段曉莉,江波,張濤
(江南大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)
阿魏酸(ferulic acid,F(xiàn)A)廣泛存在于植物細(xì)胞壁,與多糖、木質(zhì)素間以醚鍵或酯鍵形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1],以增強(qiáng)細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度與完整性,同時(shí)降低生物分解率[2]。FA是公認(rèn)安全的抗氧化劑,在歐洲國(guó)家已被列入食品添加劑。此外,研究表明,F(xiàn)A具有紫外吸收、抗菌消炎、防癌降脂等生物活性,在醫(yī)藥、化妝、造紙等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景[3]。目前,生產(chǎn)阿魏酸方法有植物提取法、化學(xué)合成法和生物酶法。植物提取法通過(guò)酸堿水解的方式破壞植物內(nèi)其他高價(jià)值化學(xué)成分,同時(shí)副產(chǎn)物增多,產(chǎn)物分離困難,因此能耗大,污染環(huán)境?;瘜W(xué)合成法通過(guò)有機(jī)反應(yīng)合成FA,但反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),環(huán)境污染嚴(yán)重。相比而言,生物酶法則具有反應(yīng)條件溫和,專一性高,產(chǎn)物得率高,對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[4],這些優(yōu)點(diǎn)使生物酶法成為生產(chǎn)FA的研究熱點(diǎn)。
阿魏酸酯酶(feruloyl esterase,F(xiàn)AE,E.C.3.1.1.73),屬于羧酸酯酶亞類,可催化水解阿魏酸與多糖、纖維素、木質(zhì)素間的酯鍵或醚鍵,生成阿魏酸[5]。此外,在三元有機(jī)溶劑體系中,阿魏酸酯酶還可通過(guò)酯交換反應(yīng)生產(chǎn)阿魏酰寡糖或羥基肉桂酸酯等衍生物[6]。FAE廣泛分布于植物和微生物中,目前產(chǎn)FAE微生物主要有曲霉屬[7]、青霉屬[8]等絲狀真菌,放線菌[9]、乳酸菌[10]、芽孢桿菌[11]等細(xì)菌。不同來(lái)源FAE其酶學(xué)性質(zhì)、序列同源性、空間結(jié)構(gòu)有較大差異,目前對(duì)黑曲霉來(lái)源的FAE研究較深入。盡管真菌產(chǎn)阿魏酸酯酶能力強(qiáng),但真菌來(lái)源的FAE分離困難,發(fā)酵酶活力低,耐熱性差等缺點(diǎn)導(dǎo)致其難以規(guī)模化生產(chǎn)[12],因此發(fā)掘更多細(xì)菌來(lái)源、酶活力高的阿魏酸酯酶成為亟需解決的問(wèn)題并獲得國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。
本研究從土壤中分離鑒定得到1株產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株SK52.001;確定了最佳碳源及濃度,最佳氮源和培養(yǎng)基初始pH值;明確FAE是誘導(dǎo)性酶,為更多細(xì)菌來(lái)源的阿魏酸酯酶提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。
1.1.1 材料
土壤:在江蘇無(wú)錫貢湖灣濕地和長(zhǎng)廣溪濕地隨機(jī)挑選10個(gè)地點(diǎn)采集土壤下5~10 cm深腐殖質(zhì)土壤。
小麥麩皮:江蘇無(wú)錫歐尚超市。
1.1.2 儀器與設(shè)備
Agilent 1200型高效液相色譜儀,美國(guó)Agilent公司;Waters ACQUITY UPLC液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,美國(guó)沃特世公司。
1.1.3 培養(yǎng)基
分離培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200,蔗糖20,瓊脂15~20;pH值自然,121 ℃滅菌20 min。
種子培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200,蔗糖20;pH值自然,121 ℃滅菌20 min。
篩選固體培養(yǎng)基(g/L):NaNO32,K2HPO4·3H2O 1,KCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01,瓊脂15~20;pH值自然,115 ℃滅菌30 min。0.22 μm濾膜過(guò)濾100 mg/L阿魏酸乙酯的N,N-二甲基甲酰胺溶液,添加10%(體積分?jǐn)?shù))阿魏酸乙酯溶液至滅菌培養(yǎng)基中,搖勻至培養(yǎng)基呈均勻的乳白色溶液后倒平板。
基礎(chǔ)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基[13](g/L):麥麩20,NaNO32,K2HPO4·3H2O 1,KCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01;pH值自然,115 ℃滅菌30 min。
LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 10;pH值自然,121 ℃滅菌20 min。
1.2.1 菌株分離
稱取土樣1.0 g加入到10 mL含玻璃珠的無(wú)菌水,于30 ℃,200 r/min振蕩30 min,靜置2 min后取上清液梯度稀釋,并將稀釋懸浮液取100 μL涂布于分離培養(yǎng)基,倒置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至單菌落長(zhǎng)出。
1.2.2 菌株篩選
將分離培養(yǎng)基的單菌落挑至篩選培養(yǎng)基,利用以阿魏酸乙酯為唯一碳源的篩選平板篩選。于30 ℃ 培養(yǎng)箱倒置24 h,觀察菌落周圍是否有透明圈出現(xiàn)。若有透明圈,則說(shuō)明該菌株具有阿魏酸酯酶活性。
將有阿魏酸酯酶活性的菌落劃線純化,將純培養(yǎng)物接種至種子培養(yǎng)基,30 ℃,200 r/min培養(yǎng)18 h,按5%接種量接種至基礎(chǔ)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d,定時(shí)取發(fā)酵液檢測(cè)其是否存在阿魏酸酯酶活性。
1.3.1 測(cè)定方法
粗酶液制備:1 mL發(fā)酵液室溫下以10 000 r/min離心10 min,發(fā)酵上清液即為粗酶液。
酶反應(yīng):1 mL酶反應(yīng)體系中含250 μL粗酶液和750 μL濃度為0.003 mol/L 阿魏酸甲酯(溶解在0.050 mol/L Tris-HCl緩沖溶液,pH值8.0)。酶反應(yīng)體系在50 ℃水浴鍋反應(yīng)15 min后立即煮沸滅酶10 min ,終止酶反應(yīng),12 000 r/min離心2 min,取上清液制樣。以加入等量蒸餾水代替粗酶液為空白對(duì)照,其他操作相同。
酶活力單位定義:一定溫度下,1 min水解阿魏酸甲酯生成1 μmol阿魏酸所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位(1 U)。
1.3.2 高效液相色譜檢測(cè)條件
色譜條件參照文獻(xiàn)[14]的方法,并加以改進(jìn)。Agilent 1200型高效液相色譜儀;色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18(Agilent,4.6 mm×150 mm,3.5 μm);紫外檢測(cè)器;流動(dòng)相A:1%乙酸溶液,流動(dòng)相B:甲醇;流速1 mL/min;柱溫30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm,梯度洗脫程序如表1所示。
表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program
色譜條件:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.7 μm);Waters ACQUITY PDA檢測(cè)器;流動(dòng)相A:0.1% 甲酸,流動(dòng)相B:乙腈;梯度洗脫分離條件:0~40 min,100%~70% A;40~45 min,70%~20% A;45~50 min,20%~0% A;50~55 min,0%~100% A;流速0.3 mL/min;柱溫45 ℃。
質(zhì)譜條件:錐孔電壓30 V;毛細(xì)管電壓3.5 V;ESI陰離子電離噴霧源;脫溶劑汽溫度400 ℃;脫溶劑汽流量700 L/h;離子源溫度100 ℃;錐孔汽流量50 L/h;質(zhì)量掃描范圍20~2 000m/z。
1.5.1 菌株形態(tài)鑒定
目標(biāo)菌株純培養(yǎng)物劃線于LB平板,觀察菌落形態(tài)和顏色;并進(jìn)行革蘭氏染色及菌株個(gè)體形態(tài)觀察。1.5.2 生理生化特征
參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[15]及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16]進(jìn)行目標(biāo)菌株生理生化特征檢測(cè)。
1.5.3 分子生物學(xué)鑒定
菌株16S rRNA 基因測(cè)序由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。將16S rRNA序列在NCBI(National center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析,并采用MEGA 7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
發(fā)酵條件采用以下方式:挑取單菌落至50 mL LB培養(yǎng)基于30 ℃,200 r/min 培養(yǎng)18 h后,按5%接種量接種至發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基,30 ℃,200 r/min培養(yǎng)26 h,250 mL錐形瓶裝液量為25 mL,測(cè)定發(fā)酵結(jié)束的菌體生長(zhǎng)量及發(fā)酵上清液酶活力,每次優(yōu)化的結(jié)果均用于之后的實(shí)驗(yàn)中。
1.6.1 碳源種類及濃度
去淀粉小麥麩皮[17]:麩皮浸沒(méi)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的醋酸鉀溶液中,95 ℃水浴1 h,其間不斷攪拌,去離子水反復(fù)沖洗至淀粉完全去除,105 ℃烘干至恒重。
以10 g/L葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、D-木糖、木聚糖、可溶性淀粉、小麥麩皮(wheat bran,WB)、去淀粉小麥麩皮(destarched wheat bran,DSWB)作為唯一碳源確定最佳碳源。改變最佳碳源濃度,分別為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 g/L,確定最佳碳源濃度。
1.6.2 復(fù)合碳源
額外添加5 g/L葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、D-木糖和木聚糖為復(fù)合碳源,以45 g/L WB為對(duì)照[18]。
1.6.3 氮源種類
以5 g/L胰蛋白胨、大豆蛋白胨、魚(yú)粉蛋白胨、酵母提取物、硫酸銨、尿素、硝酸鈉為唯一氮源,以不加入氮源為對(duì)照。
1.6.4 初始pH值
分別調(diào)節(jié)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基初始pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,確定菌株生長(zhǎng)的最適初始pH值。
將種子液分別接種至誘導(dǎo)性碳源(45 g/L麩皮),非誘導(dǎo)性碳源(45 g/L葡萄糖),以非誘導(dǎo)性碳(45 g/L葡萄糖)預(yù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期后添加45 g/L麩皮的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,于30 ℃,200 r/min搖床培養(yǎng),每隔一定時(shí)間取樣測(cè)定OD600值和發(fā)酵酶活力。
土樣經(jīng)分離和篩選后,共獲得105株菌,其中8株產(chǎn)阿魏酸酯酶,發(fā)酵酶活力見(jiàn)表2。3號(hào)菌株的阿魏酸酯酶活力最高,達(dá)195 U/L,因此命名3號(hào)菌株為SK52.001,作為后續(xù)研究菌株。
表2 菌株產(chǎn)酶活力測(cè)定 單位:U/L
由圖1-a全離子色譜圖可知,目標(biāo)產(chǎn)物阿魏酸在3.64 min出單峰。在負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜圖中,相同保留時(shí)間的是[M-H]-分子離子峰,因此由質(zhì)譜圖1-b中相對(duì)豐度最高的碎片m/z=193可知,目標(biāo)產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量為194,與阿魏酸單體的相對(duì)分子質(zhì)量一致。
a-色譜圖;b-質(zhì)譜圖圖1 酶反應(yīng)產(chǎn)物L(fēng)C-MS圖譜Fig.1 Result of SK52.001 product by LC-MS
2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定
該菌株在LB固體平板上的菌落為圓形,較薄,中間呈淺黃色,邊緣微白,表面黏稠濕潤(rùn),邊緣凹凸不整齊(圖2)。細(xì)胞呈短桿狀,兩端鈍圓,具有典型的芽孢桿菌的形態(tài)特征,屬于革蘭氏陽(yáng)性菌。
2.3.2 生理生化特征
菌株SK52.001生理生化鑒定結(jié)果如表3所示。
2.3.3 分子生物學(xué)鑒定
測(cè)序結(jié)果顯示,SK52.001的16S rRNA基因序列含1 404個(gè)堿基,經(jīng)NCBI在線數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn),其與多種芽孢桿菌屬菌株同源性達(dá)100%,結(jié)合該菌株生理生化試驗(yàn)與形態(tài)學(xué)特征,最終確定SK52.001為短小芽孢桿菌。為進(jìn)一步確定目標(biāo)菌株與已知芽孢桿菌屬菌株間親緣關(guān)系,采用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),采用Neighbor-Joining分析法[19],通過(guò)1 000次步長(zhǎng)檢驗(yàn)得到系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),如圖3所示。
圖3 利用Neighbor-Joining法構(gòu)建菌株SK52.001的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain SK52.001 constructed by method of Neighbor-Joining 注:★為本研究菌株
2.4.1 碳源種類與濃度
當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中碳源種類不同時(shí),菌體生長(zhǎng)量及阿魏酸酯酶活力存在顯著差異,見(jiàn)圖4-a。以葡萄糖等簡(jiǎn)單糖為碳源時(shí),F(xiàn)AE發(fā)酵酶活力低,這與SHIN等[20]研究結(jié)果基本一致。以麩皮和DSWB為碳源時(shí),菌體生長(zhǎng)量較高,一方面可能是麩皮中含多種蛋白質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如尼克酸、硫胺酸等,可以滿足菌體生長(zhǎng)需求[21],另一方面FAE為誘導(dǎo)酶[22],麩皮與DSWB含有阿魏酸酯鍵可誘導(dǎo)生產(chǎn)大量FAE提高酶活力。其中,以麩皮為碳源時(shí)FAE酶活力最高,可能是由于DSWB中水溶性物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分流失。
以麩皮為碳源時(shí),探究了不同濃度對(duì)FAE酶活力的影響(圖4-b)。當(dāng)麩皮質(zhì)量濃度低于45 g/L時(shí),F(xiàn)AE酶活力隨著麩皮濃度的增加而提高,當(dāng)麩皮質(zhì)量濃度在45 g/L時(shí),F(xiàn)AE酶活力最高,隨后酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)??赡苁且?yàn)檫^(guò)高的麩皮濃度使培養(yǎng)基中水分含量和空氣通量減少[23],菌體的FAE合成能力下降;同時(shí),麩皮不斷被分解利用使培養(yǎng)基中球形顆粒增多,濁度增加,因此在600 nm處的光密度增加。
2.4.2 復(fù)合碳源
本實(shí)驗(yàn)還探究了當(dāng)麩皮質(zhì)量濃度為45 g/L時(shí),添加其他糖共發(fā)酵對(duì)酶活力影響(圖4-c)。研究表明,簡(jiǎn)單糖的存在一定程度上抑制FAE的生產(chǎn),這與之前研究相同[18],該現(xiàn)象可能是菌體生長(zhǎng)產(chǎn)酶過(guò)程中,簡(jiǎn)單糖與麩皮作為碳源相互競(jìng)爭(zhēng),過(guò)多碳源抑制微生物生長(zhǎng),進(jìn)而減少FAE表達(dá)分泌。因此,選擇質(zhì)量濃度為45 g/L麩皮為唯一碳源時(shí),F(xiàn)AE酶活力最高。
2.4.3 氮源種類
氮源是菌體生長(zhǎng)和細(xì)胞代謝的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),SK52.001利用不同氮源生長(zhǎng)產(chǎn)酶情況不同(圖4-d)。麩皮作為天然化合物包括淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),也可作為氮源,因此選用不額外添加氮源的培養(yǎng)基作為對(duì)照組。結(jié)果顯示,有機(jī)氮源酶活力普遍高于無(wú)機(jī)氮源,可能是由于有機(jī)氮源中的小分子肽更易于菌體吸收利用,而無(wú)機(jī)氮源轉(zhuǎn)化率低,降低菌體生長(zhǎng)代謝速率,造成產(chǎn)酶量減少[24]。麩皮作為氮源,其結(jié)構(gòu)復(fù)雜,氮源提供不足,菌體利用率低使生長(zhǎng)受抑制,產(chǎn)酶量少。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基含5 g/L胰蛋白胨時(shí),F(xiàn)AE酶活力最高,大豆蛋白胨次之。然而,與早期報(bào)道[25]結(jié)果不同,有機(jī)氮源如酵母提取物蛋白胨不支持阿魏酸酯酶的生產(chǎn),主要是由于產(chǎn)酶菌株對(duì)氮源的利用率不同。
a-碳源種類;b-麩皮濃度;c-復(fù)合碳源;d-氮源種類圖4 產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分優(yōu)化Fig.4 Optimization in the medium for the FAE production
2.4.4 初始 pH值
培養(yǎng)基pH值直接影響菌體代謝及產(chǎn)酶,過(guò)酸過(guò)堿的生長(zhǎng)環(huán)境都抑制菌體生長(zhǎng)代謝。由圖5可知,在pH值為6.0時(shí)FAE酶活力達(dá)421 U/L。曹艷等[26]研究顯示,溜曲霉FD-8(Aspergillustamarii,F(xiàn)D-8)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基最適pH值為6.0,在該pH值下,菌體生長(zhǎng)量最多,可合成更多的FAE,進(jìn)而提高FAE酶活力。
圖5 初始pH值優(yōu)化Fig.5 Optimization of initial pH values
分別考察以葡萄糖為碳源,以麩皮為碳源,以葡萄糖為碳源培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期加麩皮誘導(dǎo)產(chǎn)酶在不同發(fā)酵時(shí)間的OD600和發(fā)酵酶活力(如圖6所示)。當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí),菌株生長(zhǎng)16 h進(jìn)入穩(wěn)定期,而FAE酶活力極低,且?guī)缀鯚o(wú)變化,說(shuō)明葡萄糖僅供菌株維持基本生長(zhǎng)代謝。當(dāng)以麩皮為碳源時(shí),菌株培養(yǎng)24 h進(jìn)入穩(wěn)定期,隨后隨OD600緩慢增加酶活力也不斷升高,培養(yǎng)至32 h時(shí)FEA酶活力最高。當(dāng)以葡萄糖為碳源預(yù)培養(yǎng)8 h后添加麩皮誘導(dǎo)產(chǎn)酶44 h時(shí),F(xiàn)AE酶活力顯著提高至808 U/L,說(shuō)明麩皮的添加可誘導(dǎo)菌株生產(chǎn)FAE,前期葡萄糖提供菌株生長(zhǎng)所需碳源,之后補(bǔ)加麩皮,一方面提供產(chǎn)酶誘導(dǎo)物,另一方面進(jìn)一步補(bǔ)充供微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),所以菌體量與產(chǎn)酶量均高于僅用麩皮或葡萄糖為碳源的產(chǎn)量。以上結(jié)果表明,該菌株所產(chǎn)FAE是誘導(dǎo)型表達(dá),只有當(dāng)培養(yǎng)基中存在誘導(dǎo)物時(shí),F(xiàn)AE才能大量表達(dá)。
近年來(lái)國(guó)內(nèi)外報(bào)道生產(chǎn)阿魏酸酯酶的不同菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件和酶活力見(jiàn)表4。本研究中短小芽孢桿菌來(lái)源的阿魏酸酯酶在國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少,且發(fā)酵酶活力可達(dá)808 U/L,在工業(yè)中有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。
表4 阿魏酸酯酶發(fā)酵酶活力Table 4 Enzyme activity of FAE
本實(shí)驗(yàn)從江蘇無(wú)錫貢湖灣濕地和長(zhǎng)廣溪濕地土壤中分離出1株產(chǎn)阿魏酸酯酶的菌株,通過(guò)對(duì)此菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)后確定該菌株為短小芽孢桿菌BacilluspumilusSK52.001。其酶反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)LC-MS后可確定該酶為阿魏酸酯酶,利用該菌株在30 ℃,200 r/min條件下,當(dāng)接種量為5%時(shí),在45 g/L麩皮,5 g/L胰蛋白胨,培養(yǎng)基初始pH值為6.0時(shí),發(fā)酵培養(yǎng)26 h,發(fā)酵液中的阿魏酸酯酶活力達(dá)到421 U/L,比原始酶活力(195 U/L)提高115%。當(dāng)菌株在以45 g/L葡萄糖為碳源的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)8 h,加入45 g/L麩皮誘導(dǎo)產(chǎn)酶44 h時(shí),發(fā)酵液中阿魏酸酯酶活力最高,達(dá)到808 U/L。研究結(jié)果表明,篩選得到的菌株B.pumilusSK52.001是一種具有工業(yè)化生產(chǎn)能力的阿魏酸酯酶生產(chǎn)菌。