黃連總生物堿與三七皂苷組合物對大鼠糖尿病心肌缺血再灌注損傷的影響

王曉，劉博，張譯心，2，王鑫，周赫，2，紀(jì)鳳蘭，丁濤，溫富春，徐惠波*（.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春 3002；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長春 307）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是糖尿病患者最主要的大血管并發(fā)癥，發(fā)病率高達55%[1]，也是患者死亡的首要原因。由于糖尿病前期與冠心病早期發(fā)病均無明顯癥狀，導(dǎo)致診斷不及時，臨床在確診糖尿病時往往已經(jīng)存在并發(fā)冠心病，或在確診冠心病時已經(jīng)存在糖耐量異?；蛞葝u素抵抗等糖尿病前期癥狀。也正因如此，對于糖尿病合并冠心病的治療常常將二者割裂開來，按單一疾病或根據(jù)出現(xiàn)的合并癥狀對癥治療。

黃連為多年生毛茛科草本植物黃連的根莖，主要活性成分為生物堿，其中小檗堿的降糖作用一直是討論熱點，而除小檗堿外的其他生物堿也具有降糖作用[2]。三七總皂苷是三七的主要活性成分，可通過調(diào)控氧化應(yīng)激[3]、改善血管內(nèi)皮功能[4]等多種途徑改善糖尿病及其并發(fā)癥[5]。我們的前期研究提示[6]，黃連總生物堿與三七總皂苷組合物（簡稱HS組合物）對糖尿病及糖尿病冠心病大鼠模型具有較好的藥理活性，本實驗以前期實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，通過建立鏈脲佐菌素結(jié)合冠狀動脈結(jié)扎制備的大鼠糖尿病心肌缺血再灌注損傷模型研究其對于糖尿病冠心病的影響，旨在充分利用中藥多途徑、多靶點的特點，從多方面針對糖尿病合并心肌損傷發(fā)揮治療作用，為其進一步的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量190～230 g，SPF級[遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，合格證號：211002300041542]。實驗動物均于屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)，溫度濕度恒定，每12 h明暗交替，動物均自由進食飲水。本實驗系通過吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)后實施，倫理審批號為JLSZKYDWLL 2018-003。

1.2 試藥

HS組合物[黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.的干燥根莖，黃連提取物其含量以小檗堿計不得小于60%，批號：20180101。三七為五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根和根莖，三七提取物其含量以人參皂苷Rg1計不得小于68%，批號：20180501。將提取物376.5 g與三七提取物36 g，加輔料制得HS組合物]（吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院新藥中心化學(xué)實驗室自制）；鹽酸二甲雙胍片（白云山湯陰東泰藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：180706）；鏈脲佐菌素（美國Sigma公司，批號：WXBC7268V）；SDSPAGE凝膠制備試劑盒（批號：20410）、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（批號：20405）、RIPA Lysis Buffer（批號：30427）、SDS-PAGE Loading Buffer（批號：40320）、Protease inhibitor Cocktail（批號：50321）、Tris-Glycine SDS Buffer（批號：30310）、Tris-Glycine Transfer Buffer（批號：40439）、Multicolor Protein Marker（批號：30312）、TBST（批號：40439）（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；Bax（貨號：SC-7480）、Bcl-2（貨號：SC-7382）、Caspase-3（貨號：SC-65497）、Caspase-1（貨號：SC-392736）、IL-1β（貨號：SC-515598）、GAPDH（貨號：SC-365062）（Santa Cruz）；NOX2（博奧森，貨號：bs-3889R）；NOX4（博奧森，貨號：bs-4730R）；NLRP3（Abcam，貨號：Ab214185）；山羊抗兔IgG H＆L（HRP）（Abcam，貨號：Ab205718）。

1.3 儀器

BGM506型血糖儀（中國深圳家康科技有限公司）；PB-10型pH計[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；CS-600B型全自動生化分析儀（中國長春迪瑞實業(yè)有限公司）；ELx800型酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）；Leica EG 1130型修切冷臺、RM2255型高精密全自動切片機、Leica EG1140型石蠟包埋機（德國Leica公司）；PowerLab/8S型多導(dǎo)生物記錄儀（ADInstruments公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；FB-40型血液凝固分析儀（中國山西亞森實業(yè)有限公司）；NIS-ELEMNT BR型圖像分析系統(tǒng)（日本NIKON公司）；BX51 OLMPUS型光學(xué)顯微鏡（日本OLMPUS公司）；HC-3618R型高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；ChemiDoc-It 510 Imager型凝膠成像系統(tǒng)（Ultra-Violet Products Ltd）。

2 方法

2.1 造模與給藥

雄性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機分為對照組（n＝16）與造模組（n＝54），將兩組大鼠禁食12 h，造模組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）55 mg·kg－1（溶于pH 4.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，在配制后30 min內(nèi)注射完畢），對照組大鼠則注射等體積溶劑（10 mL·kg－1），造模組大鼠注射STZ 2周后禁食12 h，尾靜脈采血檢測大鼠血糖，將空腹血糖＜11.1 mmol·L－1的未成模大鼠剔除。

根據(jù)血糖與體質(zhì)量均衡原則將成模大鼠分為模型組（n＝20）、二甲雙胍組（200 mg·kg－1，n＝14）、HS組合物組（黃連總生物堿865 mg·kg－1＋三七總皂苷84 mg·kg－1，根據(jù)前期研究[6]以及預(yù)實驗結(jié)果確定組合物比例，n＝15）。分組后每日灌胃給藥1次，連續(xù)15周。末次給藥1 h后，以1.2 g·kg－1劑量腹腔注射烏來糖麻醉大鼠，將其仰位固定于手術(shù)臺上，切開頸部進行氣管插管，并連接呼吸機進行機械通氣，以八道生理記錄儀持續(xù)觀察并記錄大鼠心電圖。于左胸第四、五肋間處切開胸壁，并沿胸骨左緣2 mm處切開第四肋骨，擠出心臟，進針于左心耳下緣2 mm處，穿過左冠狀動脈前降支下心肌部分，于肺動脈圓錐左緣出針，在穿線后將心臟放回至胸腔，靜置10 min，待大鼠心電圖顯示T波恢復(fù)后，進行冠狀動脈結(jié)扎，以ECGⅡ?qū)?lián)顯示心電圖ST段明顯提高作為冠脈結(jié)扎成功的標(biāo)志，造成大鼠心肌缺血。于心肌缺血30 min后，再次開胸，剪開結(jié)扎線以恢復(fù)冠狀動脈血流，時間為2 h，對照組除不進行冠狀動脈結(jié)扎外，與模型組相同操作。實驗結(jié)束后大鼠腹主動脈取血用于各項指標(biāo)檢測。

2.2 血糖值檢測

每4周各組大鼠禁食12 h，尾靜脈采血并以血糖儀測量空腹血糖。

2.3 口服糖耐量試驗

于試驗結(jié)束前，將大鼠禁食12 h，以2 g·kg－1劑量灌胃葡萄糖，血糖儀檢測葡萄糖灌胃0、30、60、120 min時血液中葡萄糖濃度，并繪制血糖濃度曲線，計算大鼠血糖濃度曲線下面積（area under the curve，AUC）。

2.4 血清胰島素含量檢測

參照試劑盒說明書，使用ELISA試劑盒測定大鼠血清中胰島素含量。

2.5 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

參照試劑盒說明書，檢測血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量。

2.6 血清心肌酶檢測

參照試劑盒說明書，使用全自動生化分析儀檢測血清中肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量。

2.7 胰腺、心肌組織病理變化的觀察

取大鼠胰腺、心臟固定于10%甲醛溶液中，進行常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察胰腺組織與心肌組織的病理學(xué)變化。

2.8 蛋白表達檢測

稱取－80℃冷凍保存的大鼠心肌組織300 mg，剪碎后加裂解液勻漿，冰浴靜置20 min，4℃條件下于12 000 r·min－1離心10 min，取上清液，BCA法測定總蛋白濃度，loading buffer處理蛋白后加樣，進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉。經(jīng)過一抗、二抗孵育顯色后置于凝膠成像儀中，觀察結(jié)果并拍照，應(yīng)用VisionWorksLS軟件分析灰度值進行半定量分析。

2.9 統(tǒng)計方法

以SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，表中所有數(shù)據(jù)均以（±s）表示，單因素方差分析（Oneway ANOVA）法進行多組間比較，當(dāng)P＜0.05時，表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HS組合物對大鼠空腹血糖值的影響

與對照組比較，模型組大鼠0～16周期間血糖水平明顯升高（P＜0.001）；與模型組相比，二甲雙胍組大鼠血糖值于第8周（P＜0.05）、第12周（P＜0.001）明顯降低；HS組合物組大鼠血糖值于第4周（P＜0.01）、第8周（P＜0.05）、第12周（P＜0.05）均顯著降低。表示HS組合物對糖尿病大鼠的高血糖有一定的改善作用。結(jié)果見表1。

表1 HS組合物對大鼠血糖值的影響(±s，mmol·L－1)Tab 1 Effect of HS compound on fasting blood glucose in rats (±s，mmol·L－1)

表1 HS組合物對大鼠血糖值的影響(±s，mmol·L－1)Tab 1 Effect of HS compound on fasting blood glucose in rats (±s，mmol·L－1)

注：與對照組比較，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。Note：Compared with the control group，###P＜0.001；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.

組別初始第4周第8周第12周第16周n血糖值n血糖值n血糖值n血糖值n血糖值對照組16 5.88±0.4216 5.85±0.3416 6.36±0.4614 5.86±0.5514 5.73±0.47模型組2020.90±2.40###2030.81±2.99###2031.37±2.70###1829.99±2.80###1821.91±7.22###二甲雙胍組1420.93±4.741429.67±3.871428.48±3.96*1424.52±3.22***1419.47±7.37 HS組合物組1520.77±3.121525.46±5.73**1527.27±5.39*1525.64±7.15*1322.92±6.50

3.2 HS組合物對大鼠口服糖耐量的影響

與對照組相比，模型組在灌胃葡萄糖0～120 min各時間點大鼠血糖均顯著升高（P＜0.001），AUC明顯增加（P＜0.001）；與模型組相比，二甲雙胍組于葡萄糖灌胃后30、60、120 min血糖降低（P＜0.001），AUC明顯降低（P＜0.001），HS組合物組60、120 min血糖均降低（P＜0.05）。提示HS組合物能一定程度地降低糖尿病大鼠口服葡萄糖后血糖AUC，作用可維持至給藥后120 min，對大鼠糖耐量有良好的改善作用。結(jié)果見表2。

表2 HS組合物對大鼠口服糖耐量的影響(±s)Tab 2 Effect of HS compound on oral glucose tolerance in rats (±s)

表2 HS組合物對大鼠口服糖耐量的影響(±s)Tab 2 Effect of HS compound on oral glucose tolerance in rats (±s)

注：與對照組相比，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，***P＜0.001。Note：Compared with the control group，###P＜0.001；compared with the model group，*P＜0.05，***P＜0.001.

組別n血糖值/（mmol·L－1）AUC/（mmol·h·L－1）0 min30 min60 min120 min對照組14 5.73±0.47 7.82±0.72 7.54±0.65 7.34±2.0514.67±0.94模型組1821.91±7.22###31.89±3.01###31.46±2.44###28.85±4.14###59.44±5.53###二甲雙胍組1419.47±7.3722.24±7.29***18.78±6.92***14.54±5.27***37.34±11.95***HS組合物組1322.92±6.5030.56±3.4128.52±3.75*25.73±3.06*55.27±6.21

3.3 HS組合物對大鼠生化指標(biāo)的影響

與對照組比較，模型組大鼠胰島素、SOD水平明顯降低（P＜0.001，P＜0.05），MDA與CK-MB則顯著升高（P＜0.05，P＜0.001）；與模型組相比，二甲雙胍組、HS組合物組大鼠胰島素與SOD水平則明顯升高（P＜0.001，P＜0.05），HS組合物組大鼠血清中MDA與CK-MB含量明顯低于模型組（P＜0.01，P＜0.05），可見HS組合物組給藥可降低大鼠氧化應(yīng)激水平，使胰島素分泌增加、心肌損傷減輕。結(jié)果見表3。

表3 HS組合物對大鼠血清中胰島素、SOD、MDA及CK-MB水平的影響(n＝11，±s)Tab 3 Effect of HS compound on serum insulin，SOD，MDA and CK-MB level in rats (n＝11，±s)

表3 HS組合物對大鼠血清中胰島素、SOD、MDA及CK-MB水平的影響(n＝11，±s)Tab 3 Effect of HS compound on serum insulin，SOD，MDA and CK-MB level in rats (n＝11，±s)

注：與對照組相比，#P＜0.05，###P＜0.001；與模型組比較，*P＜0.05，P＜0.01，***P＜0.001。Note：Compared with the control group，#P＜0.05，###P＜0.001；compared with the model group，*P＜0.05，P＜0.01，***P＜0.001.

組別胰島素/（mU·L－1）SOD/（U·mL－1）MDA/（nmol·mL－1）CK-MB/（U·L－1）對照組43.95±5.88312.64±47.125.86±1.42 470.19±139.84模型組17.66±4.19###264.81±43.78#7.33±1.32#1259.20±411.06###二甲雙胍組25.77±4.57***307.65±35.25*6.54±1.68 925.53±326.27*HS組合物組30.80±2.77***313.51±52.70*6.00±0.80** 914.01±344.49*

3.4 HS組合物對大鼠胰腺、心肌組織形態(tài)學(xué)的影響

對照組大鼠胰腺中胰島組織體積較大且結(jié)構(gòu)完整，呈圓形/類圓形分布，胰島細(xì)胞胞漿豐富且數(shù)量較多；與對照組相比，模型組大鼠胰腺中胰島數(shù)量少且分布稀疏，胰島細(xì)胞胞漿減少、數(shù)量也明顯減少，胰島明顯萎縮；與模型組相比，二甲雙胍組大鼠胰島數(shù)目較多，胰島體積較大，胰島數(shù)量有增加；HS組合物組大鼠胰島體積較大，且胰島內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且相比于二甲雙胍組，HS組合物組胰島數(shù)量較多（見圖1）。

圖1 HS組合物對大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)的影響（HE染色，400×）Fig 1 Effect of HS compound on pancreas histomorphology in rat（HE，400×）

對照組動物心臟可見輕微心內(nèi)膜心肌間質(zhì)疏松，心肌細(xì)胞染色均勻，心肌纖維排列緊密整齊；與對照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)了心肌間質(zhì)疏松水腫，心肌細(xì)胞間邊界不清晰、胞漿紊亂且細(xì)胞核大小不規(guī)則，染色不均，心肌組織發(fā)生了明顯的組織學(xué)改變；與模型組相比，二甲雙胍組大鼠心內(nèi)膜心肌組織腫脹、變性程度較輕，心肌受累面積較小，心肌細(xì)胞形態(tài)改變程度較輕；HS組合物組大鼠心肌染色不均程度較輕、心肌細(xì)胞排列較整齊，心肌損傷程度明顯減輕（見圖2）。HS組合物組大鼠胰島組織與心肌組織損傷程度明顯輕于模型組，表明HS組合物具有良好的胰島及心肌組織保護作用。

圖2 HS組合物對大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響（HE染色，400×）Fig 2 Effect of HS compound on myocardial histomorphology in rats（HE，400×）

3.5 HS組合物對大鼠蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠心肌Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、NOD樣受體蛋白3（NLRP3）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2（NOX2）與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）表達顯著提高，B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）表達則明顯降低；與模型組比較，二甲雙胍組與HS組合物組大鼠心肌中Bax、Caspase-3、NLRP3、NOX2與NOX4等蛋白表達明顯降低，半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）與白介素-1β（IL-1β）有降低趨勢，Bcl-2則明顯升高。由圖3可見，HS組合物能夠上調(diào)糖尿病大鼠心肌組織中Bcl-2的表達，降低Bax、Caspase-3、NLRP3、NOX2及NOX4的表達，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，從而體現(xiàn)出其對心肌組織氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的改善作用。

圖3 HS組合物大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Caspase-3、NLRP3、Caspase-1、IL-1β、NOX2、NOX4蛋白表達Fig 3 Expression of Bax，Bcl-2，Caspase-3，NLRP3，Caspase-1，IL-1β，NOX2，and NOX4 protein in the myocardium of HS compound group

4 討論

NADPH氧化酶在心肌缺血與再灌注過程中扮演著重要的角色，可被多種外源性因素激活，如機體的代謝因素、心肌的缺氧、復(fù)氧及缺血與再灌注等，是心血管中ROS的主要來源。NADPH氧化酶共有7個亞型，其中NOX2與NOX4是心血管系統(tǒng)中表達的主要亞型，有研究表明，NOX2與NOX4共同參與了糖尿病的大血管病變，粥樣斑塊中可檢測到NOX2與NOX4的高表達，在發(fā)生心肌梗死后，NOX2與NOX4在心臟中的水平顯著升高[7]，而本研究中模型組大鼠NOX2和NOX4的表達情況也與其報道一致。NOX2主要于心肌細(xì)胞中大量表達，且分布于正常心肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時，NOX2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜并誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。NOX4則主要表達于內(nèi)皮細(xì)胞中，對糖尿病冠心病的內(nèi)皮損傷具有重要意義，它能通過參與血管內(nèi)皮的收縮舒張、氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)影響動脈粥樣硬化的進展，是內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的主要來源。ROS作為NLRP3的重要激活劑，可通過活化NLRP3誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。NLRP3被ROS激活后，通過Caspase-1大量活化 IL-1β并激活下游信號分子，通過系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)后引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。IL-1β作為重要的炎癥因子常被認(rèn)為是NLRP3的激活指標(biāo)。有研究表明，IL-1β與冠狀動脈狹窄程度和病變支數(shù)存在正相關(guān)。當(dāng)糖尿病合并冠心病時，長期的高糖環(huán)境與動脈粥樣斑塊的形成可造成心肌缺血缺氧，甚至發(fā)生心肌梗死導(dǎo)致死亡。

目前，對于糖尿病合并冠心病的治療主要是通過藥物或血運重建手術(shù)來恢復(fù)血流以保護心肌缺血造成的心肌損傷與壞死，然而在恢復(fù)血流的同時，由于心肌復(fù)氧導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)，進一步促進ROS的大量釋放，引起NLRP3的持續(xù)激活，致使IL-1β與Caspase-1等異常增加，導(dǎo)致心肌發(fā)生細(xì)胞凋亡與炎癥性壞死[8]。Bax與Bcl-2屬于Bcl-2家族，在心肌細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。Bax通過增加線粒體膜的通透性使細(xì)胞色素C穿過線粒體膜，激活Caspase-9，從而激活凋亡的執(zhí)行者Caspase-3，被上游始動子激活后的Caspase-3作用于下游特定的信號分子，使細(xì)胞產(chǎn)生一系列的生物形態(tài)學(xué)改變，最終發(fā)生心肌細(xì)胞凋亡[9]。Bcl-2則通過抑制線粒體膜的通透性來抑制下游Caspase-3的激活[10]，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡[11]。

越來越多的研究表明中藥在糖尿病合并心血管疾病方面具有很大的研究價值和開發(fā)潛力。配伍是中藥應(yīng)用最經(jīng)典的方式，臨床的聯(lián)合用藥也提示我們，單一藥物很難從多方面抑制復(fù)雜疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究試圖根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論采用黃連總生物堿與三七總皂苷配伍來實現(xiàn)清熱瀉火、散瘀通脈的功效，用于治療糖尿病并發(fā)心肌損傷。黃連在糖尿病的研究中一直頗受關(guān)注，其有效成分的研究以小檗堿居多[12]，而對于黃連總生物堿報道較少，有研究表明，黃連總生物堿可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、胰島素抵抗、糖脂代謝、胰島細(xì)胞功能等多種途徑改善糖尿病[13]。三七作為傳統(tǒng)的活血化瘀藥從古沿用至今，三七總皂苷作為三七的主要活性成分更是應(yīng)用廣泛[14]，具有調(diào)節(jié)血脂、改善心臟功能[15]、改善心肌細(xì)胞衰老[16]等作用。

本實驗采用兩者配伍，通過STZ結(jié)合冠脈結(jié)扎建立大鼠糖尿病心肌缺血再灌注損傷模型觀察HS組合物對糖尿病合并冠心病大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用。結(jié)果表明，HS組合物能降低糖尿病合并冠心病大鼠血糖，提高胰島素水平，改善大鼠口服糖耐量、通過下調(diào)NOX2、NOX4、NLRP3以及Bax、Caspase-3的表達，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達抑制糖尿病心肌缺血大鼠氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，減輕心肌細(xì)胞凋亡，從而改善糖尿病合并冠心病誘導(dǎo)的心肌損傷。目前，小檗堿針對糖尿病治療在臨床已有應(yīng)用，但仍作為輔助治療聯(lián)合其他降糖藥使用，本試驗采用黃連總生物堿與三七總皂苷配伍，在保證降糖效果的同時減輕心肌缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，為該品種的開發(fā)提供了理論依據(jù)。