肺炎支原體肺炎患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2的表達(dá)及與Th17/Treg平衡的相關(guān)性

張騫，侯瑞霞，張超，張燕霞

（濟(jì)南市第二婦幼保健院1.兒科，2.藥劑科，山東濟(jì)南271199）

近年來(lái)，肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP）發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[1-2]。MPP 是常見(jiàn)小兒肺炎，臨床癥狀主要為發(fā)熱、咳嗽、咽痛、頭痛等。大量研究發(fā)現(xiàn)，MPP 發(fā)病機(jī)制與肺炎支原體入侵呼吸道上皮細(xì)胞、患兒免疫系統(tǒng)功能紊亂有關(guān)[1-2]。TIPE2 是一種新型免疫調(diào)節(jié)蛋白，可參與多種炎癥性疾病的發(fā)展。以往研究證實(shí)TIPE2 對(duì)免疫細(xì)胞具有促分泌作用，在小兒哮喘中發(fā)揮重要作用[3-4]。輔助性T 細(xì)胞17（helper T cell,Th17）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells,Treg）是兩種重要的免疫細(xì)胞類型，可分泌相應(yīng)細(xì)胞因子。有研究提示Th17/Treg 比例失調(diào)可能與支原體肺炎患兒病情發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[5-7]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)MPP 患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2 水平，分析其與Th17/Treg 平衡的關(guān)系，初步探究其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年9月—2020年9月濟(jì)南市第二婦幼保健院收治的MPP 急性發(fā)作期患兒和恢復(fù)期患兒各104 例作為研究對(duì)象。其中，急性發(fā)作組男性50 例，女性54 例；年齡1～11 歲，平均（5.19±2.47）歲?；謴?fù)組男性61 例，女性43 例；年齡1～10 歲，平均（5.37±2.01）歲。隨機(jī)納入同期本院健康體檢兒童90 例為對(duì)照組。其中，男性48 例，女性42 例；年齡1～10 歲，平均（5.26±1.92）歲。對(duì)照組兒童均無(wú)呼吸系統(tǒng)疾病及其他系統(tǒng)疾病，排除近2 周合并感染史、用藥史兒童。3 組研究對(duì)象年齡、性別構(gòu)成比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)①符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組發(fā)布的《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(shí)（2015年版）》[8]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患兒年齡≤12 歲；③臨床資料完整，患兒家屬均知情并自愿簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)①其他呼吸系統(tǒng)疾??；②合并心、肝、腎、肺等發(fā)育不全或功能不全；③合并血液系統(tǒng)疾病患者；④營(yíng)養(yǎng)不良；⑤其他原因引起的喘息、咳嗽、發(fā)熱等或近期發(fā)生過(guò)呼吸道感染疾病。

1.3 方法

1.3.1 血標(biāo)本采集收集入院次日MPP 患兒及健康體檢兒童清晨空腹靜脈血4 ml，平均分裝于2 個(gè)試管中，其中一只試管為抗凝管，加入人淋巴細(xì)胞分離液后分離得到單個(gè)核細(xì)胞，置于-80℃冷凍保存待測(cè)。另一只試管為非抗凝試管，2 000 r/min離心15 min，取上清液置于-80℃保存待測(cè)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2，人TIPE 試劑盒購(gòu)自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司。將分離后的單個(gè)核細(xì)胞用洗滌液洗滌2 次后重懸于10% FCS RPMI 1640 培養(yǎng)液，熒光標(biāo)記染色，充分震蕩后再次洗滌2 次，加固定液，染色，制片，熒光顯微鏡下觀察。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17、Treg，ELISA 檢測(cè)白細(xì)胞介素-17（Interleukin-17,IL-17）、白細(xì)胞介素-35（Interleukin-35,IL-35）、C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein,CRP）、降鈣素原（Procalcitonin,PCT）水平。人IL-17、人IL-35 試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博生物有限公司，人CRP、人PCT 試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司。均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 肺功能檢測(cè)利用FGC-A+型全自動(dòng)肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)MPP 患兒肺功能，包括第一秒用力呼氣量（forced expiratory volume in first second,FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity,FVC）、呼氣流量峰值（peak expiratory flow,PEF）。

1.4 觀察指標(biāo)

比較急性發(fā)作組、恢復(fù)組MPP 患兒和對(duì)照組健康兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg 及血清IL-17、IL-35、CRP、PCT 水平；比較急性發(fā)作組、恢復(fù)組MPP 患兒肺功能指標(biāo)；分析MPP 患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2 與Th17、Treg、Th17/Treg、血清IL-17、IL-35、CRP、PCT的相關(guān)性；分析影響MPP 發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法；影響因素的分析采用多因素Logistic回歸模型。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg及血清指標(biāo)比較

急性發(fā)作組、恢復(fù)組與對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg、TL-17、IL-35、CRP、PCT 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，恢復(fù)組、急性發(fā)作組MPP 患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2、Treg、IL-35 降低（P＜0.05），Th17、Th17/Treg、IL-17、CRP、PCT 升高（P＜0.05）；與恢復(fù)組比較，急性發(fā)作組MPP 患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2、Treg、IL-35 降低（P＜0.05），Th17、Th17/Treg、IL-17、CRP、PCT 升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3組外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg及血清指標(biāo)比較 （±s）

表1 3組外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg及血清指標(biāo)比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與恢復(fù)組比較，P ＜0.05。

組別急性發(fā)作組恢復(fù)組對(duì)照組F 值P 值n 104 104 90 TIPE2/（pg/ml）28.76±4.17①②42.08±6.34①53.24±8.13 364.251 0.000 Th17/%2.89±0.57①②2.13±0.40①1.29±0.21 338.250 0.002 Treg/%3.16±0.49①②4.22±0.64①5.45±0.83 291.034 0.000 Th17/Treg 0.92±0.18①②0.51±0.13①0.24±0.09 582.865 0.000組別急性發(fā)作組恢復(fù)組對(duì)照組F 值P 值PCT/（μg/L）0.20±0.06①②0.13±0.03①0.05±0.02 320.823 0.000 IL-17/（pg/ml）163.14±37.24①②147.33±25.06①138.14±23.29 18.077 0.000 IL-35/（pg/ml）156.81±39.74①②220.67±57.82①314.11±76.15 172.920 0.000 CRP/（mg/L）23.61±6.42①②9.25±2.87①4.17±1.63 558.022 0.000

2.2 急性發(fā)作組和恢復(fù)組MPP 患兒肺功能指標(biāo)比較

急性發(fā)作組與恢復(fù)組患兒FEV1、FVC、PEF比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），急性發(fā)作組FEV1、FVC、PEF 低于恢復(fù)組。見(jiàn)表2。

表2 急性發(fā)作組和恢復(fù)組MPP患兒肺功能指標(biāo)比較（n=104，%，±s）

表2 急性發(fā)作組和恢復(fù)組MPP患兒肺功能指標(biāo)比較（n=104，%，±s）

組別急性發(fā)作組恢復(fù)組t 值P 值FEV1 62.63±10.48 86.52±16.37 12.534 0.000 FVC 79.22±9.64 94.62±16.37 8.267 0.000 PEF 64.92±9.13 87.81±10.16 17.089 0.000

2.3 MPP患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

MPP 患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2 與Th17、Th17/Treg、IL-17、CRP、PCT 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與Treg、IL-35 及FEV1、FVC、PEF 呈正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 MPP患兒血清外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 影響MPP的危險(xiǎn)因素

以是否發(fā)生MPP 為因變量（1=是，0=否），將外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2、Th17、Treg、Th17/Treg 及血清IL-17、IL-35、CRP、PCT 等連續(xù)變量納入自變量。一般多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，和（95% CI：1.047，2.439）]是影響MPP 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 影響MPP發(fā)生危險(xiǎn)因素的多因素Logistic回歸分析參數(shù)

3 討論

MPP 好發(fā)于幼兒群體，與幼兒尚處于生長(zhǎng)發(fā)育階段，呼吸系統(tǒng)發(fā)育不成熟、免疫力低下有關(guān)[9]。引起幼兒發(fā)生肺炎的主要原因是病原體感染，肺炎支原體是較常見(jiàn)肺炎病原體微生物，長(zhǎng)期炎癥浸潤(rùn)可導(dǎo)致患兒血管內(nèi)皮損傷、炎性變態(tài)反應(yīng)及凝血系統(tǒng)異常，若未及時(shí)就醫(yī)或治療效果差，極有可能發(fā)展為重癥肺炎，嚴(yán)重影響患兒生命健康。探究MPP 發(fā)病機(jī)制有利于針對(duì)性治療MPP 患兒。

TIPE2 屬于TNFAIP8 家族一員，是一種新的先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)控因子，通過(guò)與Caspase-8 結(jié)合抑制激活蛋白-1 和核因子κB 的活性，促進(jìn)脂肪酸合成酶Fas 誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞凋亡[10-11]。本研究結(jié)果顯示，MPP 患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2 水平明顯低于對(duì)照組兒童，且急性發(fā)作期MPP 患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2 水平明顯低于恢復(fù)期患兒，表明TIPE2 水平可能反映MPP 的發(fā)生、發(fā)展，其具體分子機(jī)制尚不清楚。SHI 等[12]報(bào)道稱，TIPE2 不僅能維持免疫穩(wěn)態(tài)，而且能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，TIPE2 受T 細(xì)胞受體和Toll 樣受體的激活作用，調(diào)控其下游靶信號(hào)通路，通過(guò)調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞活性及功能參與哮喘的發(fā)病機(jī)制。ZHANG 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，支原體肺炎感染患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2 mRNA表達(dá)明顯降低，且與患者感染嚴(yán)重程度有關(guān)；進(jìn)一步體外研究發(fā)現(xiàn)，TIPE2 通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路，負(fù)調(diào)控肺炎支原體感染誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子水平，進(jìn)而參與MPP 的發(fā)生、發(fā)展，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，MPP 患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2 與IL-17 等炎癥因子呈負(fù)相關(guān)，提示TIPE2 可能通過(guò)調(diào)控炎癥信號(hào)通路參與MPP 的發(fā)生機(jī)制，其具體作用方式有待更深入研究。

Th17 細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的一類CD4+T 細(xì)胞亞群，由于該細(xì)胞亞群可特異性分泌IL-17 而被命名為Th17 細(xì)胞。有研究證實(shí)，Th17 細(xì)胞具有較強(qiáng)的促炎作用，由IL-6 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 共同誘導(dǎo)Th 細(xì)胞分化而來(lái)[14-15]。多項(xiàng)研究顯示，IL-17 可參與多種自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、關(guān)節(jié)炎等[16-17]。Treg 是一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的T 細(xì)胞亞群。ROMANO 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Treg 通過(guò)分泌細(xì)胞介質(zhì)抑制T 細(xì)胞及抗原傳遞功能，并降低炎癥細(xì)胞因子及抗體水平來(lái)發(fā)揮免疫效應(yīng)。國(guó)內(nèi)有學(xué)者報(bào)道，MPP 患兒外周血Th17 細(xì)胞增多，Treg 細(xì)胞減少，Th17/Treg 比例失衡，且兩者各自分泌的細(xì)胞因子表達(dá)異常，可能在MPP 發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[19]，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，MPP 患兒外周血Th17 升高，Treg 降低，Th17/Treg 比值升高，表明MPP 患兒病情發(fā)生、發(fā)展與免疫細(xì)胞代謝紊亂、穩(wěn)態(tài)失衡有關(guān)。Treg 細(xì)胞是維持自我耐受，防止過(guò)度炎癥和自身免疫性疾病所必需的[19]。LI 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3 是Treg 細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，對(duì)Treg 的生長(zhǎng)分化及功能完善起至關(guān)重要的作用，F(xiàn)OXP3基因缺失小鼠常伴隨致命的自身免疫疾病、腸道病變、皮屑病等。由此可知，Th17 細(xì)胞與Treg 細(xì)胞相互作用、相互制約，共同維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，若Th17/Treg 平衡被打破，則可能發(fā)生炎癥因子浸潤(rùn)，機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)，這可能是MPP 發(fā)生的分子機(jī)制之一。

本研究通過(guò)檢測(cè)MPP 患兒肺功能指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，急性發(fā)作組MPP 患兒FEV1、FVC、PEF 均明顯低于恢復(fù)組患兒，表明MPP 患兒肺功能異常，出現(xiàn)阻塞性通氣障礙。CRP、PCT 是診斷MPP 的常用指標(biāo)，當(dāng)機(jī)體被感染時(shí)，CRP 作為急性期蛋白具有較高的敏感性，CRP、PCT 在短時(shí)間內(nèi)迅速上升[21]。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TIPE2 與Th17、Th17/Treg、CRP、PCT 呈負(fù)相關(guān)，與Treg、IL-35、FEV1、FVC、PEF 呈正相關(guān)，表明TIPE2 可能反映MPP 患兒肺功能狀況，其水平變化與MPP 患兒免疫狀態(tài)、病情嚴(yán)重程度有關(guān)。一般多因素Logistic 回歸分析結(jié)果顯示，TIPE2、Th17/Treg、IL-17 是影響MPP 發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明TIPE2 水平降低、Th17/Treg 失衡加大MPP發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，MPP 患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞TIPE2水平明顯低于健康兒童，急性發(fā)作期患兒TIPE2 水平低于恢復(fù)期，Th17 增加，Treg 減少，Th17/Treg平衡被破壞，其水平變化與MPP 患兒肺功能有關(guān)，可能作為MPP 發(fā)生的潛在生物學(xué)指標(biāo)。本研究在觀察指標(biāo)及研究對(duì)象上尚存不足，如觀察對(duì)象較少導(dǎo)致結(jié)果可能發(fā)生偏倚，未考慮到不同病情程度患兒各項(xiàng)指標(biāo)的變化，同時(shí)還需在下一步研究中擴(kuò)大研究范圍，隨訪分析患兒治療前后各因子水平的變化，為臨床治療提供依據(jù)。