IL-12B基因啟動子區(qū)異常甲基化與卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)性研究

趙 瑋，李 琰，郝雅麗，張海波，康 山*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院預(yù)防保健處，河北 石家莊 050011;2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所分子生物學(xué)研究室，河北 石家莊 050011;3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖科，河北 石家莊 050011;4.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科，河北 石家莊050011)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是一種常見的婦科良性疾病，該病影響著全球約1.5億以上的婦女，是指具有活性的子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))出現(xiàn)在子宮體以外的部位，并在該部位種植、生長。異位內(nèi)膜組織可以侵犯全身任何部位，其中以卵巢和宮骶韌帶最常見。EMs的主要癥狀包括痛經(jīng)、不孕、性交不適等。EMs雖然是一種良性疾病，卻有類似惡性腫瘤的生物學(xué)行為如：種植、侵襲和遠處轉(zhuǎn)移等。迄今為止，EMs的發(fā)病機制尚不明確。近年來的研究發(fā)現(xiàn)DNA啟動子區(qū)的異常甲基化導(dǎo)致的相關(guān)基因的異常表達在EMs的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。本課題組應(yīng)用Illumina Human Methylation 450K甲基化芯片首次比較分析了6例卵巢EMs患者異位內(nèi)膜組織和6例對照婦女正常子宮內(nèi)膜組織的DNA甲基化狀態(tài)[1]。其中白細胞介素12B(interleukin-12B,IL-12B)基因啟動子區(qū)CpG島甲基化水平在異位內(nèi)膜組織和對照組婦女正常內(nèi)膜組織中存在顯著差異。因此，在本研究中擴大樣本量應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)進一步分析驗證卵巢EMs患者的異位內(nèi)膜和對照婦女正常子宮內(nèi)膜組織中IL-12B基因啟動子區(qū)甲基化水平及mRNA表達水平的差異，以期進一步明確IL-12B基因表觀遺傳學(xué)改變在卵巢EMs發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究共納入50例卵巢EMs患者和44例因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級(CINⅢ)行全子宮切除的患者(對照組)。所有研究對象均來自2014年10月—2016年5月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科行腹腔鏡和開腹手術(shù)治療的患者。所有卵巢EMs患者均經(jīng)手術(shù)證實EMs Ⅲ期或Ⅳ期，且均經(jīng)術(shù)后病理證實為卵巢EMs，年齡29～50歲，平均(39.76±6.47)歲。取其異位卵巢巧克力囊腫的囊壁組織為異位內(nèi)膜組。對照組年齡29～50歲，平均(40.30±6.24)歲，取其子宮內(nèi)膜組織為正常內(nèi)膜組，所有內(nèi)膜組織均經(jīng)病理證實為正常內(nèi)膜。兩組手術(shù)時期均為月經(jīng)周期的分泌期(依據(jù)末次月經(jīng)時間及病理特征所見)。兩組均為育齡期女性，術(shù)前6個月未服用激素類藥物，均未合并子宮內(nèi)膜病變、內(nèi)分泌疾病、自身免疫性疾病及其他卵巢良惡性腫瘤等。標本取自患者術(shù)中的無菌離體組織，并迅速浸泡在盛有0.8 mL RNA later液的凍存管中，于4 ℃冰箱中過夜后置于-20 ℃冰箱里低溫長期保存。

標本及病例資料收集均經(jīng)患者及家屬知情同意，并獲醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2組織RNA的提取和實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR) 異位內(nèi)膜組和正常內(nèi)膜組IL-12B RNA應(yīng)用Trizol試劑盒提取。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。應(yīng)用QIAGEN生物技術(shù)公司的QuantiNova TMSYBR Green PCR試劑盒進行qRT-PCR反應(yīng)技術(shù)檢測組織中IL-12B基因mRNA的表達水平。IL-12B基因上下游引物分別為5′-CCCTGACATTCTGCG-TTCA-3′和5′-AGGTCTTGTCCGTGAAGACTC-TA-3′。內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上下游引物分別為5′-ACCACAGTC-CATGCCATCAC-3′和5′-TCCACCACCCTGTT-GCTGTA-3′。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共40個循環(huán)。所有溶解曲線均為單峰。 mRNA 表達量計算公式：2-△△CT，△CT=CT(目的基因)- CT(管家基因)。

1.3組織DNA 提取及甲基化水平的檢測 異位內(nèi)膜組和對照內(nèi)膜組IL-12B DNA采用美國Promega公司的Wizard Genomic DNA純化試劑盒提取DNA。應(yīng)用Nanodrop 2000檢測所提取DNA的濃度及純度。當標本A260 nm/A280 nm的比值在1.8～2.0時表示合格。采用焦磷酸測序技術(shù)(北京昂立信生物科技有限公司)檢測所有組織DNA標本IL-12B基因啟動子區(qū)的甲基化水平。引物由PyroMark Assay Design Software 2.0(Hua Da,Shen Zhen,China)設(shè)計見表1。應(yīng)用Pyrodequencing檢測儀(PyroMark Q96 ID，QIAGEN)進行甲基化特異性PCR，Pyro Q-CpG軟件分析9個CpG位點(CpG1-9)的甲基化狀態(tài)。CpG1位于轉(zhuǎn)錄起始位點(transcription start site，TSS)上游95 bp，CpG2-9位于TSS上游1 444 bp到1 499 bp。

表1 焦磷酸測序中的PCR擴增引物序列Table 1 Primer sequences for pyrosequencing

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0軟件包處理數(shù)據(jù)。 計量資料比較采用Wilcoxon秩和檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析IL-12B基因啟動子區(qū)甲基化與其mRNA表達水平的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1IL-12B基因啟動子區(qū)在異位內(nèi)膜組織和正常內(nèi)膜組織中的甲基化狀態(tài) IL-12B基因啟動子區(qū)的CpG1位點的甲基化水平在異位內(nèi)膜組織和正常內(nèi)膜組織中分別為52.060 (5.718)和62.640 (6.438)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-7.547，P<0.001)。CpG2-9位點的甲基化水平在異位內(nèi)膜組織和正常內(nèi)膜組織中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 異位內(nèi)膜組織和正常內(nèi)膜組織中IL-12B 基因啟動子區(qū)CpG2-9位點的甲基化水平Table 2 Methylation levels of CPG2-9 in the IL-12B gene promoter region in ectopic and normal endometrium tissues [M(QR)]

2.2異位內(nèi)膜組織和正常內(nèi)膜組織中IL-12B基因mRNA的表達水平 異位內(nèi)膜組織和正常內(nèi)膜組織中IL-12B基因mRNA的表達水平分別為22.639 (392.693)和0.975 (2.992)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=6.054，P<0.001)。

2.3相關(guān)性分析 采用Spearman相關(guān)系數(shù)分析，IL-12B基因啟動子區(qū)的甲基化水平與其mRNA的表達水平在統(tǒng)計學(xué)上存在明顯負相關(guān)性(r=-0.510，P<0.001)。

3 討 論

DNA甲基化是真核生物調(diào)控基因表達的主要表觀遺傳學(xué)修飾方式，發(fā)生在啟動子區(qū)的DNA甲基化可以直接阻止轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合，也可以通過改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)從而調(diào)控基因的表達[2]。DNA甲基化具有可遺傳的、可逆的、動態(tài)的特點，不僅可以建立特定的細胞狀態(tài)，還可以對微環(huán)境的變化作出反應(yīng)，從而賦予細胞可塑性。這種變化可以在不同的生物液體中檢測到，如血液、尿液和糞便樣本[3]。在表觀遺傳修飾檢測中，基于DNA甲基化檢測是第一個被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的結(jié)腸直腸癌篩查試驗[4]，這表明甲基化分析可以作為一種無基因檢測手段在臨床實施，將其應(yīng)用于不同疾病類型的臨床篩查試驗。既往的研究發(fā)現(xiàn)包括EMs在內(nèi)的許多人類疾病與基因啟動子區(qū)的異常甲基化狀態(tài)有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)[5]、雌激素受體β(estrogen receptor β，ERβ)[6]、孕酮受體B(progesterone receptor B，PGR)[7]、Twist[8]，谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶M1(Glutathione S-transferase M1，GSTM1)[9]等基因啟動子區(qū)的異常甲基化狀態(tài)均被證實在EMs的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果也顯示，與正常內(nèi)膜組織相比，卵巢EMs患者異位內(nèi)膜組織中IL-12B基因啟動子區(qū)呈現(xiàn)明顯的低甲基化狀態(tài)。而其mRNA的表達水平則明顯高于正常內(nèi)膜組織的表達水平，且IL-12B基因mRNA的表達水平與IL-12B基因啟動子區(qū)的甲基化水平呈明顯負相關(guān)性。

IL-12B基因編碼IL-12p40亞基，IL-12p40亞基是IL-12和IL-23的組成部分。IL-12p40和IL-12p35亞基通過二硫鍵組成的具有異源二聚體結(jié)構(gòu)的IL-12[10]。IL-12是連接先天性免疫和獲得性免疫的重要的橋梁分子，是機體抵御病毒和病原微生物的關(guān)鍵細胞因子，促進原始T淋巴細胞向Th1細胞轉(zhuǎn)化，增強細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell，CTL)和自然殺傷細胞(natural killer，NK)的活性，被認為最強的NK細胞激活因子。在惡性黑色素瘤[11]、乳腺癌[12]、肺癌[13]和肝癌[14]中均被證實有明顯抑制腫瘤細胞生長的作用。游離的IL-12p40亞基被認為是IL-12的一個天然拮抗劑，IL-12p40的同源二聚體能夠與IL-12競爭結(jié)合IL-12R進而抑制IL-12的功能[15]。已有研究表明IL-12通過激活NK細胞的活性參與了EMs的初級防御，從而抑制子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。Somigliana等[16]將IL-12注入C57BL/6和BALB/c EMs小鼠模型的腹腔內(nèi)，發(fā)現(xiàn)異位病灶的面積和重量會顯著減少，說明IL-12在活體內(nèi)能夠抑制EMs的發(fā)展。而Itoh等[17]則進一步證實，IL-12可以通過激活NK細胞的活性進而抑制腹腔內(nèi)異位病灶的發(fā)展。然而，目前關(guān)于EMs患者腹腔液中IL-12表達水平的研究結(jié)果不盡相同。研究顯示，與正常對照者比較，EMs患者腹腔液中IL-12的含量明顯降低[18-19]。而Singh等[20]和魏靜波等[21]卻得出了完全相反的研究結(jié)果。但是，Mazzeo等[22]研究認為腹腔液中IL-12的濃度在EMs組和對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而EMs患者腹腔液中游離IL-12p40的濃度卻明顯高于對照組。而且EMs的嚴重程度與IL-12+游離IL-12p40/IL-12的比值呈正比。IL-12能夠增強NK細胞對子宮內(nèi)膜細胞的清除能力，而IL-12p40通過競爭結(jié)合NK細胞上的IL-12R抑制NK細胞的細胞毒作用，從而增加子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病風(fēng)險。梁華等[23]也認為腹腔液中IL-12p40水平的增高與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，IL-12B基因啟動子區(qū)甲基化水平及mRNA表達水平在異位內(nèi)膜組織和正常內(nèi)膜組織之間存在明顯的差異。并且IL-12B基因啟動子區(qū)甲基化水平和mRNA表達水平之間存在明顯的負相關(guān)性，mRNA表達水平的差異可能進一步影響IL-12p40蛋白的表達水平，從而導(dǎo)致了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。該結(jié)果與前期甲基化芯片篩查的結(jié)果一致。同時，應(yīng)用Jaspar軟件(http://jaspar.genereg.net/)分析發(fā)現(xiàn)IL-12B基因啟動子區(qū)甲基化位點CpG1(cg18307303)處可能存在一個轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結(jié)合位點。該位點的甲基化水平的改變可能會影響Sp1與啟動子區(qū)的結(jié)合，進而影響IL-12B基因mRNA的表達水平。因此，認為IL-12B基因啟動子區(qū)異常甲基化水平可能是通過影響其mRNA表達水平而在卵巢EMs的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。在今后的研究中，將進一步明確異位內(nèi)膜組織和正常內(nèi)膜組織及腹腔液中IL-12p40蛋白的表達水平。

本研究存在一定的局限性。課題選取因CINⅢ而行開腹或腹腔鏡下行全子宮切除術(shù)的患者，雖然所有內(nèi)膜組織均經(jīng)病理證實為正常子宮內(nèi)膜，但是CINⅢ是否對基因啟動子區(qū)的甲基化水平有影響還未見報道。在以后的研究中尚需進一步來分析其影響。

綜上所述，異位內(nèi)膜組織中IL-12B基因啟動子區(qū)的低甲基化水平可能通過上調(diào)其mRNA的表達水平，進而引起IL-12p40蛋白表達增加，從而增加了婦女患卵巢EMs的風(fēng)險。本研究也進一步證明了EMs可能是一種表觀遺傳學(xué)疾病。尋找EMs甲基化差異基因有助于在分子水平上揭示其發(fā)病機制，為EMs的治療提供新的靶點。