基于腸道菌群介導(dǎo)的炎性反應(yīng)研究黃芪多糖對(duì)結(jié)腸炎相關(guān)癌癥的作用

劉雷蕾 馬淑然

摘要 目的：探討黃芪多糖（APS）對(duì)結(jié)腸炎相關(guān)癌（CAC）小鼠和結(jié)腸癌細(xì)胞中腸道細(xì)菌誘導(dǎo)的Toll樣受體-4/核因子-κB（TLR4/NF-κB）信號(hào)通路的影響。方法：將40只C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10），模型組（n=15）和APS組（n=15）。模型組和APS組由氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸鈉制成CAC模型。對(duì)照組和模型組給予0.9%氯化鈉注射液，APS組給予100 mg/kg APS灌胃14 d。動(dòng)物研究中，通過(guò)HE染色方法檢測(cè)小鼠中結(jié)腸直腸的病理狀況;通過(guò)16S rDNA測(cè)序分析腸道菌群的特征;通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定脂多糖濃度;免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織中TLR4和NF-κBp65蛋白的表達(dá)。體外研究中，進(jìn)一步驗(yàn)證了APS對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響，運(yùn)用MTT測(cè)定和劃痕實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估細(xì)胞活力測(cè)定;通過(guò)免疫熒光檢測(cè)NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位;Western blot檢測(cè)E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)。結(jié)果：測(cè)序結(jié)果表明，模型組以革蘭氏陰性菌擬桿菌屬為主，APS組腸道菌群多為革蘭氏陽(yáng)性菌乳球菌屬和雙歧桿菌屬;APS組LPS、TLR4和NF-κBp65蛋白的表達(dá)水平明顯低于模型組;APS可以抑制LoVo細(xì)胞和HCT116細(xì)胞的增殖和遷移能力;APS（40 μg/mL）可抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，降低N-cadherin蛋白的表達(dá)，增加E-cadherin蛋白的表達(dá)。結(jié)論：APS通過(guò)抑制革蘭氏陰性病原體，減少LPS的釋放，抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，阻止CAC的發(fā)生，且APS可有效抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，有效控制腫瘤的增殖和遷移。

關(guān)鍵詞 結(jié)直腸癌;腸道菌群;脂多糖;黃芪多糖;核因子κB

Study on the Mechanism of Astragalus Polysaccharide on Colitis-Related Cancer Based

on the Inflammatory Response Mediated By Intestinal Flora

LIU Leilei，MA Shuran

（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 10029，China）

Abstract Objective：To explore the effects of Astragalus polysaccharide（APS）on intestinal bacteria induced Toll-like reeeptor-4 / nuclear factor-κB（TLR4/NF-κB）signaling pathway in colitis-associated cancer（CAC）mice and colon cancer cells.Methods：A total of 40 C57BL/6J male mice were randomLy divided into a control group（10 mice），a model group（15 mice），and an APS group（15 mice）.The model group and APS group were made CAC model by azoxymethane and sodium dextran sulfate.The control group and model group were given 0.9% sodium chloride injection，and the APS group was given 100 mg/kg APS by gavage for 14 days.In this study，the Histopathological Examination method was used to detect the pathological conditions of colorectal in mice.Characteristics of intestinal flora were analyzed by 16S rDNA sequencing.Lipopolysaccharide concentrations were determined by enzyme 1inked immunosorbent assay.Expressions of TLR4 and NF-κB p65 proteins in colon tissue were detected by immunohistochemistry.In the in vitro study，we further validated the effects of APS on proliferation and migration of human colon cancer cells.The MTT assay and Scratch test were used to evaluate cell viability assays.The nuclear translocation of NF-κB p65 was detected by immunofluorescence.Western blot was used to detect the expression of E-cadherin and N-cadherin proteins.Results：Sequencing results showed that Gram-negative bacteria（Bacteroides）were commonly detected in the model group，and intestinal flora in APS group were mostly Gram-positive bacteria（Lactococcus and Bifidobacterium）.Expression levels of LPS，TLR4，and NF-κB p65 proteins in APS group were significantly lower than those in the model group.APS can inhibit the proliferation and migration of LoVo cells and HCT116 cells; APS（40 μg/mL）can inhibit the nuclear translocation of NF-κB，reduce the expression of N-cadherin protein，and increase the expression of E-cadherin protein.Conclusion：APS can prevent CAC by inhibiting Gram-negative pathogens，reducing the release of LPS and inhibiting TLR4/NF-κB signaling pathway.And APS can effectively inhibit the EMT process of human colon cancer cells and effectively control tumor proliferation and migration.

Keywords Colorectal carcinoma; Intestinal flora; Lipopolysaccharide; Astragalus polysaccharide; Nuclear factor κB

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.008

最新全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)《全球癌癥報(bào)告》顯示2018年結(jié)腸直腸癌（Colorectal Carcinoma，CRC）新增180萬(wàn)例患者，占比10.2%，位居癌癥發(fā)病率的排行榜第3名。從死亡病例數(shù)字來(lái)看，結(jié)腸癌死亡率僅次于肺癌，位居第2，有88.1萬(wàn)人死于結(jié)直腸癌，占比9.2%[1]。最近10年來(lái)，伴隨著飲食、肥胖和生活方式的改變，中國(guó)CRC的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[2]。目前對(duì)結(jié)直腸癌的治療主要是通過(guò)手術(shù)、放化療以及免疫治療等手段，然而仍有將近40%～50%的CRC患者在確診后5年內(nèi)死亡[3]。最新臨床研究顯示，在用抑制負(fù)性免疫調(diào)節(jié)治療癌癥的藥物PD-1或PD-L1治療時(shí)，部分患者對(duì)藥物反應(yīng)降低，主要因?yàn)榛颊叽嬖谀c道菌群失調(diào)情況，需要治療時(shí)配合調(diào)節(jié)腸道菌群才能提高藥物應(yīng)答率[4]。因此，促使我們尋求有效的輔助治療辦法，以改善CRC的治療。

目前一些中藥已經(jīng)被證實(shí)具有多靶點(diǎn)，多通道，低不良反應(yīng)，延長(zhǎng)生存期，減輕疼痛，改善生命質(zhì)量的廣譜抗腫瘤作用。例如由黃芪和女貞子（2∶1，w/w）組成的貞芪扶正膠囊常作為外科手術(shù)的輔助用藥，以提高免疫力，促進(jìn)癌癥患者免疫功能的恢復(fù)[5]。藥理研究表明，黃芪水提取物具有多種生物學(xué)功能。黃芪多糖（Astragalus Polysaccharide，APS）是黃芪的主要成分，在控制炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激，維持和調(diào)節(jié)腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵作用[6]。APS已被廣泛用于抑制腫瘤生長(zhǎng)，細(xì)胞侵襲和血管生成，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究中[7]。APS可以調(diào)節(jié)Wnt，p53和NF-κB各種癌癥信號(hào)通路，并與特定的轉(zhuǎn)錄分子相互作用，發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。在臨床聯(lián)合治療中，APS聯(lián)合鼻咽癌一線化療藥順鉑可通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比值和半胱天冬酶增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的化療敏感性[9]。

長(zhǎng)期存在的慢性炎性反應(yīng)是炎性反應(yīng)性腸病中結(jié)直腸癌的關(guān)鍵誘發(fā)因素，由炎性反應(yīng)性腸病發(fā)展成的結(jié)直腸癌叫作結(jié)腸炎相關(guān)癌癥（Colitis-associated Cancer，CAC）。在CRC中CAC占到15%～20%的比例[10]。在CAC進(jìn)展中，包括NF-κB，IL-6/STAT3，COX-2/PGE2和IL-23/Th17在內(nèi)的多種促炎途徑被激活，通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性反應(yīng)遞質(zhì)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生，上調(diào)抗細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，刺激腫瘤細(xì)胞增殖以及血管生成[11]。作為腸黏膜生物屏障的重要組成，腸道菌群與受損腸道黏膜之間的相互作用同樣在CAC的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要作用[12]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）是一種上皮細(xì)胞失去上皮特性而獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過(guò)程，主要與細(xì)胞間的黏附中斷、細(xì)胞極性喪失和細(xì)胞離散導(dǎo)致的惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[13]。腫瘤微環(huán)境可促使癌細(xì)胞之間相互作用，通過(guò)自分泌和/或旁分泌生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[14]。EMT的發(fā)生受多種信號(hào)通路和細(xì)胞因子的調(diào)控，其中NF-κB信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT有重要影響。

因此，我們假設(shè)天然藥物APS可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制菌群介導(dǎo)的炎性反應(yīng)和EMT，而發(fā)揮抗癌作用。在目前的工作中，為了檢驗(yàn)這個(gè)假設(shè)，我們建立了AOM/DSS誘導(dǎo)的CAC小鼠模型，并證明了APS在調(diào)節(jié)腸道菌群和抑制炎性反應(yīng)方面有積極作用。同時(shí)，APS在體外抗腫瘤活性檢測(cè)中，已被證實(shí)具有抗人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo增殖和遷移的作用，且對(duì)EMT的發(fā)生有抑制作用。我們的發(fā)現(xiàn)表明APS具有治療CAC的潛力并就其可能的機(jī)制提供新的有用線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與細(xì)胞 人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo細(xì)胞和HCT116細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所（American Type Culture Collection，ATCC）。所有細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗（100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）的RPMI1640完全培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，24 h貼壁后更換新的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，隔日換液，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面積的90%時(shí)進(jìn)行傳代。SPF級(jí)C57BL/6J小鼠，雄性，6周齡，18～20 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2014-0004;飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級(jí)[溫度（20±2）℃，相對(duì)濕度60%，氣流速度≤0.18 m/s]。

1.1.2 藥物 黃芪多糖（上海吉至生化科技有限公司，貨號(hào)：C54200-25 g）

1.1.3 試劑與儀器 青霉素-鏈霉素雙抗溶液（HyClone公司，美國(guó)，貨號(hào)：SV30010）;胎牛血清（HyClone公司，美國(guó)，貨號(hào)：SV30087.01）;RPMI1640培基（HyClone公司，美國(guó)，貨號(hào)：SH30203.05）;氧化偶氮甲烷AOM（sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：A5486）;葡聚糖硫酸鈉DSS（MP公司，美國(guó)，貨號(hào)：02160110-CF）;E.Z.N.A. Stool DNA Kit（Omega公司，美國(guó)，貨號(hào)：M4015-02）;小鼠脂多糖ELISA試劑盒（天津貝爾格萊科技有限公司，貨號(hào)：A-2631）;小鼠NF-κB抗體（CST公司，美國(guó)，貨號(hào)：6956）;小鼠TLR4抗體（武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：BA1717）;小鼠E-cadherin抗體（CST公司，美國(guó)，貨號(hào)：14472）;小鼠N-cadherin抗體（CST公司，美國(guó)，貨號(hào)：14215）;DyLight488-羊抗兔IgG熒光二抗（武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：BA1127）;光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本，型號(hào)：BX51T-PHD-J11）;離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)，型號(hào)：5430）;菌群測(cè)序平臺(tái)（北京諾禾致源科技股份有限公司，型號(hào)：HiSeq2500 PE250）;多功能板讀板機(jī)（Thermo公司，德國(guó)，型號(hào)：Multiskan FC）;凝膠成像系統(tǒng)（Bio Rad公司，美國(guó)，型號(hào)：MP5000）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 CAC小鼠模型采用AOM聯(lián)合DSS周期性誘導(dǎo)建模法（圖1A）。本次實(shí)驗(yàn)共分為3組，共計(jì)40只小鼠，空白組（n=10），模型組（n=15）和觀察組（n=15）。除空白組外，其余小鼠先予10 mg/kg的AOM腹腔注射，再以蒸餾水和普通飼料喂養(yǎng)1周，第2周將飲水換為濃度2%的DSS溶液自由飲用，第3、4周撤去DSS溶液，仍恢復(fù)蒸餾水喂養(yǎng);如此1周DSS加2周蒸餾水喂養(yǎng)為1個(gè)致炎周期，總共重復(fù)3個(gè)致炎周期完成建模。

1.2.2 給藥方法 根據(jù)人與小鼠之間藥物劑量換算方法，觀察組組小鼠以100 mg/kg的黃芪多糖APS灌胃。模型組和空白組予以0.2 mL生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃給藥14 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 組織病理學(xué)評(píng)價(jià) 治療結(jié)束后處死全部小鼠，取結(jié)腸組織并固定于中性福爾馬林液中，固定24 h以后，執(zhí)行常規(guī)脫水及石蠟包埋，使用石蠟切片機(jī)4 μm切片。將待染色的切片于65 ℃烘箱中放置0.5 h后，常規(guī)HE染色，用適當(dāng)濃度的中性樹膠封片，用于顯微鏡拍攝分析。根據(jù)結(jié)腸標(biāo)本組織學(xué)病變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[15-17]進(jìn)行光鏡下評(píng)價(jià)。見表1。

1.2.3.2 腸道菌群基因測(cè)序 取100 mg糞便樣本加入2 mL離心管中，按照E.Z.N.A.TMStool DNA Kit操作步驟進(jìn)行提取，得到純化的基因組DNA后，釆用紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)總DNA在260 nm和280 nm兩處的吸光度，觀測(cè)總DNA的濃度和OD 260/OD280的比值。純化的基因組存放-20 ℃保存待測(cè)。使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量，文庫(kù)合格后，使用HiSeq2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.2.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清LPS濃度?? 治療結(jié)束后首先用10%水合氯醛麻醉劑麻醉小鼠，隨后從小鼠眼眶采取全血，室溫自然凝固10 min，用低溫高速離心機(jī)以4 ℃，3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，提取上清液，按照ELISA試劑盒操作規(guī)程測(cè)定血清LPS水平。圖3A展示了本次檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及計(jì)算方程，R2=0.981 9提示線性良好。

1.2.3.4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)TLR4和NF-κB蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)束后解剖小鼠腹腔，于距肛門2.5 cm處取0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm結(jié)腸組織塊浸泡于中性甲醛溶液中固定。結(jié)腸組織脫水和包埋后切片。把切片后的組織放入1%甲醇雙氧水中，室溫浸泡10 min后洗凈，再用pH為6.0的0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液浸泡。山羊血清室溫封閉20 min。一抗TLR4（1∶200）和NF-κB p65（1∶100）4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗凈后滴加二抗IgG（1∶200）37 ℃孵育20 min。加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37 ℃孵育20 min。使用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min后在光學(xué)顯微鏡下觀察。按照免疫組化染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[18]評(píng)分。見表2。

1.2.3.5 細(xì)胞活力檢測(cè) 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞和HCT116細(xì)胞，于96孔板上每孔加入200 μL 2.5×104個(gè)/mL的細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)液，每孔分別加入200 μL用RPMI 1640培基配制的160 μg/mL、80 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL和5 μg/mL濃度的APS溶液和終濃度為1 μg/mL LPS，空白對(duì)照組加200 μL的RPMI1640培基。分別于加藥干預(yù)24 h、48 h和72 h后棄去培養(yǎng)液，加入100 μL 0.5 mg/mL的MTT溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去MTT溶液，每孔加入150 μL的DMSO溶液，避光搖勻后放入多功能酶標(biāo)儀測(cè)定溶液在570 nm處的吸光度，得到OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞和HCT116細(xì)胞，消化后離心，以完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL的濃度，每孔2.5 mL接種于六孔板中，待細(xì)胞鋪滿孔底后，用槍頭沿著直尺垂直于六孔板劃痕。繼續(xù)加藥培養(yǎng)24 h和48 h，觀察80 μg/mL的APS對(duì)HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，以及40 μg/mL的APS對(duì)LoVo細(xì)胞遷移的影響。

1.2.3.6 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)NF-κB p65分布 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞種于六孔板并分組。加40 μg/mL的APS干預(yù)48 h后吸去培基，每孔加入2 mL的4%多聚甲醛固定15 min，吸除多聚甲醛，每孔加入1 mL 0.1%TritonX-100室溫通透5 min，再用PBS清洗3次，每孔加入1 mL 3%BSA室溫封閉30 min，棄去封閉液，每孔加入適量用3%BSA稀釋過(guò)的NF-Κb p65抗體（1∶500），置于冰上搖勻后存放于4 ℃冰箱過(guò)夜，孵育一抗。從冰箱中取出后于37 ℃恒溫箱中復(fù)溫45 min，用PBS清洗3次，每孔加入用1%BSA稀釋過(guò)的DyLight488-羊抗兔IgG熒光二抗（1∶400），室溫避光孵育1 h。于暗處吸除二抗，以PBS洗滌3次，每孔加入1 mL細(xì)胞核染液DAPI（5 μg/mL），室溫孵育，吸除DAPI后，加入1滴（50 μL）的抗熒光淬滅封片液，于熒光顯微鏡下觀察NF-κB p65在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布。

1.2.3.7 蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)NF-κB、E-cad、N-cad蛋白表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LoVo細(xì)胞種于六孔板并分組。加40 μg/mL的APS干預(yù)48 h后吸去培基，加入300 μL預(yù)冷的RIPA裂解液（已加入蛋白酶抑制劑PMSF），充分裂解后，13 000×g 4 ℃離心10 min，取上清液即蛋白提取物。按照BCA試劑盒說(shuō)明測(cè)定蛋白濃度。來(lái)自每個(gè)樣品的20 μg蛋白質(zhì)通過(guò)8%的SDS-PAGE電泳分離膠，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用含5%BSA的TBST（0.1%）封閉2 h，將PVDF膜與一抗（NF-κB p65 1∶1 000;E-cad 1∶1 000;N-cad 1∶1 000;β-Actin 1∶500）在4 ℃下孵育過(guò)夜。取出PVDF膜，用TBST沖洗3次，5 min/次。之后加入相應(yīng)的二抗（用5%的BSA按照1∶10 000稀釋），置于搖床上室溫孵育1.5 h，結(jié)束后用TBST沖洗PVDF膜5次，于凝膠成像系統(tǒng)，曝光成像，導(dǎo)出條帶圖片，采用Image J軟件分析條帶的灰度值，計(jì)算出不同條帶的相對(duì)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間分析用Unpaired T test，多組間分析用one-way ANOVA分析。不符合正太分布的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（percent25，percent75）和平均秩進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，用Mann-Whitney檢驗(yàn)分析不同組之間的差異性。所有檢驗(yàn)均以雙側(cè)檢驗(yàn)為顯著性水準(zhǔn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APS改善了CAC模型鼠健康狀況和生存指數(shù)? 空白組小鼠在整個(gè)造模期以及后續(xù)治療期皆表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng)，糞便情況正常。在AOM/DSS造模過(guò)程中，小鼠在DSS致炎刺激后表現(xiàn)出明顯的體質(zhì)量下降，活動(dòng)狀態(tài)減緩，部分小鼠出現(xiàn)稀便或便血;在停止DSS刺激后的雙蒸水喂養(yǎng)階段，小鼠體質(zhì)量逐漸恢復(fù)增長(zhǎng)，便血減少;經(jīng)過(guò)反復(fù)的致炎刺激小鼠最終體質(zhì)量降為（17.83±0.86）g。見圖1B。在整個(gè)治療期（第11、12周），模型組小鼠精神狀態(tài)萎靡，便質(zhì)稀，毛發(fā)雜亂，活動(dòng)少，進(jìn)食和飲水相對(duì)較少，治療終點(diǎn)體質(zhì)量維持在（18.02±2.05）g。觀察組小鼠表現(xiàn)出較好的活動(dòng)和精神狀態(tài)，進(jìn)食和飲水相對(duì)增加，稀便減少，治療終點(diǎn)體質(zhì)量恢復(fù)到（24.05±2.74）g，明顯高于模型組（P<0.01）。根據(jù)Log-rank（Mantel-Cox）存活曲線。見圖1C。從第11周到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，APS的治療提高了經(jīng)AOM/DSS造模處理的小鼠的存活率（P<0.05）。此外，經(jīng)AOM/DSS刺激后，模型組與空白組比較，結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短（P<0.01）。與模型組比較，觀察組的結(jié)腸長(zhǎng)度明顯增長(zhǎng)（P<0.01），提示APS能夠緩解由DSS致炎刺激導(dǎo)致的結(jié)腸短縮。見圖1D。

2.2 APS減少結(jié)腸腫瘤和改善非典型增生 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后縱向剖開結(jié)腸，統(tǒng)計(jì)分析各組小鼠結(jié)腸腫瘤個(gè)數(shù)和腫瘤大小差異。腫瘤大小以Load值表示，即單只小鼠全部腫瘤的長(zhǎng)徑乘短徑之和。AOM/DSS周期性誘導(dǎo)小鼠形成結(jié)腸腫瘤的發(fā)病率為100%。如圖2A所示，模型組小鼠結(jié)腸腫瘤個(gè)數(shù)為（13.50±3.10）個(gè)。見圖2B。模型組單只小鼠腫瘤大小Load值為（50.17±22.84）mm2。治療結(jié)束后，觀察組腫瘤個(gè)數(shù)為（4.33±1.63）個(gè)，Load值為（19.00±28.32）mm2。APS（100 mg/kg）雖然沒(méi)有阻止腫瘤的發(fā)生，但是明顯降低了腫瘤個(gè)數(shù)（P<0.01）和大?。≒<0.05）。HE染色病理結(jié)果圖2E可見，空白組腸黏膜各層結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)正常，局部黏膜下層未見增生和腫瘤。模型組腸黏膜各層結(jié)構(gòu)欠清晰，可見重度異型增生，細(xì)胞異型性明顯，層次增多，極像紊亂，腺管結(jié)構(gòu)紊亂，部分腺體有融合，異型腺體限于黏膜層，全部隱窩缺損，廣泛的粒細(xì)胞分布伴顯著浸潤(rùn)。觀察組腸黏膜各層結(jié)構(gòu)清晰，腸絨毛形態(tài)欠規(guī)整，可見低或中度異型增生。圖2C描述了各組非典型增生評(píng)分情況。模型組結(jié)腸組織非典型增生評(píng)分中位數(shù)為3，percent25為2.75，percent75為3，與空白組比較顯著增高（P<0.01）。觀察組腸組織非典型增生評(píng)分中位數(shù)為1，percent25為1，percent75為2，與模型組比較明顯降低（P<0.01）。

2.3 APS抑制CAC小鼠腸道炎性反應(yīng) 病理結(jié)果見圖2E（HE染色，×400），空白組腸黏膜未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組全部隱窩缺損，廣泛的粒細(xì)胞分布伴顯著浸潤(rùn)，炎性反應(yīng)評(píng)分中位數(shù)為4，percent25為3，percent75為4。經(jīng)APS治療后，結(jié)腸組織中部分隱窩缺損，偶有粒細(xì)胞浸潤(rùn)，呈輕度炎性反應(yīng)，炎性反應(yīng)評(píng)分中位數(shù)為1.5，percent25為1，percent75為2，與模型組比較明顯降低（P<0.01）。見圖2D。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步用ELISA法檢測(cè)了各組小鼠血清中致炎物質(zhì)LPS的濃度。見圖3B?？瞻捉M小鼠血清LPS濃度為（9.25±1.30）U/L，模型組LPS平均水平為（18.99±2.86）U/L，顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，APS治療后LPS平均水平為（8.99±1.44）U/L，顯著降低（P<0.01）。

研究已經(jīng)證實(shí)在CAC發(fā)展中，腸道微生物屏障損傷，菌群移位，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的TLR4可感知到革蘭氏陰性菌裂解后釋放出的內(nèi)毒素LPS，進(jìn)而向下通過(guò)激活MyD88/TRAF6通路活化NF-κB，進(jìn)一步擴(kuò)大炎性反應(yīng)[19]。本研究在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中，用免疫組化的方法檢測(cè)了各組小鼠結(jié)腸組織中TLR4蛋白（圖3C）和NF-κB p65蛋白（圖3D）的表達(dá)情況。空白組TLR4蛋白和NF-κB p65蛋白著色淺棕色呈弱陽(yáng)性，IHS評(píng)分為（1.17±0.75）分和（1.00±0.63）分。與空白組比較，模型組TLR4和NF-κB p65的IHS評(píng)分為（12.83±2.71）分和（9.33±2.34）分，蛋白著色呈深棕色或棕褐色，表達(dá)水平顯著提高（P<0.01）。與模型組比較，觀察組TLR4和NF-κB p65的IHS評(píng)分為（3.67±2.07）分和（3.83±2.04）分，蛋白著色呈淺棕色，表達(dá)水平降低（P<0.05）。見圖3E。

2.4 APS改善CAC小鼠腸道菌群 本研究以97%的一致性將測(cè)序所得序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），并對(duì)OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋。圖4A中，物種累積箱形圖（Species Accumulation Boxplot）描述了隨著樣本量的增加物種多樣性增加的分析，提示此環(huán)境中的物種并不會(huì)隨樣本量的增加而顯著增多。如圖4B所示，用shannon指數(shù)反映樣品內(nèi)的微生物群落的多樣性，并通過(guò)組間比較發(fā)現(xiàn)模型組shannon指數(shù)為（5.40±0.25）低于空白組（6.35±0.27）（P<0.05），經(jīng)APS處理后，shannon指數(shù)升高到（6.09±0.32），高于模型組（P<0.05）。提示APS可以改善菌群多樣性。

根據(jù)屬水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前25的菌屬，根據(jù)其在每個(gè)組中的豐度信息，從物種和分組2個(gè)層面進(jìn)行聚類，繪制出熱圖。如圖4C所示，空白組以Akkermansia、Alloprevotella、Allobaculum、Desulfovibrio和Lachnospiraceae為主。而模型組中Bacteroides、Erysipelatoclostridium和Prevotellaceae聚集較多，Akkermansia、Alloprevotella、Allobaculum和Lachnospiraceae的含量較低。經(jīng)APS處理后，Lactococcus、Parasutterella、Bifidobacterium和Lachnospiraceae聚集較多。為了尋找Species分類水平，3組樣本之間優(yōu)勢(shì)物種的差異，選取種分類水平上平均豐度排名前10的物種，生成三元相圖[20]，可以直觀看出模型組優(yōu)勢(shì)物種為Bacteroides_acidifaciens，空白組優(yōu)勢(shì)物種為Helicobacter_ganmani，觀察組優(yōu)勢(shì)物種為L(zhǎng)actobacillus_animalis和Lactococcus_piscium（圖4D）。研究進(jìn)一步用LEfSe分析組與組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Biomarker[21]，即組間差異顯著的物種。如圖4E所示，空白組和模型組比較，模型組的Biomarker為Bacteroides和Prevotellaceae;空白組的Biomarker為Alloprevotella和Allobaculum。如圖4F所示，模型組和APS組比較，模型組的Biomarker為Bacteroidales_bacterium_ph8。

2.5 APS抑制LoVo細(xì)胞和HCT116細(xì)胞增殖和遷移 研究已經(jīng)證實(shí)1 μg/mL LPS作用48 h時(shí)可明顯促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和HCT116的增殖。本研究先用LPS（1 μg/mL）刺激結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和HCT116，再給予不同濃度APS干預(yù)，用MTT測(cè)定法測(cè)定了APS對(duì)這2種細(xì)胞活力的影響。如圖5A，B所示，160 μg/mL、80 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL和5 μg/mL濃度的APS對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo和HCT116有不同的抑制作用，其中40 μg/mL的APS對(duì)LoVo細(xì)胞的抑制作用明顯，濃度80 μg/mL的APS對(duì)HCT116抑制作用明顯。這些發(fā)現(xiàn)表明，適宜濃度的APS可以抑制CRC細(xì)胞增殖。

本研究還通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)了40 μg/mL的APS作用于LoVo細(xì)胞48 h可以抑制其遷移能力，而80 μg/mL的APS作用于HCT116細(xì)胞48 h也可以抑制其遷移能力。如圖5C，D所示，LPS（1 μg/mL）刺激結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞和HCT116細(xì)胞24 h和48 h后皆明顯增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，在加入適宜濃度APS后，劃痕面積未見明顯縮小，證實(shí)APS對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞和HCT116細(xì)胞的遷移能力有抑制作用。

2.6 APS抑制LPS誘導(dǎo)的LoVo細(xì)胞NF-κB p65核轉(zhuǎn)位 已經(jīng)有同類研究證實(shí)LPS可經(jīng)TLR4/NF-κb信號(hào)通路活化NF-κB[22]。實(shí)驗(yàn)利用免疫熒光法直觀地觀察到APS對(duì)NF-κB p65的影響。見圖6。NF-κB p65在LoVo細(xì)胞中呈現(xiàn)出低表達(dá)。LPS（1 μg/mL）刺激結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞48 h后，NF-κB p65在LoVo細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)皆升高。再予以40 μg/mL的APS處理后，NF-κB p65在細(xì)胞中的表達(dá)減少，且主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，入核情況減少，說(shuō)明APS可以抑制NF-κB的活化。本研究還用WB的方法檢測(cè)了細(xì)胞中總NF-κB p65蛋白的含量，相對(duì)于空白組而言，LPS處理的模型組細(xì)胞中NF-κB p65蛋白灰度值有所升高（1.25±0.49），而經(jīng)APS（40 μg/mL）處理后，灰度值明顯下降（0.63±0.17）（P<0.01）。見圖7。

2.7 APS抑制LPS誘導(dǎo)的LoVo細(xì)胞EMT 研究表明NF-κB激活后進(jìn)入細(xì)胞核后可與特定基因結(jié)合，抑制E-cadherin（E-cad）的表達(dá)，促進(jìn)N-cadherin（N-cad）的表達(dá)，從而促使EMT發(fā)生[23]。本研究進(jìn)一步用WB的方法測(cè)定了EMT發(fā)生的相關(guān)蛋白E-cadherin和N-cadherin的相對(duì)灰度值。見圖7。觀察組相對(duì)空白組的E-cadherin蛋白表達(dá)量為（1.39±0.22），顯著高于模型組（0.54±0.15）（P<0.01）。觀察組相對(duì)空白組的N-cadherin蛋白表達(dá)量為（0.62±0.16），顯著低于模型組（1.76±0.73）（P<0.01）。這樣的結(jié)果說(shuō)明APS（40 μg/mL）可以通過(guò)抑制NF-κB活化，減少N-cadherin蛋白的表達(dá)，增加E-cadherin蛋白的表達(dá)，而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞遷移的效果。

3 討論

由腸道炎性反應(yīng)，到不典型增生，再到癌變的途徑是目前比較公認(rèn)的結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的病理進(jìn)程[24]。本研究建立的AOM/DSS模型[25]，即是將腸上皮細(xì)胞暴露于慢性炎性反應(yīng)環(huán)境中，造成細(xì)胞中各種突變接連發(fā)生累積，并且在長(zhǎng)期的炎性刺激中產(chǎn)生免疫耐受，逃脫免疫清除，發(fā)生隱窩細(xì)胞增生，進(jìn)而使結(jié)腸上皮發(fā)生瘤變，最終導(dǎo)致腫瘤形成。在這一過(guò)程初期，腸黏膜屏障損傷，菌群移位，致病物質(zhì)造成的炎性刺激可使免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞被募集到病灶處，并分泌細(xì)胞因子，發(fā)揮抗感染作用和修復(fù)受損組織作用[26]。但在菌群失調(diào)持續(xù)存在的情況下，腸黏膜長(zhǎng)期被炎性因子和趨化因子包圍，形成炎性微環(huán)境，進(jìn)一步導(dǎo)致抗感染-修復(fù)平衡失衡，激活了腸上皮細(xì)胞原癌基因，最終導(dǎo)致惡化[27]。本研究造模結(jié)束后小鼠呈現(xiàn)出消瘦、精神萎靡、毛發(fā)雜亂無(wú)光澤以及活動(dòng)度差等一般表現(xiàn)。解剖后發(fā)現(xiàn)于結(jié)直腸縮短，且遠(yuǎn)端出現(xiàn)明顯腫瘤，成瘤率100%。經(jīng)HE染色病理提示細(xì)胞異型性明顯，層次增多，極像紊亂，腺管結(jié)構(gòu)紊亂，部分腺體有融合，異型腺體限于黏膜層，伴有廣泛的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，符合結(jié)直腸癌病理評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。且進(jìn)一步檢測(cè)模型小鼠血清中LPS水平，2倍高于正常小鼠血清LPS濃度。LPS可以繼續(xù)擴(kuò)大炎性反應(yīng)程度，加速腫瘤的形成和發(fā)展，符合實(shí)驗(yàn)需求。

炎性反應(yīng)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展之間還需要借助腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生一些促癌因子，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和存活因子的生成，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。LPS可由腸道中革蘭氏陰性菌裂解死亡后釋放出來(lái)。也就是說(shuō)在CAC模型鼠中血清LPS的升高與腸道中革蘭氏陰性菌裂解死亡相關(guān)[28]。本研究通過(guò)菌群測(cè)序發(fā)現(xiàn)CAC模型小鼠腸道菌群豐度與正常小鼠比較明顯減小，結(jié)構(gòu)多樣性和復(fù)雜性降低。在菌屬水平，CAC小鼠腸道中擬桿菌屬所占比例最大。擬桿菌屬是一類革蘭氏染色呈陰性、無(wú)芽孢、專性厭氧的小桿菌。擬桿菌正常寄居于人和動(dòng)物的腸道、口腔、上呼吸道和生殖道。因長(zhǎng)期應(yīng)用廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑等，而使機(jī)體免疫功能紊亂或菌群失調(diào)時(shí)，能導(dǎo)致內(nèi)源性感染。比較重要的擬桿菌包括脆弱擬桿菌和產(chǎn)黑色素?cái)M桿菌。脆弱擬桿菌主要存在于腸道，比腸內(nèi)的大腸桿菌多100～1 000倍，在臨床標(biāo)本中，為闌尾炎和敗血癥的常見菌。Dejea C M等[29]研究發(fā)現(xiàn)脆弱擬桿菌還可以和一種大腸桿菌psk+Escherichia coli通過(guò)相互作用形成一種生物膜，進(jìn)而損壞結(jié)腸黏膜，引發(fā)結(jié)直腸癌。

革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁主成分LPS可與TLR4結(jié)合形成復(fù)合物。這個(gè)復(fù)合物會(huì)激活MyD88/TRAF6信號(hào)通路[30]，進(jìn)而使IκB蛋白的上游激酶IKK復(fù)合物磷酸化激活。被激活的IKK可磷酸化下游的IκB-α。IκB-α是NF-κB抑制蛋白，被磷酸化后又可發(fā)生泛素化而降解，從而釋放出NF-κB p65/p50二聚體。沒(méi)有了IκB-α的束縛，p50會(huì)拽著NF-κB p65入核。NF-κB p65可識(shí)別特定的DNA序列，并與之結(jié)合，調(diào)控靶基因而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[31]。研究指出在CAC小鼠模型中，敲除上皮細(xì)胞中的特異性IκB激酶β（Inhibitor of Nuclear Factor κ-βkinase，IKK-β），干預(yù)NF-κB激活的經(jīng)典途徑，可使小鼠體內(nèi)的腫瘤數(shù)量明顯下降[32]。

EMT是上皮細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過(guò)程中獲得運(yùn)動(dòng)和入侵能力的基本程序。在此過(guò)程中，細(xì)胞失去其上皮細(xì)胞特征，如E-cadherin和Zonula Occludens-1等細(xì)胞-細(xì)胞黏附蛋白，并獲得間充質(zhì)性狀，如N-cadherin和波形蛋白（Vimentin）等前體細(xì)胞骨架蛋白。E-cadherin下調(diào)，N-cadherin蛋白上調(diào)，可使細(xì)胞形成偽足，獲得侵襲能力，對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移起到促進(jìn)作用。具有EMT表型的細(xì)胞甚至可以作為單個(gè)細(xì)胞侵入，因此，探索EMT發(fā)生的機(jī)制對(duì)于提高患者的生存至關(guān)重要。有研究指出NF-κB能夠與基因上的轉(zhuǎn)錄因子Snail和ZEB基因位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，進(jìn)而抑制E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）和橋粒斑蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)N-鈣黏蛋白（N-cadherin，N-cad）的表達(dá)，以促進(jìn)EMT的發(fā)生[33]。本研究在體外實(shí)驗(yàn)部分已經(jīng)證實(shí)，LPS可以通過(guò)NF-κB途徑誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。

同領(lǐng)域研究者已證實(shí)黃芪多糖可減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，降低NF-κBp65 mRNA及其蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，從而發(fā)揮免疫保護(hù)作用[34]。在本研究中，通過(guò)CAC模型小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可見，灌服黃芪多糖后小鼠體質(zhì)量升高，一般狀態(tài)好轉(zhuǎn)，有利于恢復(fù)小鼠的體質(zhì)量和精神活動(dòng)狀態(tài)。解剖后觀察成瘤情況，黃芪多糖雖然沒(méi)有完全抑制腫瘤生長(zhǎng)，但是在減少成瘤數(shù)目和大小上有積極作用。在病理診斷上，炎性反應(yīng)程度和不典型增生程度也可被黃芪多糖改善。本在研究還證實(shí)了黃芪多糖可以改善CAC模型小鼠腸道菌群豐度和多樣性。研究中發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可以上調(diào)Lactobacillus和Lactococcus的豐度。Grimoud J等[35]根據(jù)抗炎和抗人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖作用體外篩選出有效的益生菌和合生元，其中短雙歧桿菌，乳球菌和Oligoalternan可以顯著抑制增殖。而這種增殖抑制的作用機(jī)制同樣是通過(guò)調(diào)控HT-29細(xì)胞對(duì)LPS誘發(fā)的炎性反應(yīng)應(yīng)答而實(shí)現(xiàn)的，LPS增加了其生物傳感器TLR4的表達(dá)，而益生菌或合生元的介入，可以降低這種炎性反應(yīng)傳導(dǎo)。本研究經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芪多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞NF-κB活化有抑制作用，并且通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)直觀的觀察到黃芪多糖可以抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移。由此可以推斷黃芪多糖對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞EMT的發(fā)生也有一定影響。因此，本研究進(jìn)一步研究了黃芪多糖對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的遷移的影響。在EMT的發(fā)生中，E-cad下調(diào)，N-cad蛋白上調(diào)，使細(xì)胞形成偽足，獲得侵襲能力，對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移起到促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)EMT發(fā)生的相關(guān)蛋白NF-κB p65、E-cad和N-cad作了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可以降低NF-κB p65和N-cad蛋白的含量，升高E-cad蛋白的含量。因此，可以初步認(rèn)為APS在抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移上也有明顯效果，并且這種效果的產(chǎn)生是由于TLR4/NF-κB信號(hào)通路被抑制。

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（2019-09-16收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2019M650596）

作者簡(jiǎn)介：劉雷蕾（1989.10—），男，博士后，助理研究員，研究方向：中醫(yī)基礎(chǔ)理論和中醫(yī)藥治療脾胃病基礎(chǔ)研究，E-mail：lightlong@126.com

通信作者：馬淑然（1964.11—），女，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：天人相應(yīng)中醫(yī)理論臨床與實(shí)驗(yàn)研究，E-mail：mashuran64@sina.com