基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討四逆散治療腸易激綜合征的潛在作用機制

嚴海冬 1，繆文清 1，張志鵬 2*，蔡延渠

[1.咸寧市中心醫(yī)院，湖北咸寧 437000；2.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北咸寧 437100；3.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東廣州 510006；4.廣東省教育廳現(xiàn)代中藥重點實驗室，廣東廣州 510006；5.國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑實驗室（三級），廣東廣州 510006]

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是臨床常見的功能性腸胃病，其發(fā)病機制不明確，可能與精神心理因素、腸道感染、內(nèi)臟高敏性等相關(guān)[1]，目前臨床尚無特效治療藥物。依據(jù)其臨床特征，IBS屬于中醫(yī)“泄瀉”“饗泄”“郁癥”范疇，病因主要為外感六淫、七情內(nèi)傷、勞倦過度等[2]。

四逆散出自張仲景的《傷寒論?辨少陰病脈證并治》，由柴胡、白芍、枳實和甘草組成[3]，臨床治療IBS取得良好的治療效果[4]。IBS病機在于肝氣郁結(jié)、脾胃不和、氣機郁滯、通降失常、傳導(dǎo)失職。四逆散中柴胡升發(fā)陽氣、疏肝解郁，苦平，為君藥；白芍斂陰養(yǎng)血，為臣藥；柴胡協(xié)同白芍斂陰和陰、條達肝氣，升散而無耗陽傷血；枳實辛苦酸，理氣解郁、泄熱破結(jié)，與柴胡相伍便于陽氣布散，與白芍相伍理氣和血；甘草調(diào)和諸藥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，四逆散具有促進胃腸活動、抑制胃酸分泌、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗病毒等藥理作用[5]，但缺乏治療IBS的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制方面研究。

2007年英國藥理學(xué)家提出“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”概念，“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”的整體觀念、系統(tǒng)觀念符合中藥的作用特點，因此在中藥的現(xiàn)代化研究中得到廣泛應(yīng)用。鄭洋等[6]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了莪術(shù)的物質(zhì)基礎(chǔ)和可能的作用機制，李筱楠等[7]分析了“梔子‐川芎”藥對的抗抑郁作用靶點，并通過動物實驗進行了驗證。李娜等[8]應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究優(yōu)化潰結(jié)方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用靶點、代謝物、KEGG信號通路等，揭示了優(yōu)化潰結(jié)方的分子通路機理和作用機制，有助于其臨床療效體系的評價。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選四逆散活性成分和潛在作用靶點，分析四逆散治療IBS的潛在作用機制和物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 四逆散活性成分的篩選和收集

在TCMSP平臺，分別以“柴胡”“白芍”“甘草”“枳實”進行檢索，收集上述中藥的物質(zhì)成分，以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為截斷值，篩選適合口服吸收的物質(zhì)成分。在此基礎(chǔ)上，在Drugbank數(shù)據(jù)庫逐一檢索上述成分，獲得活性物質(zhì)成分的作用靶點[9]。

1.2 IBS疾病靶點的收集

以“irritable bowel syndrome”為關(guān)鍵字，分別通過人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫Genecards、疾病相關(guān)的基因與突變位點數(shù)據(jù)庫DisGeNET、治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫TTD收集IBS相關(guān)的基因靶點，數(shù)據(jù)統(tǒng)一為gene symbol后，數(shù)據(jù)去重，建立IBS疾病靶點數(shù)據(jù)庫[10]。

1.3 四逆散治療IBS相關(guān)靶點的確定

將活性物質(zhì)成分的作用靶點和IBS疾病靶點數(shù)據(jù)輸入同一Excel表格后，采用IF[COUNTIF(B:B，A2)>0，A2，0]公式取交集獲得交集靶點，數(shù)據(jù)采用在線繪制韋恩圖平臺Venny 2.1進行可視化。

1.4 四逆散治療IBS蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

交集靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，進行在線蛋白質(zhì)‐蛋白質(zhì)的相互作用分析，導(dǎo)出數(shù)據(jù)資料，采用Cytoscape3.7.2 進行數(shù)據(jù)的可視化分析。以中位degree值為截斷值，篩選核心靶點，構(gòu)建四逆散治療IBS的核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)[11]。

1.5 GO富集分析和KEGG富集分析

將四逆散治療IBS的核心靶點導(dǎo)入至Metascape數(shù)據(jù)庫平臺GO富集分析和KEGG通路分析。以P＜0.01為條件篩選，得到四逆散治療IBS的核心靶點的GO富集分析和KEGG通路分析，獲得的KEGG通路采用KEGGmapper進行可視化[12]。

1.6 活性成分和核心靶點的分子對接驗證

隨機抽取4對活性成分和核心靶點進行Swiss DOCK分子對接，驗證藥物與靶點之間的連接性能。

2 結(jié)果

2.1 四逆散的主要活性成分

經(jīng)過篩選，從“柴胡”“白芍”“甘草”和“枳實”中總計篩選獲得140種活性化合物，其中柴胡活性成分17種，白芍活性成分13種，甘草活性成分92種，枳實活性成分20種。部分重要活性成分見表1。

表1 四逆散的主要活性成分Table 1 The main active components of Sini Powder

2.2 IBS的疾病治療靶點和四逆散活性作用靶點交集

“柴胡”對應(yīng)疾病靶點342個，“白芍”對應(yīng)疾病靶點122個，“甘草”對應(yīng)疾病靶點1 704個，“枳實”對應(yīng)疾病靶點298個，去重后獲得269個疾病靶點。對疾病數(shù)據(jù)庫以“irritable bowel syndrome”為關(guān)鍵詞 進 行 檢 索，分 別 從“disgenet”“drugbank”“gene‐Cards”“OMIM”和“TTD”數(shù)據(jù)庫獲得429、139、1 000、485、27個IBS疾病治療靶點，去重后獲得1 774個靶點。以IBS疾病靶點和四逆散活性成分靶點取交集，獲得251個交集靶點。見圖1。

圖1 IBS疾病治療靶點和四逆散活性作用靶點交集Figure 1 The intersection of therapeutic targets of IBS and active targets of Sini Powder

將四逆散活性成分數(shù)據(jù)和相應(yīng)疾病靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建“藥物‐有效成分‐靶點”網(wǎng)絡(luò)。通過網(wǎng)絡(luò)degree分析發(fā)現(xiàn)，degree值排名前10的成分分別為白花前胡丁素、槲皮素、谷甾醇、山柰酚、木犀草素、7?甲氧基?2?甲基異黃酮、苯甲酰芍藥苷、芒柄花黃素、柚皮素、異鼠李素（degree分別為152、150、63、63、58、42、42、40、38、38），可能是其中發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)成分。見圖2。

圖2 四逆散的“藥物‐有效成分‐靶點”網(wǎng)絡(luò)Figure 2 The"drug?active component?target"network of Si‐ni Powder

2.3 四逆散治療IBS關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

將251個交集靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，得到四逆散治療IBS的交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，PPI網(wǎng)絡(luò)中顯示節(jié)點251個，邊8 946條，平均節(jié)點度值（degree）為36.51，見圖3。顏色越深，節(jié)點度值越大，發(fā)揮的生物學(xué)功能越明顯。以degree數(shù)值＞75為截點，選取核心疾病靶點構(gòu)建四逆散治療IBS的核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，AKT1、MAPK1、MMP2、EGF、TP53、CASP3、EGFR、MMP9、TNF、IL6具有最高的degree值，是四逆散治療IBS的關(guān)鍵潛在治療靶點。見圖4。

圖3 四逆散治療IBS的交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of intersection target of Sini Powder in the treatment of IBS

圖4 四逆散治療IBS的核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 4 PPI network of core target of Sini Powder in the treatment of IBS

2.4 四逆散治療IBS核心靶點的GO富集分析和KEGG富集分析

圖7 四逆散治療IBS的信號通路Figure 7 Signal pathway of Sini Powder in the treatment of IBS

以P<0.01為截斷值，對四逆散治療IBS的核心靶點進行GO富集分析（見圖5）和KEGG富集分析（見圖6～7）。結(jié)果顯示：GO biological processes主要涉及對刺激的反應(yīng)、細胞增殖、生殖過程、運動、免疫系統(tǒng)過程、生物黏附、多細胞過程、細胞過程、行為和解毒等。GO cellular components主要涉及ficolin?1顆粒腔、分泌顆粒腔、區(qū)域膜、髓鞘、細胞膜穴樣內(nèi)陷、溶酶體、樹突、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物和早期內(nèi)體等。GO molecular functions主要涉及一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性、細胞因子受體結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、生長因子受體結(jié)合、激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體配體活性、受體調(diào)節(jié)活性、組蛋白脫乙?；附Y(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和轉(zhuǎn)錄輔激活子結(jié)合。KEGG富集分析涉及到的信號通路包括癌癥信號通路、IL?17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、Toll樣受體信號通路、c型凝集素受體信號通路、NOD樣受體信號通路、細胞凋亡、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、cAMP信號通路、PI3K?Akt信號通路、MAPK信號通路、NF?κB信號通路、炎癥性腸病、催產(chǎn)素信號通路等。

圖5 四逆散治療IBS的核心靶點GO富集分析圖Figure 5 Go enrichment analysis of the core target of Sini Powder in the treatment of IBS

圖6 四逆散治療IBS的核心靶點KEGG富集分析圖Figure 6 KEGG enrichment analysis of core target of Sini Powder in treating of IBS

2.5 活性成分與核心靶點的分子對接驗證

隨機選取活性成分與核心靶點進行分子對接驗證，圖8結(jié)果顯示，山柰酚與AKT1、槲皮素與AKT1、槲皮素與MAPK1、谷甾醇與CASP3的Esti‐matedΔG均小于?5 kJ/mol，表明活性成分與核心靶點具有良好的結(jié)合性能。

圖8 四逆散活性成分與核心靶點的分子對接驗證結(jié)果Figure 8 Molecular docking verification of active compo‐nents and core targets of Sini Powder

3 討論

本研究利用TCMSP平臺，對四逆散的4味中藥進行了檢索，并以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為截斷值，篩選適合口服吸收的物質(zhì)成分。四逆散中含有活性成分140個，潛在作用靶點作用靶點269個，與IBS疾病靶點取交集，獲得251個交集靶點。在四逆散的“藥物‐有效成分‐靶點”網(wǎng)絡(luò)中，通過network分析，degree值排名前10的成分分別為白花前胡丁素、槲皮素、谷甾醇、山柰酚、木犀草素、7?甲氧基?2?甲基異黃酮、苯甲酰芍藥苷、芒柄花黃素、柚皮素、異鼠李素。degree值越大，越有可能是四逆散發(fā)揮藥效的有效成分。

槲皮素是自然界廣泛存在的一類黃酮醇類化合物，具有抗菌、抗感染、抗過敏、降血脂等作用。已有研究在動物模型上證實了槲皮素的抗IBS作用，如黃泓軻等[13]發(fā)現(xiàn)槲皮素與5?氨基水楊酸協(xié)同治療、改善感染后腸易激綜合征大鼠癥狀體征；而在體外實驗中，槲皮素可通過加強緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)和功能改善腸上皮屏障功能[14]。谷甾醇可通過抑制炎癥因子和相關(guān)酶的過表達來緩解急性結(jié)腸炎[15]；木犀草素可通過干預(yù)IRE1/XBP1通路調(diào)節(jié)炎癥性腸病小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激穩(wěn)態(tài)，對于腸道具有保護作用[16]。白花前胡丁素是一種香豆素類化合物，本研究中具有最高degree值，但目前尚未見白花前胡丁素在IBS應(yīng)用中的相關(guān)報道，推測它可能是一種潛在的IBS治療藥物，值得在下一步研究中加以驗證。

AKT1、MAPK1、MMP2、EGF、TP53、CASP3、EG‐FR、MMP9、TNF?α、IL6是四逆散治療IBS的關(guān)鍵潛在治療靶點。EGF、EGFR可以通過調(diào)控ZO?1和Occludin蛋白來調(diào)節(jié)屏障的通透性[17]，ERK/MAPK通路可以通過調(diào)控緊密連接蛋白水平來增強腸道的屏障功能[18]，四逆湯或可通過增強腸黏膜緊密連接蛋白的表達促進腸道組織的修復(fù)。TNF?α是一種廣譜的炎性細胞因子，也是腸道黏膜屏障損傷的重要啟動因子，一方面可改變腸道緊密連接蛋白的表達和分布，另一方面可通過誘導(dǎo)炎癥因子IL?6和IL?1β的產(chǎn)生，損傷黏膜組織[19]。

IBS在臨床上雖然不歸屬炎性疾病，但是90%IBS患者的腸壁炎性細胞增多，腸道炎癥可破壞腸道上皮的屏障功能，導(dǎo)致IBS的發(fā)生。本研究通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，四逆散作用通路中包含多個炎癥信號通路，如IL?17信號通路在炎癥反應(yīng)和炎癥維持過程中起著非常重要的作用，在IBS的發(fā)生發(fā)展過程中，IL?17出現(xiàn)先下降后升高的動態(tài)改變[20]；郭文濤等在研究中發(fā)現(xiàn)腹瀉型腸易激綜合征患者腸黏膜中的TLR?2和TLR?4的表達升高，TLR的表達水平與腸道擬桿菌門和梭菌屬存在一定的關(guān)聯(lián)[21]；同時，TLR4可以激活NF?κB信號通路介導(dǎo)內(nèi)臟超敏反應(yīng)的發(fā)生，TLR4/MyD88/NF?κB導(dǎo)致炎性因子的產(chǎn)生也是IBS產(chǎn)生的重要因素[22]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了四逆散治療腸易激綜合征的潛在物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，其活性成分主要通過調(diào)節(jié)炎癥信號通路和腸道運動發(fā)揮治療IBS作用，為下一步研究的開展提供了理論基礎(chǔ)。