揭陽地區(qū)妊娠期婦女定植無乳鏈球菌分子流行特征及耐藥特點

徐勇鋒, 黃旭東, 陳楚兵, 黃燕青, 黃春明, 洪欽明

1揭陽市中醫(yī)院檢驗科(廣東揭陽 522000)； 2揭陽市人民醫(yī)院檢驗科(廣東揭陽 522095)； 3揭陽市婦幼保健計劃生育服務中心檢驗科(廣東揭陽 522031)； 4揭陽市第三人民醫(yī)院檢驗科(廣東揭陽 522071)； 5揭陽市揭東區(qū)人民醫(yī)院檢驗科(廣東揭陽 515500)； 6揭陽市榕城區(qū)婦幼保健計劃生育服務中心檢驗科(廣東揭陽 522000)

無乳鏈球菌(streptococcus agalactiae)又稱為B群鏈球菌(group B streptococcus, GBS),妊娠晚期生殖道中無乳鏈球菌的定植，是引起產(chǎn)后宮內(nèi)感染和新生兒肺炎、腦膜炎以及菌血癥的重要原因[1]。研究表明[2]，定植無乳鏈球菌的序列型(sequence type, ST)和血清型分布、耐藥性以及毒力等流行特征均存在地理區(qū)域性差異。近年來，關(guān)于揭陽地區(qū)的定植無乳鏈球菌的分子流性特征鮮有報道。本研究擬對揭陽地區(qū)6家醫(yī)院分離的定植無乳鏈球菌，進行多位點序列分型(multilocus sequence type, MLST)、分子血清學分型、耐藥性等流行特征調(diào)查，為該地區(qū)定植無鏈球菌引起的妊娠不良結(jié)局的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本及菌株 本研究共收集妊娠35～37周婦女的陰道直腸拭子1 076份，來源于2018年1月至2019年12月間就診于揭陽市中醫(yī)院、揭陽市人民醫(yī)院、揭陽市婦幼保健計劃生育服務中心、揭陽市第三人民醫(yī)院、揭陽市揭東區(qū)人民醫(yī)院和揭陽市榕城區(qū)婦幼保健計劃生育服務中心等6家醫(yī)院的非重復患者。標準菌株肺炎鏈球菌ATCC49619、無乳鏈球菌ATCC12403和A909均購自美國典型菌種保藏中心。

1.1.2 試劑和儀器 LIM肉湯、M-H血瓊脂平板和哥倫比亞血瓊脂平板(廣州迪景公司)、藥敏紙片(英國Oxiod公司)、細菌基因組DNA提取試劑盒和Premix Taq(大連TaKaRa公司)。VITEK 2全自動細菌鑒定/藥敏分析儀及相關(guān)檢測試劑(法國梅里埃公司)、PCR擴增儀(美國ABI公司)、核酸凝膠電泳儀和凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。MLST和所有基因檢測的引物均由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 標本處理及菌株鑒定 將收集的陰道直腸拭子放入LIM肉湯，在37℃、5% CO2條件下，孵育24 h。將肉湯轉(zhuǎn)種于血平板上，在37℃、5% CO2條件下，孵育18 h，挑取菌落形態(tài)疑似無乳鏈球菌的菌落進行鑒定。同時滿足以下條件者可鑒定為無乳鏈球菌：(1)菌落有β溶血環(huán)；(2)涂片革蘭染色為革蘭陽性球菌，呈鏈狀排列；(3)CAMP實驗呈陽性；(4)經(jīng)VITEK2細菌鑒定儀鑒定結(jié)果為無乳鏈球菌。

1.2.2 DNA提取 參照TaKaRa試劑說明的要求和操作步驟，提取細菌基因組DNA，置于-80℃待用。

1.2.3 MLST分型 采用PCR技術(shù)，參照Jones 等[3]的報道，擴增7個管家基因(adhP,pheS,atr,glnA,sdhA,glcK和tkt)。擴增后的產(chǎn)物送上海生工公司進行測序分析。所獲得的序列經(jīng)MEGA6軟件剪齊后，上傳至pubmlst在線數(shù)據(jù)庫，通過7個管家基因的等基因數(shù)得出各菌株的ST。用eBURST version 3.1軟件對所有ST進行克隆群(clonal complexes，CCs)分析。將各類型ST的7個管家基因進行拼接后，采用MEGA6軟件用UPGMA法進行菌類分析。

1.2.4 分子血清分型 采用多重PCR技術(shù)，參照Imperi等[4]的報道，擴增莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)合成基因，通過瓊脂糖凝膠電泳確定各實驗菌株的血清型。分子血清分型以標準菌株ATCC12403(血清學 Ⅲ型)和A909(血清學Ⅰa型)參考菌株。

1.2.5 抗菌藥物敏感試驗 采用K-B法，檢測各菌株對青霉素(10 units)、紅霉素(15 μg)、克林霉素(2 μg)、氯霉素(30 μg)、左氧氟沙星(5 μg)、萬古霉素(30 μg)和四環(huán)素(30 μg)的敏感性。參照臨床和實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)抗菌藥物敏感試驗指南(http://www.clsi.org)2020版的試驗要求和藥敏標準。質(zhì)控菌株采用標準菌株肺炎鏈球菌ATCC49619。

1.2.6 D-抑菌圈試驗 參照李東等[5]的報道，對紅霉素耐藥且克林霉素敏感或中介的實驗菌株檢測是否有紅霉素耐藥菌株誘導克林霉素耐藥。D-抑菌圈試驗陽性菌株，克林霉素修正為耐藥。根據(jù)D-抑菌圈試驗的結(jié)果，對紅霉素和克林霉素耐藥表型進行分型。

1.2.7 耐藥基因檢測 參照何其勵等[6]的報道，采用PCR技術(shù)，擴增所有試驗菌株的紅霉素(ermA、ermB和mefA/E基因)和克林霉素(linB基因)耐藥基因，通過擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果確定耐藥株是否攜帶相應的耐藥基因。

1.3 統(tǒng)計學方法 藥敏結(jié)果采用WHONET5.6軟件進行分析。用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果 本研究從6家醫(yī)院1 076份非重復標本中，共檢出103株無乳鏈球菌，該地區(qū)妊娠婦女無乳鏈球菌攜帶率為9.6%(103/1 076)。

2.2 MLST結(jié)果 如圖1所示，本研究共從103株定植無乳鏈球菌種檢出21個ST,其主要ST包括ST19(32.0%)、ST17(18.4%)、ST103(6.8%)和ST23(6.8%)，其他ST所占比例均<5.0%。21個ST來源于8個CC，主要的CC包括CC19(39.8%)、CC17(18.4%)、CC103(16.6%)和CC23(8.8%)。

注：ST，序列型；CC,克隆群；該圖采用UPGMA法進行聚類分析

2.3 分子血清型結(jié)果 本次共檢出5種血清型，分別為Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ，所占比例依次為：24.3%(25/103)、12.6%(13/103)、5.8%(6/103)、49.5%(51/103)和7.8%(8/103)。如圖1所示，Ⅲ型主要分布于ST19(43.1%)和ST17(37.3%)、Ⅴ型主要分布于ST19(87.5%)、Ⅱ型主要分布于ST23(66.7%)；而Ia和Ib存在于多種ST中。

2.4 抗菌藥物敏感試驗結(jié)果 103株試驗菌株對青霉素和萬古霉素均敏感(敏感率為100.0%)，對紅霉素、克林霉素、四環(huán)素耐藥率以及多重耐藥率均>60.0%(表1)。本次未發(fā)現(xiàn)對紅霉素、克林霉素和氯霉素中介耐藥的菌株。不同血清型菌株對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、氯霉素的耐藥率以及多重耐藥率均存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)(表1)。

表1 不同血清型無乳鏈球菌間的耐藥率比較 株(%)

2.5 紅霉素和克林霉素耐藥基因檢測結(jié)果 本研究中的103株試驗菌株中，對紅霉素耐藥的74株菌株均檢出耐藥基因，ermA、ermB和mefA/E分別占16.2%(12/74)、83.8%(62/74)和25.7%(19/74)；對克林霉素耐藥的62株菌株中l(wèi)inB基因檢出率為54.8%(34/62)；此外，有3株對紅霉和克林霉素均敏感的試驗菌株檢出mefA/E基因。見表2。

表2 103株無乳鏈球菌耐藥表型、基因型與ST相關(guān)關(guān)系

2.6 紅霉素耐藥表型、基因型與ST的相關(guān)性 如表2所示，103株無乳鏈球菌分為5種表型，部分ST的表型和基因型較為集中，如ST17均為cMLSB型且基因型相同、ST103和ST651均為S型基因型也同；但部分ST的基因型和表型較為多樣，如ST19菌株。對紅霉素耐藥的74株菌株，cMLSB、iMLSB和M型等3種耐藥表型分別占73.0%(54/74)、8.1%(6/74)和18.9%(14/74)。

3 討論

無乳鏈球菌定植是引起妊娠不良結(jié)局的重要危險因素[7]。一項納入390篇文獻，涵蓋85個國家、299 924名孕婦的薈萃研究[8]表明，非亞洲地區(qū)、南亞地區(qū)和東亞地區(qū)的無乳鏈球菌定植率分別為：18%(95%CI:17%～19%)、12.5%(95%CI:10%～15%)和11%(95%CI:10%～12%)。雖然本研究中妊娠婦女無乳鏈球菌的定植率(9.6%)和其他東亞地區(qū)相近，但據(jù)報道[2, 9]不同地區(qū)的定植無乳鏈球菌的表型和基因型特征均存在差異，又考慮到我國地域廣闊和龐大的人口基數(shù)，因此深入了解揭陽地區(qū)定植菌株的遺傳多樣性和耐藥性等菌群結(jié)構(gòu)特征，對該地區(qū)的無乳鏈球菌引起感染的防控仍至關(guān)重要。

MLST是細菌分型研究常用的方法，可快速揭示菌群的譜系分布特征[10]。MLST結(jié)果顯示，本地區(qū)的定植無乳鏈球菌來源于8個CCs，但卻可分為21個ST，這表明揭陽地區(qū)流行的定植菌株有較高的遺傳多樣性。本地區(qū)流行的CC主要是CC19、CC17和CC103(共占74.8%)，這不同其他國家的報道，如:加拿大主要流行的CC為CC1、CC23和CC19[11],埃塞俄比亞主要為CC8、CC2和CC23[12]，這說明主要CC的分布存在地理區(qū)域性差異。CC19(主要為ST19)在國內(nèi)其他地區(qū)也是主要流行的CC[2, 13-14]；而CC17作為國內(nèi)引起新生兒侵襲性感染中重要的CC主要南方地區(qū)流行[14-15]，這和本研究的結(jié)果相一致。國外報道的CC103菌株主要引起牛乳房炎而人類感染較為少見[16]。然而本研究中CC103(占16.6%)為主要的流行CC之一，其所占比例及主要ST組成與其他華南地區(qū)相一致，如：南寧[17]、廣州[2]和深圳[14]。我們據(jù)此推測CC103已成為華南地區(qū)流行的主要定植無乳鏈球菌之一，且其主要ST構(gòu)成相似。但鑒于以上研究多為單中心、小樣本的研究，因此以上推測仍需要更多的流行病學數(shù)據(jù)支持。

無乳鏈球菌表面的莢膜多糖是其重要的毒力因子，也是血清學分型的重要依據(jù)[10]。因此，了解無乳鏈球菌的血清型，對了解其致病性至關(guān)重要。無乳鏈球菌血清型有10種，其中世界各地流行的定植菌株多為Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ等6種血清型(占98.0%以上)[8]。本研究共發(fā)現(xiàn)5種血清型(Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ)，這表明本地區(qū)流行的定植菌株的血清型和世界各地相似。Ⅲ、Ia和Ib等3種類型(占86.4%)為本地區(qū)流行主要血清型，這和廣州[2](93.0%)、東莞[18](85.7%)等地相似，但不同于其他地區(qū)，如：上海和多倫多均以Ⅲ、Ⅴ和Ia為主[11, 19]，而巴西[20]則以Ia、Ⅱ和Ib為主。此外，本研究表明，大部分ST與特定的血清型相對應，如：所有ST17均為Ⅲ型；所有ST103均為Ia；但部分ST的血清型分布存在多樣性，如ST19菌株，這也表明了其遺傳的多樣性。值得注意的是，ST17/血清學Ⅲ型被認為是高毒力菌株[15]，可引起威脅生命的新生兒侵襲性感染，而本研究中ST17/血清學Ⅲ型高達18.4%(19/103)。

目前，對于定植無乳鏈球菌引起產(chǎn)后感染的防控，美國CDC指南[21]推薦采用青霉素作為首選藥物進行分娩前的抗生素預防。本研究中，所有定植菌株對青霉素均敏感，可作為防御性治療的首選藥物。對于青霉素過敏者，紅霉素和克林霉素是其作為分娩前抗生素預防的中藥替代藥物。然而，本研究中，定植菌株對紅霉素和克林霉素的耐藥率高(均>60.0%)，因此，若以紅霉素或克林霉素作替代藥物，需結(jié)合藥敏試驗的結(jié)果進行選擇用藥而不適用于經(jīng)驗性用藥。定植無乳鏈球菌對紅霉素和克林霉素的高耐藥率，與北京[5]、廣州[2]和福州[22]等國內(nèi)其他地區(qū)報道一致。此外，本地區(qū)定植菌株對四環(huán)素的耐藥率高達94.2%，在國內(nèi)其他地區(qū)[23]同樣存在。值得注意的是，本地區(qū)定植無乳鏈球菌的多重耐藥率較高。本研究對不同血清型的耐藥率進行比較，表明不同血清型對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星、氯霉素的耐藥率以及多重耐藥率均存在差異(P均<0.05)。本研究中，對紅霉素耐藥的定植菌株主要是由ermB基因介導的cMLSB型，這與北京[5]和上海[19]地區(qū)的報道相似；但本地區(qū)的M型(占18.9%)高于北京地區(qū)(占5.2%)。據(jù)報道[24]，法國馬塞地區(qū)以M型為主，而巴黎地區(qū)以iMLSB型為主。這些研究均表明，不同地區(qū)的紅霉素耐藥表型存在差異。而紅霉素耐藥不僅存在表型的差異，其基因型也有一定差異，如國外學者認為M型主要由mefA/E基因介導[24-25]，而在我國存在ermB基因獨立介導M型的報道[5, 19]，本研究和國內(nèi)的報道一致。此外，本研究有3株S型菌株檢出mefA/E基因，這可能mefA/E基因不表達有關(guān)。紅霉素耐藥表型、基因型與ST相關(guān)研究表明，部分ST各菌株的耐藥表型和基因型較為一致，但部分ST的耐藥表型和基因型卻表現(xiàn)出多樣性。本研究中，克林霉素耐藥株linB基因檢出率僅為54.8%，這說明定植菌株對克林霉素耐藥可能還與其他耐藥機制有關(guān)。

總之，揭陽地區(qū)的定植無乳鏈球菌存在較高的遺傳多樣性，總體上其分子流行特征和耐藥特點與其他地區(qū)相似，但也有其自身的特點：(1)CC103已成為該地區(qū)流行的主要CC之一；(2)ST17/血清學Ⅲ型為該地區(qū)流行的主要定植菌株之一；(3)該地區(qū)定植菌株對紅霉素、克林霉素、四環(huán)素的耐藥率以及多重耐藥率較高；(4)紅霉素耐藥以ermB基因介導的cMLSB型，克林霉素耐藥部分由linB基因介導。