茉莉酸甲酯處理對(duì)‘黑比諾’葡萄果皮酚類物質(zhì)及其抗氧化活性的影響

孫永蓉，宮鵬飛，李蔚，姚靜，宋菲紅，韓舜愈*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州，730070) 3(甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州，730070)

黑比諾屬歐亞種葡萄品種，具有早熟、果皮薄、色淡、產(chǎn)量低等特點(diǎn)，甘肅武威地區(qū)是種植黑比諾面積最大的產(chǎn)區(qū)，其中，莫高是該地區(qū)內(nèi)最具代表性的釀酒葡萄種植基地[1]。黑比諾對(duì)于種植環(huán)境要求較為苛刻，在炎熱的氣候下，由于該品種皮薄且果穗接合緊密，其對(duì)光強(qiáng)度耐受性不足，果粒之間易潮濕，易出現(xiàn)真菌和霉菌腐爛現(xiàn)象，造成大量減產(chǎn)[2]。

葡萄中酚類化合物種類繁多，均具有一個(gè)或多個(gè)羥基苯環(huán)的共同結(jié)構(gòu)，其不僅賦予果實(shí)特殊色澤和風(fēng)味，而且具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能有效清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，保護(hù)機(jī)體生物大分子[3]。此外，酚類化合物作為植物代謝過程中重要的次生代謝產(chǎn)物[4]，能夠介導(dǎo)植物防御不同的生物和非生物脅迫，進(jìn)而改善果實(shí)品質(zhì)。

茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)是茉莉酸的一種衍生物，存在于多種植物組織中，主要起到信號(hào)調(diào)節(jié)作用，可以調(diào)控植物次生代謝，激活多種防御基因的表達(dá)，提高植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抗性[5]。目前，已有研究表明MeJA在蘋果[6]和鮮食葡萄[7]中的應(yīng)用能夠提高果實(shí)酚類物質(zhì)的含量。此外，MeJA通過調(diào)節(jié)果蔬組織中苯丙烷代謝過程中相關(guān)的酶基因的表達(dá)，增強(qiáng)某些與抗氧化相關(guān)的酶的活性，進(jìn)而有效提高果蔬抗氧化能力[8]。近年來，MeJA也逐漸開始應(yīng)用于釀酒葡萄，據(jù)PORTU等[9]和ENCARNA等[10]研究表明，在釀酒葡萄中應(yīng)用MeJA會(huì)促進(jìn)果實(shí)中酚類物質(zhì)累積，主要包括總酚、黃酮醇和茋類，但葡萄品種和生長(zhǎng)時(shí)期的不同會(huì)導(dǎo)致果實(shí)中酚類物質(zhì)的種類和含量存在差異。

目前，關(guān)于MeJA處理對(duì)釀酒葡萄酚類物質(zhì)含量及其特性的研究報(bào)道較多[11-12]，但關(guān)于采前MeJA處理對(duì)不同生長(zhǎng)階段釀酒葡萄主要酚類物質(zhì)及抗氧化酶活性的報(bào)道研究較少，特別是對(duì)于黑比諾葡萄的研究未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以黑比諾為原料，通過在轉(zhuǎn)色初期及1周后對(duì)其進(jìn)行MeJA噴施處理，在不同時(shí)期采樣并分析果皮中總酚、總花色苷、總類黃酮和黃烷-3-醇含量的變化，明晰MeJA處理對(duì)葡萄不同生長(zhǎng)階段果實(shí)抗氧化能力和抗氧化酶活性的影響，為提高黑比諾葡萄果實(shí)中酚類物質(zhì)含量及其抗氧化特性以及釀造高品質(zhì)的黑比諾葡萄酒提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茉莉酸甲酯(MeJA)、DPPH、(+)-兒茶素、蘆丁、p-二甲基氨基肉桂醛[p-(dimethylamino)cinnamic aldehyde，p-DMACA],美國(guó)Sigma公司；吐溫-80，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；甲醇、三氯化鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、沒食子酸等均為分析純，成都市科隆化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-100E型超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；H2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DK-S12電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 田間試驗(yàn)

試驗(yàn)于2020年在甘肅莫高葡萄莊園園區(qū)進(jìn)行，該產(chǎn)區(qū)于2014年定植，年均降雨量為191 mm，年均日照時(shí)數(shù)為2 724.8 h，≥10 ℃的有效積溫在2 800～3 200 ℃。選取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的黑比諾釀酒葡萄，在轉(zhuǎn)色初期及1周后，對(duì)葡萄整株噴施MeJA，噴施濃度為1.0 mmol/L，5株葡萄1個(gè)平行，每株噴施量約為200 mL。MeJA用無水乙醇溶解后，用蒸餾水定容，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.0%，且加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的吐溫-80。以1.0%無水乙醇和0.1%吐溫-80的水溶液為對(duì)照[7]。具體采樣時(shí)期如表1所示。

表1 采樣時(shí)期Table 1 Sampling period

1.3.2 葡萄皮多酚類物質(zhì)提取

參照郭澤美等[13]的方法，并略作修改。準(zhǔn)確稱取1.50 g葡萄皮粉末，用15 mL酸化甲醇溶液[1 mol/L，V(HCl)∶V(甲醇)∶V(水)=1∶80∶19]，在100 W、25 ℃功率條件下超聲輔助提取30 min，然后8 000×g低溫離心15 min，收集上清液，合并提取液。

1.3.3 酚類物質(zhì)的測(cè)定

總酚采用福林-肖卡法[14]進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果以沒食子酸等價(jià)值表示(mg/g)。

總類黃酮采用NaNO2-AlCl3比色法[15]進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果以蘆丁等價(jià)值表示(mg/g)。

總黃烷-3-醇采用p-DMACA-鹽酸法[16]進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果以兒茶素等價(jià)值表示(mg/g)。

總花色苷采用pH示差法[17]進(jìn)行測(cè)定。將提取液用pH 1.0的緩沖液稀釋20倍。室溫平衡15 min后分別在521 nm處和700 nm處測(cè)定吸光度值。用同樣的方法測(cè)定樣品在pH 4.5緩沖溶液中的吸光度值，計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中：A=(A521nm-A700nm)pH 1.0-(A521nm-A700nm)pH 4.5；M(相對(duì)分子質(zhì)量)=493.2 g/mol(錦葵色素-3-葡萄糖苷)；DF為稀釋倍數(shù)；1 cm為光程;ε=28 000，摩爾吸光系數(shù)，L/(mol·cm)。

1.3.4 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.5 抗氧化酶活性測(cè)定

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性采用上海優(yōu)選生物科技有限公司SOD和CAT試劑盒進(jìn)行測(cè)定。取0.1 g 冷凍樣品，加入1 mL相對(duì)應(yīng)的提取液，4 ℃，8 000×g離心10 min，上清液即為粗酶液，用于SOD和CAT酶活性的測(cè)定。按試劑盒說明測(cè)定相應(yīng)的吸光度值，酶活性均以U/g FW表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用Excel 2007數(shù)據(jù)分析工具進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用SPSS 22.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性(最小顯著性差異法，P<0.05)分析。采用OriginPro 2018軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA處理對(duì)葡萄果皮中酚類物質(zhì)含量的影響

酚類化合物是葡萄果皮中重要的次生代謝產(chǎn)物，也是影響葡萄酒色澤、口感和香氣物質(zhì)釋放的重要因素[20]，主要通過苯丙烷代謝和類黃酮代謝途徑產(chǎn)生，具有重要的抗氧化活性。

由圖1-A和圖1-B可知，從T1到T6時(shí)期，MeJA處理的葡萄果皮中總酚和總類黃酮含量變化趨勢(shì)基本相同，分別在T2和T4時(shí)期出現(xiàn)峰值，且T4>T2，在T6時(shí)期，總酚和總類黃酮含量升至僅次于T4時(shí)期，分別為11.58和12.19 mg/g，與孫曉文[21]的研究結(jié)果相似。MeJA處理后，在成熟過程中‘圣誕玫瑰’葡萄果實(shí)總酚和總類黃酮含量提高，且出現(xiàn)了2次峰值。此外，與對(duì)照相比，在T6時(shí)期，MeJA處理的葡萄果皮中總酚和總類黃酮含量顯著高于對(duì)照54.44%和54.72%(P<0.05)。

由圖1-C可知，從T1到T6時(shí)期，MeJA處理的葡萄果皮中總花色苷含量持續(xù)上升，從T1時(shí)期的0.97 mg/g逐漸上升至T6時(shí)期的4.43 mg/g，而對(duì)照葡萄果皮中總花色苷含量從T1時(shí)期的0.89 mg/g先迅速上升至T5時(shí)期的3.38 mg/g，在T6時(shí)期輕微下降至3.36 mg/g。在T6時(shí)期，處理組葡萄果皮中的總花色苷顯著高于對(duì)照31.87%(P<0.05)，這與前人在Monastrell葡萄中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果基本一致[22]。

由圖1-D可知，隨著葡萄果實(shí)的成熟，對(duì)照和處理組果皮中總黃烷-3-醇含量均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。在T5時(shí)期降到最低(0.43和0.58 mg/g)后，又上升至T6時(shí)期(0.47和0.78 mg/g)，并且處理組葡萄果皮中總黃烷-3-醇的含量均高于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，除T2和T3時(shí)期外，MeJA處理的葡萄果皮中總黃烷-3-醇含量顯著高于對(duì)照(P<0.05)。RUIZ等[22]也觀察到MeJA在Monastrell中的應(yīng)用導(dǎo)致第二年葡萄中黃烷醇總量增加，但PORTU等[23]研究發(fā)現(xiàn)，將MeJA應(yīng)用于丹魄葡萄中，花色苷顯著增加，而黃烷醇含量沒有顯著性差異。這可能是由于氣候條件、品種和地理位置的不同而造成的。

綜上，MeJA處理可促進(jìn)葡萄果皮中總酚、總花色苷、總類黃酮和總黃烷-3-醇含量的積累，可能是由于MeJA誘導(dǎo)酚類化合物的相關(guān)合成酶(例如苯丙氨酸氨裂解酶，芪合酶，查爾酮合成酶或花色素苷合酶)[24]，從而提高黑比諾葡萄果皮中酚類物質(zhì)的含量，但具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

A-總酚；B-總類黃酮；C-總花色苷；D-總黃烷-3-醇圖1 MeJA處理對(duì)葡萄果皮中總酚、總類黃酮、總花色苷和總黃烷-3-醇含量的影響Fig.1 Effect of MeJA treatment on the contents of total phenols, total flavonoids， total anthocyanins and total flavan-3-ols in grape peel 注：不同小寫字母代表顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.2 MeJA處理對(duì)葡萄果皮中抗氧化能力的影響

2.2.1 MeJA處理對(duì)葡萄果皮中DPPH自由基清除率和鐵氰化鉀還原力的影響

酚類物質(zhì)在果蔬體內(nèi)含量豐富，具有較強(qiáng)的自由基清除能力，有研究表明，植物的抗氧化能力在很大程度上取決于其酚類物質(zhì)的種類和含量[25]。為了更全面地揭示酚類物質(zhì)的抗氧化效果，可采用多種方法來評(píng)價(jià)樣品的抗氧化能力。因此本研究采用了DPPH自由基清除率和鐵氰化鉀還原力方法系統(tǒng)評(píng)價(jià)了MeJA處理的葡萄果皮酚類提取物對(duì)自由基的清除能力(圖2)。

由圖2-A可知，隨著葡萄果實(shí)生長(zhǎng)期的推進(jìn)，對(duì)照和MeJA處理的葡萄果皮中DPPH自由基清除率均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，在T1至T4時(shí)期內(nèi)DPPH自由基清除率緩慢下降，T4至T6時(shí)期內(nèi)DPPH自由基清除率緩慢上升，在T6時(shí)期，對(duì)照和MeJA處理的葡萄果皮中DPPH自由基清除率分別為80.67%和82.07%。除T1和T2時(shí)期外，其他時(shí)期處理組葡萄果皮中DPPH自由基清除率高于對(duì)照組。

由圖2-B可知，葡萄果皮中鐵氰化鉀還原力的變化趨勢(shì)和總酚的類似，從T1到T6時(shí)期，處理組和對(duì)照組的葡萄果皮中鐵氰化鉀還原力動(dòng)態(tài)變化均有2個(gè)峰值，分別在T2和T4時(shí)期，在T6時(shí)期，MeJA處理組的葡萄果皮中鐵氰化鉀還原力上升至0.28，而對(duì)照組的葡萄果皮中鐵氰化鉀還原力下降至0.17。與對(duì)照組相比，處理葡萄果皮中鐵氰化鉀還原力隨著葡萄果實(shí)的成熟均顯著提高(P<0.05)。綜上，MeJA提高葡萄果皮中DPPH自由基清除率和鐵氰化鉀還原力。

A-DPPH自由基清除率；B-鐵氰化鉀還原力圖2 MeJA處理對(duì)葡萄果實(shí)中DPPH自由基清除率 和鐵氰化鉀還原力的影響Fig.2 Effect of MeJA treatment on the capacity of DPPH radical scavenging activity and potassium ferricyanide reducing power in grape peel

活性氧的積累，會(huì)使膜脂產(chǎn)生氧化作用，膜的功能產(chǎn)生變化，引起一系列生理生化作用的異常變化從而產(chǎn)生代謝紊亂，致使植物受到傷害[26]。因此，活性氧的有效清除對(duì)于提高葡萄果實(shí)抗氧化能力具有重要意義。

圖3 MeJA處理對(duì)葡萄果皮中和H2O2含量的影響Fig.3 Effect of MeJA treatment on the content of and H2O2 in grape peel

2.3 MeJA處理后葡萄果皮中酚類物質(zhì)含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析

表2 MeJA處理后葡萄果皮中酚類物質(zhì)含量與 抗氧化能力的相關(guān)性Table 2 Correlation analysis between the phenolic contents and antioxidant capacity of grape peel with MeJA treatment

2.4 MeJA處理對(duì)葡萄果皮中SOD和CAT酶活性的影響

A-SOD；B-CAT圖4 MeJA處理對(duì)葡萄果皮中SOD和CAT活性的影響Fig.4 Effect of MeJA treatment on the activity of SOD and CAT in grape peel

由圖4-A可知，從T1到T6時(shí)期，對(duì)照葡萄果皮中的SOD活性均小于處理組。2種處理葡萄果皮中SOD活性均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，分別從T1時(shí)期的399.28和459.78 U/g FW逐漸下降至77.10和132.59 U/g FW(T6)。在T6時(shí)期，與對(duì)照組相比，MeJA處理的葡萄果皮中SOD活性顯著提高了71.98%(P<0.05)。

由圖4-B可知，在葡萄生長(zhǎng)期間，MeJA處理后葡萄果皮中CAT活性從起始(T1)的17.84 U/g FW先迅速上升至T4時(shí)期的36.10 U/g FW，然后逐漸下降至21.02 U/g FW(T6)；而對(duì)照葡萄果皮中CAT活性從起始(T1)的15.22 U/g FW先上升至20.11 U/g FW(T2)，又下降至17.84 U/g FW(T3)，然后逐漸上升至26.02 U/g FW(T5)，最后下降至18.95 U/g FW(T6)。在T6時(shí)期，MeJA處理葡萄果皮中CAT活性比對(duì)照高10.92%。該結(jié)果與ZHANG等[30]研究結(jié)果基本一致，發(fā)現(xiàn)在葡萄上應(yīng)用MeJA，可誘導(dǎo)CAT和SOD活性提高，降低果實(shí)內(nèi)活性氧的積累。上述結(jié)果表明，MeJA處理可提高葡萄果皮中抗氧化酶活性，能夠有效清除過量活性氧，維持活性氧穩(wěn)態(tài)。

3 結(jié)論