 3 The common pattern of characteristic chromato‐grams of 15 batches of stir-fried Fructus Aurantiiimma‐turus with bran

2.2 麩炒枳實(shí)中辛弗林質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

精密稱取麩炒枳實(shí)粉末，參照2020年版《中國藥典》一部枳實(shí)項(xiàng)下辛弗林質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定[6]，色譜圖見圖4。

圖4 辛弗林質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定色譜圖Figure 4 The chromatograms of synephrine

2.3 麩炒枳實(shí)炮制工藝研究

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 取其中一批大小均勻的枳實(shí)飲片，均分成9份，每份取150 g，準(zhǔn)確稱定，分別加入適量麥麩，炒至色變深，即得。以炒制溫度、炒制時(shí)間與加麩量為考察因素，按L9（34）因素水平表設(shè)計(jì)，各因素與水平見表3。

表3 正交設(shè)計(jì)表因素與水平Table 3 The factors and levels of Orthogonal design

2.3.2 正交試驗(yàn)方法與結(jié)果 將炒藥機(jī)加熱至設(shè)定溫度，均勻撒入定量麥麩，即刻煙起，投入凈枳實(shí)片，快速翻動(dòng)，炒至色變深，取出，篩去麥麩，即得[6]。

采用綜合評(píng)分法，將9次試驗(yàn)中柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的試驗(yàn)數(shù)據(jù)定為100，其他各次試驗(yàn)數(shù)據(jù)與其相比即為得分，同法進(jìn)行新橙皮苷與辛弗林的評(píng)分。將9次試驗(yàn)中所得飲片性狀與2020年版《中國藥典》麩炒枳實(shí)項(xiàng)下所描述性狀對(duì)比，選擇3～5人作出評(píng)分，取平均值。2020年版《中國藥典》對(duì)麩炒枳實(shí)的性狀與辛弗林質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有規(guī)定且辛弗林為枳實(shí)主要活性成分，對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)具有調(diào)節(jié)作用，故加權(quán)系數(shù)均為0.3，柚皮苷與新橙皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)加權(quán)系數(shù)均為0.2。將4個(gè)指標(biāo)通過加權(quán)系數(shù)計(jì)入綜合評(píng)分，由綜合評(píng)分確定所選指標(biāo)的優(yōu)劣，結(jié)果見表4。直觀分析見表5，方差分析見表6。

從表4的直觀分析數(shù)據(jù)可以看出，影響因素對(duì)極差R的影響順序從大到小為因素A>因素B>因素C>空白，即炒制溫度>炒制時(shí)間>加麩量>空白；結(jié)合各因素水平，最佳工藝參數(shù)為A1B1C3。

表4 麩炒枳實(shí)炮制正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 4 he results of orthogonal design for processing of stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

從表5方差分析數(shù)據(jù)可以看出，炒制溫度對(duì)麩炒枳實(shí)炮制質(zhì)量的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而炒制時(shí)間與加麩量則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 方差分析表Table 5 Analysis of Variance Table

綜上所述，由于加麩量對(duì)麩炒枳實(shí)炮制無明顯影響，再結(jié)合傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)及大生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性考慮，確定最佳工藝參數(shù)為A1B1C1，即每100 kg麩炒枳實(shí)用麥麩量為10 kg，炒制溫度為220℃，炒制5 min。

2.3.3 主成分分析 以新橙皮苷為參照峰，其余6個(gè)特征峰的相對(duì)峰面積為變量，采用SPSS21.0軟件進(jìn)行主成分分析，得特征值和方差貢獻(xiàn)率見表6，碎石圖見圖5?？梢姡蕴卣髦担?并考慮碎石圖連續(xù)陡峭部分，可以提取得到2個(gè)主成分，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為83.114%，說明這2個(gè)成分可以代表83.114%的信息，具有良好的代表性。因子載荷矩陣見表7，從中可見，峰1、柚皮苷、辛弗林對(duì)主成分1貢獻(xiàn)較大，峰2對(duì)主成分2貢獻(xiàn)較大。

圖5 麩炒枳實(shí)主成分分析碎石圖Figure 5 The Gravel map of principal component analysis of stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

根據(jù)表6和表7的數(shù)據(jù)，將原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)一步計(jì)算得到2個(gè)主成分得分的特征向量，將其與標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)相乘后得到2個(gè)主成分得分F1、F2：

表6 麩炒枳實(shí)主成分分析特征值與方差貢獻(xiàn)率Table 6 Principal component analysis eigenvalue and variance contribution rate of stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

表7 因子載荷矩陣Table 7 Factor load matrix

F1=0.518ZX1+0.174ZX2+0.530ZX3+0.188ZX4+0.329ZX5+0.525ZX6，

F2=0.077ZX1+0.659ZX2+0.010ZX3+0.408ZX4?0.623ZX5?0.060ZX6，

式中：ZX1～ZX6分別為峰1（X1）、峰2（X2）、柚皮苷（X3）、橙皮苷（X4）、峰6（X5）、辛弗林（X6）的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。

以各主成分得分所對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率為系數(shù)，從而得到綜合評(píng)分模型F，F(xiàn)表達(dá)式為：F=0.583 34F1+0.247 80F2。9次實(shí)驗(yàn)綜合得分見表8。綜合得分排名最高的為1號(hào)實(shí)驗(yàn)，與正交實(shí)驗(yàn)方差分析得出結(jié)果一致。最終確定最優(yōu)炮制工藝參數(shù)為每100 kg麩炒枳實(shí)用麥麩量為10 kg，炒制溫度為220℃，炒制5 min。

表8 主成分綜合得分排名Table 8 Comprehensive score ranking of main componen

2.3.4 工藝驗(yàn)證

取枳實(shí)飲片，按上述最佳工藝參數(shù)，重復(fù)制備麩炒枳實(shí)飲片3份，按上述方法測(cè)定，測(cè)定其特征圖譜和柚皮苷、新橙皮苷、辛弗林的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，見表9。結(jié)果表明，麩炒枳實(shí)炮制工藝參數(shù)重復(fù)性良好。

表9 麩炒枳實(shí)中3種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果Table 9 Determination of the mass fraction of three compo‐nents in stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

2.3.5 生品與炮制品的差異分析

取15批不同產(chǎn)地枳實(shí)藥材，按上述最佳工藝參數(shù)，制備15批麩炒枳實(shí)飲片，按“2.1.3 ”項(xiàng)方法制備供試品溶液，再按“2.1.1 ”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以新橙皮苷為參照峰，計(jì)算其余各峰的相對(duì)峰面積，結(jié)果見表10～表11。

表10 枳實(shí)藥材特征圖譜相對(duì)峰面積Table 10 Relative peak area of the characteristic chromatogramsof Fructus Aurantiiimmaturus

表11 麩炒枳實(shí)飲片特征圖譜相對(duì)峰面積Table 11 Relative peak area of characteristic chromatograms of stir-fried Fructus Aurantiiimmaturus with bran

對(duì)比15批不同產(chǎn)地枳實(shí)與麩炒枳實(shí)的特征圖譜的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過麩炒后，未知成分峰1除個(gè)別批次外，相對(duì)峰面積均有不同程度的降低；未知成分峰6除個(gè)別批次外，相對(duì)峰面積均有不同程度的增加，說明枳實(shí)與麩炒枳實(shí)化學(xué)成分比例存在一定的差異。有研究表明枳實(shí)麩炒后揮發(fā)油的含量有所減少，而揮發(fā)油組分與其他主要化學(xué)成分變化不大[7-8]。

3 討論

本研究比較了不同的流動(dòng)相體系（乙腈-0.1%甲酸和0.1%十二烷基硫酸鈉、乙腈-0.1%磷酸和0.1%十二烷基硫酸鈉、乙腈-0.1%磷酸和0.05%十二烷基硫酸鈉）、不同提取方式（超聲、回流）、不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇）、不同提取時(shí)間（15 min、30 min、60 min）、不同提取溶劑用量（50 mL、100 mL），結(jié)合柚皮苷、新橙皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)與各色譜峰數(shù)量和分離效果考慮，最終確定用甲醇超聲提取供試品溶液，以乙腈-0.1%磷酸和0.05%十二烷基硫酸鈉為流動(dòng)相的色譜條件。色譜柱選擇能較好分離堿性化合物與耐高水相的Waters Sym‐metry色譜柱，能實(shí)現(xiàn)對(duì)麩炒枳實(shí)中的黃酮和生物堿（辛弗林）的同時(shí)分離。

本研究從枳實(shí)及麩炒枳實(shí)的HPLC特種圖譜中標(biāo)識(shí)出7個(gè)共有峰，通過對(duì)照品指認(rèn)了其中4個(gè)成分，分別為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、辛弗林。通過15批不同產(chǎn)地的枳實(shí)與麩炒枳實(shí)的特征圖譜可知，枳實(shí)經(jīng)過炮制后并無化學(xué)成分消失或產(chǎn)生新的物質(zhì)，但未知成分峰1除個(gè)別批次外，相對(duì)峰面積均有不同程度的降低，推測(cè)峰1為揮發(fā)油成分，經(jīng)麩炒后達(dá)到“緩和其峻烈之性[9]”的效果；未知成分峰6除個(gè)別批次外，相對(duì)峰面積均有不同程度的增加，推測(cè)未知成分峰6與麩炒枳實(shí)的藥效“以散積消痞力勝[9]”有關(guān)。但對(duì)于具體的化學(xué)成分的變化與緩和枳實(shí)的破氣之功的關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。

目前，對(duì)麩炒枳實(shí)炮制工藝研究已有文獻(xiàn)報(bào)道[1,10-11]，但因年代較久，參考《中國藥典》的版本不一，導(dǎo)致得出的結(jié)論已不符合2020年版《中國藥典》炮制通則項(xiàng)下的規(guī)定。本研究參考2020年版《中國藥典》，通過正交實(shí)驗(yàn)方差分析與主成分分析，優(yōu)選出麩炒枳實(shí)炮制工藝，且炮制考察所用的炒藥機(jī)是模擬的大生產(chǎn)炮制設(shè)備，對(duì)麩炒枳實(shí)大生產(chǎn)的質(zhì)量控制具有一定的指導(dǎo)性。