馬排卵期性激素含量變化及相關(guān)性分析

董 紅，鄭新寶，羅永明，陳 童，徐文慧，奴爾蘭·阿克亞孜，范洪先

（1.新疆畜牧科學(xué)院 畜牧研究所，烏魯木齊 830011；2.新疆伊犁國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)管理委員會(huì)，新疆 昭蘇 835600；3.昭蘇縣畜牧獸醫(yī)發(fā)展中心，新疆 昭蘇 835600）

在繁殖季節(jié)，母馬在感受環(huán)境氣溫、光照變化的條件下，采食大量青草，膘情逐漸恢復(fù)，此時(shí)腦垂體釋放促卵泡素（FSH），在FSH的不斷作用下母馬子宮上卵巢多個(gè)卵泡逐漸發(fā)育；此外母馬卵巢還產(chǎn)生雌激素、促黃體生成素（LH）進(jìn)入血液［1］。當(dāng)血液中雌激素濃度不斷升高時(shí)，則抑制腦垂體FSH、LH的釋放。當(dāng)FSH濃度開(kāi)始不斷下降后，在競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)條件下只有一兩個(gè)卵泡發(fā)育成熟。LH的不斷釋放推動(dòng)卵泡破裂成熟，卵子排出，然后進(jìn)入發(fā)情交配、受精、妊娠階段，一般母馬懷孕產(chǎn)單胎，極個(gè)別為雙胎［2-3］。為了深入研究母馬發(fā)情季節(jié)生殖激素分泌變化規(guī)律，有必要進(jìn)行排卵監(jiān)測(cè)，這對(duì)誘導(dǎo)發(fā)情、實(shí)施同期發(fā)情有重要意義。

研究氣候、品種、年齡、營(yíng)養(yǎng)等因素對(duì)母馬卵泡發(fā)育和排卵的影響［4-6］可以預(yù)測(cè)母馬發(fā)情排卵時(shí)間，推測(cè)最佳配種時(shí)間。試驗(yàn)在卡拉蘇馬研究中心配種站選擇發(fā)情母馬122匹次，采集靜脈血測(cè)定FSH、LH、絨毛膜促性腺激素（hCG）、促性腺激素釋放激素（GnRH）、促甲狀腺激素釋放激素（TRH）含量變化，并輔助直腸檢查子宮卵巢、陰道狀態(tài)及母馬外觀行為表現(xiàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)于2016—2020年在昭蘇縣畜牧獸醫(yī)站卡拉蘇馬研究中心馬場(chǎng)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及血液樣品的采集

在配種季節(jié)，在卡拉蘇馬研究中心配種站選擇發(fā)情母馬122匹次，馬群采用放牧方式飼養(yǎng)，使用一次性普通真空采血管，分別采集母馬卵泡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期頸部靜脈血，然后1 500 r/min離心5 min，血清冷凍保存，使用干冰運(yùn)輸，送至北京金?？朴缟锟萍及l(fā)展有限公司，使用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中FSH、LH、hCG、GnRH、TRH含量［7］。

根據(jù)卵巢上卵泡的形狀、大小、質(zhì)地、波動(dòng)和位置可判斷卵泡發(fā)育情況，一般將馬的卵泡期分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期，劃分標(biāo)準(zhǔn)［8］如下：（1）卵泡Ⅰ期。一側(cè)卵巢上出現(xiàn)小卵泡，直腸檢查手接觸有硬球的感覺(jué)，微突于卵巢表面，彈性強(qiáng)，無(wú)波動(dòng)，排卵窩深。一般持續(xù)1～3 d。（2）卵泡Ⅱ期。小卵泡發(fā)育長(zhǎng)大，卵泡液增多，卵泡柔軟有彈性，直腸檢查時(shí)觸摸有微小波動(dòng)感。排卵窩由深變淺。此期持續(xù)1～3 d。（3）卵泡Ⅲ期。卵泡繼續(xù)長(zhǎng)大，卵泡液更多了，直腸檢查時(shí)觸摸卵泡柔軟，彈性好，波動(dòng)明顯，卵泡壁逐漸變薄，排卵窩較平。一般持續(xù)1～2 d。（4）卵泡Ⅳ期。卵泡長(zhǎng)至最大，已成熟，直腸檢查時(shí)手觸能感覺(jué)到卵泡壁薄而緊張，有明顯波動(dòng)感，排卵窩淺。一般持續(xù)1.0～1.5 d。（5）排卵Ⅴ期。卵泡壁很薄，緊張，彈性弱，有一觸即破感。此期一般持續(xù)2～8 h。有時(shí)直腸檢查，觸摸時(shí)卵泡突然破裂、排卵，可摸到排卵窩和卵泡膜。

1.3 激素的測(cè)定

酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)是一種應(yīng)用廣泛的檢測(cè)方法，具有快速、敏感、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，本試驗(yàn)采用ELISA測(cè)定血清激素含量。主要步驟：（1）取血清樣品10μL加入酶標(biāo)孔，加入樣品稀釋液40μL；（2）取標(biāo)準(zhǔn)品50μL加入酶標(biāo)孔；（3）每孔加入酶標(biāo)液100μL，蓋上貼紙，放入37℃溫箱反應(yīng)1 h；（4）取出酶標(biāo)板，用試劑盒自帶洗液（洗液1∶25倍稀釋?zhuān)┫?遍，每遍間隔30 s，最后一遍甩干，在吸水紙上拍干；（5）每孔加入A液50μL，B液50μL，蓋上貼紙放入溫箱反應(yīng)15 min；（6）取出酶標(biāo)板加入終止液50μL，放入酶標(biāo)儀檢測(cè)（酶標(biāo)儀檢測(cè)選擇450 nm波長(zhǎng)條件），讀取OD值［7-9］。

1.4 主要儀器和試劑

臺(tái)式離心機(jī)、便攜式B超儀、酶標(biāo)儀、采血管、ELISA試劑盒、干冰。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2013軟件整理數(shù)據(jù)并繪制不同采樣期各種激素變化折線圖；用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行不同采樣期的FSH含量、LH含量、hCG含量、GnRH含量、TRH含量 等指標(biāo)之間的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清激素指標(biāo)統(tǒng)計(jì)

各采樣時(shí)期母馬血清激素含量見(jiàn)表1。

表1 血清激素的描述性統(tǒng)計(jì)分析

由表1可以看出：FSH、LH、hCG含量在Ⅱ期至Ⅳ期持續(xù)上升，在Ⅳ期達(dá)到最高，之后下降；Gn-RH含量在Ⅱ期至Ⅲ期下降，Ⅲ期至Ⅳ期上升，Ⅳ期至Ⅴ期下降；TRH含量在Ⅱ期至Ⅲ期下降，之后上升，不同卵泡期差異顯著（P＜0.01）。

2.2 血清激素指標(biāo)相關(guān)性分析

對(duì)母馬血清中激素含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同采樣期血清激素間的相關(guān)性分析

由表2可以看出：在Ⅱ期，TRH含量與GnRH、LH、FSH、hCG含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），GnRH與FSH含量呈顯著相關(guān)（P＜0.05），hCG與LH、FSH含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），LH 和FSH含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）。

在Ⅲ期，TRH含量與GnRH、LH、FSH、hCG含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），GnRH與FSH、LH、hCG含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），hCG和LH、FSH含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），LH和FSH含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.05）。

在Ⅳ期，TRH含量與GnRH、LH、FSH、hCG含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），hCG和LH、FSH含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），LH和FSH含量極顯著相關(guān)（P＜0.01）。

在Ⅴ期（排卵后），TRH含量與GnRH、FSH、hCG含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），GnRH與FSH含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），hCG與LH、FSH含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）。

3 討論與結(jié)論

FSH和LH是一類(lèi)糖蛋白激素，由母畜腦垂體促性腺激素細(xì)胞分泌，受下丘腦GnRH、雌激素、抑制素調(diào)控，推動(dòng)著發(fā)情周期的周期性變化。FSH可以促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育成熟及影響雌激素分泌，LH可以促進(jìn)母馬成熟卵泡排卵和黃體生長(zhǎng)，促進(jìn)黃體分泌雌激素、孕激素［10］。目前，有關(guān)哺乳動(dòng)物的排卵詳細(xì)機(jī)制尚未完全明確，對(duì)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的研究表明：發(fā)情排卵前后時(shí)期動(dòng)物體內(nèi)FSH、LH、雌激素以及GnRH等激素變化明顯，激素之間相互影響形成反饋調(diào)節(jié)，推動(dòng)卵泡成熟、排卵，然后形成紅體、黃體、白體。雌激素峰值出現(xiàn)，誘導(dǎo)下丘腦GnRH釋放增加，推動(dòng)LH、FSH達(dá)到分泌峰值。FSH和LH協(xié)同作用，誘導(dǎo)排卵時(shí)FSH和LH互相協(xié)同，使成熟卵泡破裂排卵。但單獨(dú)使用LH會(huì)造成卵巢上成熟和不成熟的卵泡全部破裂，這種現(xiàn)象產(chǎn)生的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究［11］。

GnRH是一種神經(jīng)激素，由下丘腦分泌，促進(jìn)FSH、LH釋放，排卵前LH分泌升高，推動(dòng)雌激素分泌增多，雌激素刺激卵巢上受體合成多種酶，推動(dòng)成熟卵泡頂部組織膠原纖維蛋白多糖變性，卵泡膜的黏合作用被破壞，卵泡液內(nèi)蛋白水解酶、淀粉酶、膠原酶、透明質(zhì)酸酶分泌增多，聯(lián)合作用促使卵泡壁溶解破裂，成熟卵子排出［12］。

TRH是由下丘腦室旁核內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞合成分泌的一種肽類(lèi)激素，可以促使促甲狀腺激素（TSH）分泌增加，TSH的增多可以促進(jìn)甲狀腺的分泌，使動(dòng)物體對(duì)性激素敏感性增加，身體發(fā)熱，神經(jīng)系統(tǒng)興奮，表現(xiàn)發(fā)情癥狀［13］。

馬的發(fā)情排卵主要發(fā)生在Ⅲ期～Ⅳ期，在本試驗(yàn)中，馬群采用放牧方式飼養(yǎng)，比較難抓，采集同一匹放牧母馬血樣時(shí)，收集到的連續(xù)血樣以Ⅱ期～Ⅴ期的為主，很少采集到Ⅰ期～Ⅱ期連續(xù)樣本，血樣數(shù)量不夠，因此本試驗(yàn)重點(diǎn)對(duì)比分析馬匹Ⅱ期～Ⅴ期的血液激素變化。

本試驗(yàn)結(jié)果表明：（1）在母馬正常排卵期中卵泡Ⅱ期的FSH和LH、hCG是維持在低水平的，隨著卵泡逐漸生長(zhǎng)變大，F(xiàn)SH、LH、hCG激素含量在GnRH的誘導(dǎo)下持續(xù)上升，直至排卵前會(huì)迅速升高，LH、hCG在排卵期可升高2倍，而FSH則為2，3倍左右，在Ⅳ期達(dá)到最高，形成優(yōu)勢(shì)卵泡，然后卵泡破裂排卵，排卵之后進(jìn)入Ⅴ期時(shí)FSH、LH、hCG激素含量迅速下降。（2）GnRH含量在Ⅱ～Ⅲ期有所下降，但差異不顯著，在即將排卵時(shí)分泌量上升，促進(jìn)FSH、LH分泌，推動(dòng)優(yōu)勢(shì)卵泡排卵，排卵后含量又再次下降，F(xiàn)SH、LH含量也降低，卵巢恢復(fù)，開(kāi)始準(zhǔn)備下一個(gè)發(fā)情排卵周期。（3）TRH降低會(huì)引起母馬甲狀腺功能亢進(jìn)，發(fā)情表現(xiàn)明顯，并停止采食，頻頻靠近公馬，嘶鳴，排卵后TRH含量升高，甲狀腺功能減退，興奮性逐漸下降，表現(xiàn)為安靜排卵，接收公馬爬跨配種。（4）不同采樣期比較而言，在排卵前的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期時(shí)，F(xiàn)SH和LH含量呈極顯著相關(guān)，均為逐漸升高，排卵后迅速下降。在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期hCG含量均與FSH、LH含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），總體上呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。GnRH在Ⅱ期時(shí)與FSH含量呈顯著相關(guān)（P＜0.05），表現(xiàn)為促進(jìn)FSH分泌；Ⅲ期時(shí)，GnRH含量與FSH、LH、hCG含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）；Ⅴ期（排卵后）時(shí)與FSH含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）。TRH含量始終與FSH、hCG、GnRH含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），且與其他激素升降趨勢(shì)一致，TRH含量在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期與LH含量呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），但是排卵后TRH與LH含量的相關(guān)性不顯著。

以上結(jié)果提示，在馬的繁殖季節(jié)，可以每天采血進(jìn)行生殖激素監(jiān)測(cè)，追蹤FSH、LH、hCG含量變化，當(dāng)它們含量逐漸上升后，突然開(kāi)始下降時(shí)，為最佳輸精時(shí)間。