楊青青,王智榮,彭林,陳巧莉,聞樂嫣,郭澤航,闞建全*
1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(重慶),重慶,400715) 3(中匈食品科學(xué)合作研究中心,重慶,400715)
花椒具有獨特的香味和口感,在中國烹飪和食品加工業(yè)中被廣泛用于辛辣調(diào)味。青花椒(ZanthoxylumschinifoliumSieb.et Zucc.)這一品種氣味清香,且麻味濃厚,相比于紅花椒更受消費者的喜愛[1]。青花椒中主要有揮發(fā)油、氨基酸、香豆素、酰胺類化合物等化學(xué)成分,具有較高的營養(yǎng)價值及功能價值[2]?;ń分谢瘜W(xué)成分的含量和組成很大程度上取決于花椒自身品種和產(chǎn)地環(huán)境[3-4]。青花椒主產(chǎn)于重慶江津和四川金陽兩地,這2種青花椒在市場上廣受歡迎。但由于兩地的地理、氣候條件有所不同,可能會導(dǎo)致青花椒中化學(xué)成分的組成及含量存在差異,進而影響其風(fēng)味和功能價值。
目前,國內(nèi)外大量的研究均關(guān)注于青花椒的揮發(fā)油成分及其香氣特征,對于不同產(chǎn)地青花椒中的揮發(fā)油成分的研究已較為成熟[5-6]。除此之外,青花椒中的類黃酮、酰胺類、氨基酸等非揮發(fā)性物質(zhì)在其滋味、藥用價值上起著關(guān)鍵作用,同樣極具研究和開發(fā)價值。但目前對青花椒中非揮發(fā)性成分的研究通常存在多指標(biāo)檢測操作繁雜、測定結(jié)果籠統(tǒng)而不能體現(xiàn)其具體成分、缺乏深度等缺點。近年來興起的代謝組學(xué)技術(shù)為解決這一問題提供了新思路,其中非靶向代謝組學(xué)可對一定生理狀態(tài)或特定條件下的樣本中所有代謝物進行綜合全面、無偏性的高覆蓋檢測,可尋找和鑒定出不同樣品的差異代謝物,從而實現(xiàn)代謝特征的比較[7],為精確完整地分析不同產(chǎn)地的青花椒非揮發(fā)性成分提供了可行性。
因此,本研究采用基于超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbital trap high resolution mass spectrometry,UPLC-QE-Orbitrap-MS)的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對金陽和江津兩產(chǎn)地青花椒中非揮發(fā)性成分進行全面的鑒定,同時結(jié)合主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least square discriminant analysis,OPLS-DA)等多元統(tǒng)計分析方法對2種青花椒進行區(qū)分,并篩選得到化學(xué)標(biāo)記物,以期為青花椒精深加工提供理論基礎(chǔ),為今后青花椒的優(yōu)良種質(zhì)資源篩選、栽培管理等方面提供一定的參考依據(jù)。
青花椒,分別采自重慶江津和四川金陽。甲醇、乙腈、醋酸銨、氨水(均為色譜級),上海安譜實驗科技股份有限公司;L-2-氯苯丙氨酸(純度≥98%),上海恒柏生物科技有限公司。
Agilent 1290超高效液相色譜儀,美國安捷倫公司;Q Exactive Orbitrap高分辨質(zhì)譜,美國賽默飛世爾科技;JXFSTPRP-24研磨儀,上海凈信科技有限公司;VORTEX-5渦旋儀,其林貝爾儀器制造有限公司。
1.3.1 樣品前處理
2種青花椒各設(shè)置6個生物組重復(fù)。將青花椒用粉碎機粉碎后過40目篩,備用。
1.3.2 代謝物的提取
青花椒中代謝物的提取方法基于相關(guān)文獻方法[8]略做修改。稱取50 mg青花椒粉末加入至2 mL離心管中,加入1 000 μL提取液[V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=2∶2∶1]后渦旋30 s將其混勻;隨后于研磨儀中45 Hz處理4 min,在冰水浴中超聲5 min,重復(fù)上述研磨和超聲步驟3次;將得到的溶液靜置在-20 ℃中1 h。靜置后,4 ℃下13 000 r/min離心15 min,取上清液過0.22 μm濾膜,準(zhǔn)備上機檢測。
質(zhì)控(quality control,QC)樣本是通過將以上所有待測樣本等量混合而制得,在液質(zhì)檢測的過程中,每6~10個檢測分析樣本中插入一個QC樣本,與分析樣本的采用相同的檢測方法。QC樣本用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性,以監(jiān)測分析過程的重復(fù)性。通過對不同QC樣本的基峰離子流圖(basic peak ion current diagram,BPC)進行重疊展示分析,可以判斷代謝物提取和檢測的重復(fù)性以及儀器的穩(wěn)定性。對所有樣本和QC樣本進行PCA分析,通過觀察QC樣本間的離散度,可以得知儀器分析的穩(wěn)定性和可靠性。
1.3.3 UPLC-QE-Orbitrap-MS檢測條件
UPLC-QE-Orbitrap-MS檢測參考相關(guān)文獻并做一定的修改[9]。使用Agilent 1290超高效液相色譜儀以及Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)液相色譜柱。正離子模式(positive ion mode,PIM)下流動相A相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液,流動相B相為乙腈,采用梯度洗脫:0~1.0 min,1% B;1.0~8.0 min,1%~99% B;8.0~10.0 min,99% B;10.0~10.1 min,99%~1% B;10.1~12 min,1% B。;負(fù)離子模式(negative ion mode,NIM)下流動相A相為5 mmol/L醋酸銨水溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH值至9.0),流動相B相為乙腈;梯度洗脫條件同正離子模式;進樣體積為1 μL,流速為0.5 mL/min。
Thermo Q Exactive質(zhì)譜儀在控制軟件(Xcalibur,版本:4.0.27,Thermo)控制下進行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。MS參數(shù)條件為:電噴霧(electrospray Ionization,ESI)離子源;噴霧電壓為3 800 V(PIM)或-3 100 V(負(fù)離子模式);毛細(xì)管溫度為320 ℃,鞘氣流速為45 Arb;輔助氣流速為15 Arb;質(zhì)量掃描范圍為70~1 000m/z,一級分辨率為70 000,二級分辨率為17 500;分步碰撞能量的強度取值為3;分步碰撞能量依次為20、40和60 eV,掃描速率為7 Hz。
1.3.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析
首先,使用ProteoWizard軟件將經(jīng)質(zhì)譜分析后的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)成mzML格式;然后使用ChromaTOF軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析[10]。采用Compound Discover(2.0版,Thermo)和OSI-SMMS(1.0版,大連化學(xué)數(shù)據(jù)解決方案信息技術(shù)公司),與MassBank、HMDB、MoTo DB、METLIN及Mzcloud數(shù)據(jù)庫等進行物質(zhì)鑒定,再將質(zhì)控樣本中檢出率50%以下或RSD>30%的峰去除。使用SIMCA 14.1軟件進行PCA、OPLS-DA等多元統(tǒng)計分析。
2.1.1 PCA分析
PIM和NIM下2種青花椒樣本的BPC圖如圖1所示。所有樣品的儀器分析信號強、各個色譜峰分離效果較好。此外,檢測中插入的QC樣本的BPC圖可以很好地重疊,說明儀器具有較好的穩(wěn)定性,樣品處理以及檢測的重復(fù)性高,為后續(xù)青花椒代謝物分析結(jié)果的準(zhǔn)確性提供可行性。
2種青花椒非揮發(fā)性代謝物的PCA圖如圖2所示。2種模式下,PC1和PC2均已包含樣品中大部分的代謝物信息,可用于后續(xù)分析。同時,2組青花椒樣品以及QC樣本組的平行樣本均各自聚集在一起,因此組間具有較好的重復(fù)性,數(shù)據(jù)可信度較高。此外,2種青花椒在圖中都有著明顯的分離趨勢,能夠從總體上反應(yīng)出2組樣品之間的代謝物差異。
2.1.2 OPLS-DA分析
PCA分析對相關(guān)性較小的變量不敏感,而OPLS-DA是一種監(jiān)督模型,能以最大程度地分離樣品更有利于尋找差異代謝物。如圖3所示,各組樣本的重復(fù)點相距較近,且分別聚成一類,表明數(shù)據(jù)重復(fù)性好;同時,2個樣品各居一側(cè),區(qū)分效果非常明顯。此外,NIM模式下R2Y = 0.997,Q2Y = 0.912,PIM模式下R2Y = 0.994,Q2Y = 0.970,表示該模型的解釋度和預(yù)測度良好。為避免出現(xiàn)過擬合的情況,采用了置換檢驗法對OPLS-DA在無差異情況下的建模效果進行了考察(圖3)。2種模式下R2Y′和Q2′均小于原始模型的R2Y和Q2,則說明模型有意義,不存在過擬合現(xiàn)象,都符合樣本數(shù)據(jù)的真實情況,具有良好的預(yù)測能力。后續(xù)可根據(jù)計算得出的變量重要性投影(variable importance inproject,VIP)值分析篩選其差異代謝物,VIP>1表示該代謝物對OPLS-DA模型中樣品組的分離起了重要作用[11],VIP值越大表示該物質(zhì)在區(qū)分兩樣本中的作用越關(guān)鍵。
a-PIM下的江津青花椒樣本;b-PIM下的金陽青花椒樣本;c-PIM下的QC樣本; d-NIM下的江津青花椒樣本;e-NIM下的金陽青花椒樣本;f-NIM下的QC樣本圖1 兩種模式下江津青花椒、金陽青花椒和質(zhì)控樣本的基峰離子流圖Fig.1 BPC chromatogram of Jiangjin Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc., Jinyang Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.and QC samples in two modes
a-正離子模式;b-負(fù)離子模式圖2 兩種離子模式下2組樣品及質(zhì)控的PCA結(jié)果Fig.2 PCA results of two groups of samples and quality control in two modes 注:Ck-金陽青花椒;Test-江津青花椒(下同)
a-正離子模式模型得分圖;b-正離子模式模型驗證圖; c-負(fù)離子模式模型得分圖;d-負(fù)離子模式模型驗證圖圖3 兩種離子模式下兩組樣品的OPLS-DA模型得分圖與模型驗證圖Fig.3 Scatter diagram of OPLS-DA model score and model verification of two groups in two modes
2.2.1 非揮發(fā)性差異代謝物的篩選與分析
設(shè)定2種青花椒中非揮發(fā)性差異代謝物的初步篩選條件為P<0.05,VIP>1,經(jīng)篩選共得到74種主要的非揮發(fā)性差異代謝物(表1)。為簡單、直觀地表現(xiàn)出代謝物的變化情況,以及顯示2種青花椒之間的總體模式特征,對這74種差異代謝物繪制了聚類熱圖(圖4)。在所有非揮發(fā)性差異代謝物中,總體上氨基酸類物質(zhì)在江津青花椒中呈上調(diào)表達,糖類、有機酸類以及類黃酮大多在金陽青花椒中呈上調(diào)表達。造成2種青花椒中化學(xué)成分差異的因素可能與生長環(huán)境息息相關(guān),例如氣候、土壤條件、海拔高度等。
圖4 兩種青花椒中差異代謝物熱圖Fig.4 The heat map of differential metabolite in two Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.
花椒中氨基酸的組成和含量是營養(yǎng)質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo),同時在呈味上也起著重要作用。由表1可知,氨基酸類化合物在江津青花椒中總體呈上調(diào)表達。2個樣本中的氨基酸呈現(xiàn)差異可能與土質(zhì)有關(guān),江津青花椒多栽植于山坡地,山地的土質(zhì)條件較好,營養(yǎng)豐富,更有利于青花椒中氨基酸的合成[12]。此外,重金屬元素同樣也能誘導(dǎo)植物體內(nèi)氨基酸的大量積累[13]。江津土壤中的硒含量非常豐富,但這種土壤中往往也會伴隨著重金屬元素的存在[14]。多項研究表明,相較于我國土壤中重金屬含量的背景值,江津表層土壤中會含有更多的重金屬元素,尤其是Cd元素[15-16],因此江津青花椒在生長過程中可能會面對更多的重金屬脅迫。在此情況下,植物體內(nèi)會增強脯氨酸合成酶的活性,或者抑制脯氨酸的氧化來應(yīng)對重金屬脅迫[17],因而在江津青花椒中脯氨酸會更多地積累。同樣地,有研究表明在江津青花椒中呈上調(diào)表達的組氨酸也在植物抵御重金屬脅迫上起著重要作用[18]。綜上,2種青花椒中的氨基酸類成分呈現(xiàn)較大差異有可能與土質(zhì)條件和重金屬脅迫有關(guān)。
除氨基酸外,糖類、有機酸類及多酚黃酮類均在金陽青花椒中呈上調(diào)表達,這可能與兩地的光照和濕度有著緊密聯(lián)系。首先,花椒中的糖類成分主要存在于花椒果皮中,具有一定的營養(yǎng)價值,不可忽視[19]。有研究表明植物中糖類含量的變化可能是由于環(huán)境脅迫引起的,例如糖含量會因水分脅迫而增加[20],從而對滲透脅迫起到抵御作用。例如在干燥條件下,植物中的海藻糖會表現(xiàn)出極強的水合能力,可以取代生物分子表面的結(jié)合水,從而加強了蛋白質(zhì)和生物膜的穩(wěn)定性來抵御干旱脅迫[21]。同時,海藻糖中的羥基與蛋白質(zhì)的極性基團和膜的磷酸基團之間還可形成氫鍵,以此來維持細(xì)胞膜在極端條件下的穩(wěn)態(tài)[22]。此外,如蔗糖、葡萄糖這種常見的可溶性糖在應(yīng)對水分脅迫時也起到了關(guān)鍵作用,其可以增大細(xì)胞的溶質(zhì)濃度,改善細(xì)胞的吸水能力[23]。金陽干燥的氣候可能會使青花椒更易受到水分脅迫,從而導(dǎo)致會糖類成分的大量積累。
同樣地,有機酸是一種代謝活性溶質(zhì),在植物體內(nèi)參與滲透壓的調(diào)節(jié)和陽離子的平衡,因此水分脅迫也會促進有機酸的合成[24]。除了植物中常見的蘋果酸、莽草酸外,脫落酸的積累也在抗旱性中起著關(guān)鍵作用,它可以通過減少植物的蒸騰作用、穩(wěn)定生物膜以及改變植物體內(nèi)代謝來達到抗旱的目的[25]。同時,有機酸作為一種光合作用的中間體[26],金陽長時間的日照便會導(dǎo)致有機酸在青花椒中的高度積累。
此外,由表1可得青花椒中的多酚黃酮類物質(zhì)豐富,且大部分是在金陽青花椒中呈上調(diào)表達。多酚黃酮類化合物屬于植物的次生代謝產(chǎn)物,大多數(shù)通常是由于植物應(yīng)對生物和非生物脅迫而合成的。有研究表明水分脅迫會誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生氧化脅迫,例如蘆丁、槲皮苷、橙皮素等黃酮類化合物都具有較強的抗氧化活性,因而大量積累后可增強植物的氧化應(yīng)激,從而增加其抗旱性能[27-28]。同時,由于金陽紫外線強度高,在高光照強度下編碼多酚黃酮類化合物生物合成的結(jié)構(gòu)基因的表達和某些重要酶的活性會增加,因此多酚黃酮類化合物的含量也會隨之增加[29]。
表1 兩種青花椒中的非揮發(fā)性差異代謝物Table 1 Differential metabolites in two Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.
花椒果實中含量較高的肌苷、鳥苷在金陽青花椒中也呈現(xiàn)上調(diào)表達,這些物質(zhì)具有增強免疫、延緩衰老等重要的生理活性[30]。鳥苷和肌苷的合成受激酶或核苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的催化,該途徑的激活和調(diào)節(jié)同樣也會受到水分脅迫的影響[31]。總的來說,江津雨量充沛,濕潤多陰,而金陽日照時間長,紫外強度高,空氣干燥,兩地的氣候原因可能導(dǎo)致了2種青花椒中糖類成分、有機酸、多酚類黃酮等成分呈現(xiàn)出較大的差異。
2.2.2 化學(xué)標(biāo)記物的篩選
為尋找植物中的內(nèi)源性化學(xué)標(biāo)記物,經(jīng)大量的研究目前已形成了系統(tǒng)的代謝組學(xué)策略,通過PCA和OPLS-DA來進行篩選和驗證[32],已成功應(yīng)用于對不同地理來源的苦艾草[33]、芹菜[34]、甘藍(lán)[35]等的差異研究。為進一步確定引起2種青花椒差異的關(guān)鍵物質(zhì),參考基于代謝組學(xué)方法區(qū)分2種地理來源的生姜的研究[36],從2種青花椒的74種非揮發(fā)性差異代謝物中,根據(jù)VIP>2、2組間的倍數(shù)變化差異(fold change,F(xiàn)C)>3和P<0.001(獨立樣本T檢驗)的條件繼續(xù)篩選出了9種具有極顯著差異的化合物,作為區(qū)分江津青花椒和金陽青花椒的特征性化學(xué)標(biāo)記物,分別是羥基-α-山椒素、蔗糖、海藻糖、棉籽糖、奎尼酸、莽草酸、2-異丙基蘋果酸、L-精氨酸、L-賴氨酸。為了更直觀地了解化學(xué)標(biāo)記物,使用箱形圖比較來自2個產(chǎn)地的青花椒樣品中這9種物質(zhì)的含量豐度差異(圖5)。特征性標(biāo)記物的鑒定為今后開發(fā)快速、針對性和低成本的診斷性生物標(biāo)記物分析方法奠定了理論基礎(chǔ),可應(yīng)用于青花椒的育種或質(zhì)量評估分析。
圖5 兩種青花椒中9種化學(xué)標(biāo)記物的相對含量豐度Fig.5 Relative peak intensities of.nine chemical markers in two Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.
采用基于UPLC-QE-Orbitrap-MS的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)對2種青花椒的非揮發(fā)性成分進行鑒定分析,無監(jiān)督的PCA分析以及OPLS-DA模型分析實現(xiàn)了對2種產(chǎn)地青花椒的明顯區(qū)分,說明代謝組技術(shù)可作為一種區(qū)分金陽青花椒和江津青花椒的有效手段。
2種青花椒中存在74種差異代謝物,包括有生物堿類、有機酸類、糖類、多酚黃酮類、酰胺類、香豆素類、氨基酸類等成分。從總體上看,氨基酸類成分在江津青花椒中呈上調(diào)表達,而有機酸類、糖類、多酚黃酮類等在金陽青花椒中呈上調(diào)表達,同時提出了2種青花椒中非揮發(fā)性成分差異的可能發(fā)生機制。此外,經(jīng)進一步篩選確認(rèn)了2個產(chǎn)地青花椒中具有極顯著差異的物質(zhì),分別是羥基-α-山椒素、蔗糖、海藻糖、棉子糖、奎尼酸、莽草酸、2-異丙基蘋果酸、L-精氨酸、L-賴氨酸,可作為區(qū)分這2種青花椒的特征性化學(xué)標(biāo)記物。
綜上,本研究通過代謝組學(xué)技術(shù)可以對青花椒中非揮發(fā)性成分進行全覆蓋、無偏性的分析,從而能成功地對2種產(chǎn)地的青花椒進行區(qū)分,為今后青花椒的精深加工以及育種提供了參考方向。