基質(zhì)固相分散-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定沉香中精油的化學(xué)成分

陳虹霞， 周 昊,2， 葉建中， 陶 冉， 李文君, 王成章,2*

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室;國(guó)家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210042； 2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)新技術(shù)研究所，北京 100091)

沉香為瑞香科沉香屬(Aquilaria)植物中含有黑色樹(shù)脂的木質(zhì)部分，具有極高的藥用和收藏價(jià)值，是我國(guó)以及東南亞地區(qū)的傳統(tǒng)名貴藥材，通常被用作鎮(zhèn)靜劑。它也是名貴的天然香料，在世界范圍內(nèi)被用作熏香[1]。沉香和沉香精油的研究表明，色酮、倍半萜和芳香性小分子化合物是其主要化學(xué)成分[2-3]。目前沉香精油化學(xué)成分的研究通常采用乙醚超聲波法、乙醚冷浸法、超臨界二氧化碳萃取法或水蒸氣蒸餾法提取，然后進(jìn)行檢測(cè)分析。乙醚萃取法溶劑用量大，而超臨界二氧化碳萃取法和水蒸氣蒸餾法的樣品用量大且提取時(shí)間長(zhǎng)?；|(zhì)固相分散(MSPD)是Barker于1989年提出的，在樣品制備中得到了廣泛的應(yīng)用，已被證明是一種簡(jiǎn)單、高效、通用的測(cè)定固體和半固體基質(zhì)中各種分析物的技術(shù)[4-6]。MSPD技術(shù)將固體樣品在介質(zhì)中與分散劑混合研磨，樣品的原始結(jié)構(gòu)被破壞，從而可以釋放出分析物。然后將所得混合物加載到層析柱上，用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵摲治鑫?。在這種方法中，提取和純化過(guò)程可以集成到一個(gè)步驟中，這與其他傳統(tǒng)方法不同。集成不僅可以大大減少分析時(shí)間和有機(jī)溶劑的消耗，而且可以得到滿(mǎn)意的富集因子[7]。本研究采用MSPD法對(duì)沉香精油進(jìn)行提取，以沉香化學(xué)成分為指標(biāo)，對(duì)吸附基質(zhì)種類(lèi)和比例、分散溶劑種類(lèi)和比例、洗脫溶劑用量等幾個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的MSPD條件。建立沉香精油化學(xué)成分檢測(cè)的基質(zhì)固相分散-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與乙醚超聲波法進(jìn)行比較，以期為沉香質(zhì)量評(píng)價(jià)和后續(xù)的調(diào)查研究提供一種新方法。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

沉香樣品，產(chǎn)自海南，為生物結(jié)香方式，樣品粉碎成粉末，過(guò)0.85 mm的篩，備用。十八烷基硅膠填料(C18)、辛基硅膠填料(C8)購(gòu)于大連依利特分析儀器有限公司； 硅藻土、硅膠、硅酸鎂顆粒、石英砂、甲醇、無(wú)水乙醇、正丙醇、異丙醇、正己烷、乙酸乙酯和1,4-二氧雜環(huán)己烷(二氧六環(huán))購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；芐基丙酮購(gòu)于阿拉丁生化科技股份有限公司；檀香醇購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；2-(2-苯乙基)色酮購(gòu)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。GC2014C型氣相色譜(GC)儀，日本島津公司；Agilent-7890型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)儀，美國(guó)Agilent Technologies有限公司。

1.2 沉香精油的提取

1.2.1基質(zhì)固相分散提取及單因素試驗(yàn) 稱(chēng)取沉香粉末0.5 g，加入吸附基質(zhì)和分散溶劑置于研缽中，用研杵使其混勻并研磨完全后，轉(zhuǎn)入到底部墊有脫脂棉的10 mL注射器中。用洗脫溶劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，在減壓條件下，蒸干溶劑，然后加1 mL的乙醇溶解，過(guò)0.45 μm的濾膜，得到供試樣品溶液，用GC進(jìn)行峰面積的檢測(cè)。沉香精油成分復(fù)雜，根據(jù)文獻(xiàn)[8～10]可知，其精油成分達(dá)到45～77種，一方面化合物種類(lèi)太多，另一方面相當(dāng)一些化合物沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以采購(gòu)，因此不能完全對(duì)所有成分的提取量變化進(jìn)行研究。沉香精油的主要成分為芳香族化合物、倍半萜和色酮類(lèi)化合物，最終從芳香族化合物中選擇芐基丙酮，倍半萜中選擇檀香醇，色酮類(lèi)化合物中選擇2-(2-苯乙基)色酮作為主要分析對(duì)象，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，研究不同條件對(duì)沉香精油基質(zhì)固相分散提取的影響。選取了5個(gè)因素，分別為吸附基質(zhì)種類(lèi)、樣品與吸附基質(zhì)的比例、分散溶劑種類(lèi)、樣品與分散溶劑的比例和洗脫溶劑用量進(jìn)行基質(zhì)分散提取試驗(yàn)?？疾觳煌蛩貙?duì)芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮GC檢測(cè)峰面積的影響。

1.2.2乙醚超聲波提取 稱(chēng)取沉香粉末0.5 g，置于100 mL的錐形瓶中，加入乙醚30 mL，在室溫下，超聲波處理60 min，在減壓條件下，蒸干溶劑，然后加1 mL的乙醇溶解，過(guò)0.45 μm的濾膜，即為供試樣品溶液，用GC進(jìn)行峰面積的檢測(cè)[11]。

1.3 精油中3種主要化合物的測(cè)定

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的制備 將芐基丙酮、檀香醇、2-(2-苯乙基)色酮用乙醇溶解于10 mL的容量瓶中，分別配置成1 g/L的儲(chǔ)備液，于4 ℃保存。

1.3.2氣相色譜分析 色譜柱為HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.32 μm)；程序升溫：初始溫度為50 ℃，3 ℃/min升至200 ℃，然后5 ℃/min升至280 ℃，保持20 min，運(yùn)行時(shí)間86 min。載氣為高純氨氣，流速為1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μL，氣化室溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃。

通過(guò)對(duì)比供試樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，確定供試樣品溶液氣相色譜圖中芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮的出峰位置，得到對(duì)應(yīng)的峰面積。

1.4 精油化學(xué)成分的GC-MS分析

氣相色譜分析條件同1.3.2節(jié)。質(zhì)譜條件：接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，離子源選用EI源，電子能量70 eV，光電倍增管電壓220 V，掃描范圍29～600 u，質(zhì)譜庫(kù)NIST。

2 結(jié)果與討論

2.1 沉香精油基質(zhì)固相分散提取的影響因素

2.1.1吸附基質(zhì)類(lèi)型 吸附基質(zhì)的類(lèi)型對(duì)MSPD提取起著關(guān)鍵作用，一方面，吸附基質(zhì)在研磨過(guò)程中，可以破壞樣品的結(jié)構(gòu)，使目標(biāo)化合物暴露；另外一方面，可以將化合物固定在吸附基質(zhì)上，然后通過(guò)溶劑提取出來(lái)[12]。固定吸附基質(zhì)與樣品(沉香粉末)的質(zhì)量比為4 ∶1，洗脫溶劑為正己烷/乙酸乙酯(體積比9 ∶1，下同)混合液，洗脫溶劑用量10 mL，分散溶劑為正丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g),考察7種吸附基質(zhì)(C18、C8、沙子、硅藻土、硅膠、硅酸鎂和石英砂)對(duì)芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個(gè)化合物峰面積的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，C8、硅藻土和硅酸鎂表現(xiàn)出相似的提取效果，效果較好，而沙子和石英砂的效果最差。這可能是由于沙子和石英砂的顆粒較大，比表面積較小，在吸附目標(biāo)化合物時(shí)，效果不理想。C8、硅藻土和硅酸鎂具有較大的比表面積和微孔通道，對(duì)這3個(gè)化合物的吸附效果較好。C18和硅膠的提取效果欠佳，可能是由于它們與化合物之間形成了較強(qiáng)的氫鍵結(jié)合，使洗脫溶劑難以完全將目標(biāo)化合物洗脫下來(lái)。綜合比較，由于硅酸鎂對(duì)芐基丙酮和檀香醇的吸附效果優(yōu)于C8和硅藻土，因此選擇硅酸鎂作為吸附基質(zhì)用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.1.2吸附基質(zhì)與樣品的比例 吸附基質(zhì)與樣品的比例是影響MSPD提取過(guò)程的重要因素之一。固定硅酸鎂為吸附基質(zhì)，洗脫溶劑正己烷/乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量10 mL，分散溶劑為正丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，考察吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比(1 ∶1、 2 ∶1、 3 ∶1、 4 ∶1 和5 ∶1)對(duì)芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個(gè)化合物峰面積的影響。從表1可以看出，當(dāng)質(zhì)量比增至4 ∶1時(shí)， 3個(gè)化合物峰面積隨之增加，這是由于吸附基質(zhì)與樣品的接觸面積增加，從而增強(qiáng)了對(duì)化合物的吸附能力。但到5 ∶1時(shí)， 3個(gè)化合物的峰面積都隨之略微下降，可能由于過(guò)多的吸附基質(zhì)，使化合物的洗脫受到阻礙。因此，選擇吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比為4 ∶1。

2.1.3分散溶劑種類(lèi) 分散溶劑的選擇是植物精油類(lèi)樣品提取過(guò)程中的一個(gè)重要參數(shù)，分散溶劑既要能與樣品中的化合物相似相溶，又要能夠與洗脫溶劑混溶。固定硅酸鎂為吸附基質(zhì)，吸附基質(zhì)與樣品的質(zhì)量比為4 ∶1，洗脫溶劑為正己烷/乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量10 mL，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，考察5種分散溶劑(甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇和1,4-二氧六環(huán))對(duì)芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個(gè)化合物峰面積的影響。從表1可以看出，乙醇和異丙醇作為分散溶劑時(shí)，化合物的峰面積相對(duì)較強(qiáng)。在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，乙醇作為分散溶劑時(shí)，樣品的萃取過(guò)程非常緩慢，需要借助真空系統(tǒng)才能達(dá)到。因此，綜合考慮，采用異丙醇作為分散溶劑。

2.1.4樣品與分散溶劑的比例 固定硅酸鎂為吸附基質(zhì)，吸附基質(zhì)與樣品質(zhì)量比為4 ∶1，洗脫溶劑為正己烷/乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量10 mL，分散溶劑為正丙醇，考察分散溶劑與樣品的比例(1 ∶1、 2 ∶1、 3 ∶1、 4 ∶1、 5 ∶1和6 ∶1， mL ∶g)對(duì)芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個(gè)化合物峰面積的影響。從表1可以看出，隨著分散溶劑與樣品的比例從1 ∶1增加至4 ∶1， 3個(gè)化合物的峰面積隨之增加，這可能是由于正丙醇量的增加，可以加速這些化合物的溶出，促進(jìn)它們?cè)谙疵撊軇┲械姆稚ⅰＨ欢?，進(jìn)一步將正丙醇的量增加至5 ∶1和6 ∶1時(shí)，3種化合物的峰面積反而略有下降，可能是由于過(guò)量的正丙醇使化合物與吸附基質(zhì)之間形成強(qiáng)列的相互作用，使化合物不能夠完全解吸下來(lái)。因此，分散溶劑與樣品的比例選擇為4 ∶1(mL ∶g)。

表1 不同條件對(duì)沉香精油基質(zhì)固相分散提取的影響

2.1.5洗脫溶劑用量 為了能有效地洗脫精油成分，基本都采用正己烷/乙酸乙酯體積比9 ∶1作為洗脫體系[13-14]。固定硅酸鎂為吸附基質(zhì)，吸附基質(zhì)與樣品質(zhì)量比為4 ∶1，洗脫溶劑為正己烷/乙酸乙酯混合液，分散溶劑正丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，考察洗脫溶劑用量(2、 4、 6、 8和10 mL)對(duì)芐基丙酮、檀香醇和2-(2-苯乙基)色酮3個(gè)化合物峰面積的影響。從表1可以看出，隨著洗脫溶劑用量的增大，3個(gè)化合物峰面積逐漸增大，到6 mL時(shí)趨于平穩(wěn)，說(shuō)明6 mL的正己烷/乙酸乙酯混合液作為洗脫溶劑，可以達(dá)到較好的洗脫效果。

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，得到沉香精油基質(zhì)固相分散提取的最佳工藝條件為：硅酸鎂為吸附基質(zhì)，吸附基質(zhì)與樣品質(zhì)量比為4 ∶1，分散溶劑為異丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，洗脫溶劑為體積比9 ∶1的正己烷和乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量6 mL。在此條件下，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，沉香精油的提取得率平均值為(9.19±0.15)%，而傳統(tǒng)的乙醚超聲波提取的得率為(6.65±0.22)%。

2.2 沉香精油的化學(xué)組成

2.2.1化學(xué)組成分析 基質(zhì)固相分散提取和乙醚超聲波提取的沉香精油的總離子流圖見(jiàn)圖1，2種提取方法的色譜峰的整體差異不大?；|(zhì)固相萃取的色譜峰的豐度比乙醚超聲波提取的高，這與基質(zhì)固相萃取的得率大有關(guān)。各峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖通過(guò)Nist17標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖系統(tǒng)檢索，結(jié)合質(zhì)譜圖與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)照確定其化學(xué)成分，采用峰面積歸一化法確定各化合物的含量(以相對(duì)峰面積計(jì))，結(jié)果見(jiàn)表2。

a.基質(zhì)固相分散提取matrix solid-phase dispersion; b.乙醚超聲波提取ultrasonic assisted ether extraction

表2 不同提取方法所得沉香精油的化學(xué)成分

2種提取方法共鑒定出54種主要成分，其中基質(zhì)固相分散提取和乙醚超聲波提取分別鑒定出48和41種?；|(zhì)固相分散提取的沉香精油中已鑒定的化合物占色譜總出峰面積的67.04%，其中芳香族占2.13%，倍半萜類(lèi)占25.67%，色酮類(lèi)占26.85%，脂肪族占7.50%；乙醚超聲波提取的沉香精油中已鑒定的化合物占色譜總出峰面積的77.90%，其中芳香族占3.68%，倍半萜類(lèi)占25.78%，色酮類(lèi)占32.83%，脂肪族占11.38%。

2.2.2兩種提取方法對(duì)比 基質(zhì)固相分散提取檢測(cè)出的總化合物的數(shù)量略高于乙醚超聲波提取，增加的成分主要為倍半萜類(lèi)化合物，如γ-芹子烯、β-檀香醇、纈草- 4,7(11)二烯、α-愈創(chuàng)木烯、白菖醇和1,9-馬兜鈴二烯。芹子烯具有泥土或根部的氣味；β-檀香醇呈現(xiàn)典型的檀香木香氣，帶有濃烈的木香和奶香，以及略帶尿的氣味[15]，這些化合物的存在賦予沉香精油更豐富的香氣組成。但2種方法得到的倍半萜類(lèi)化合物的總含量沒(méi)有明顯區(qū)別。在基質(zhì)固相分散提取得到的沉香精油中，相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)小的成分較多，而乙醚超聲波提取得到的沉香精油中，Mr大的成分較多?；|(zhì)固相分散提取沉香精油中色酮類(lèi)和脂肪族化合物總含量較乙醚超聲波提取的精油略低。這可能是由于乙醚超聲波提取的主要溶劑乙醚的極性較低，同時(shí)鑒于超聲波的存在，產(chǎn)生了空化、機(jī)械和熱效應(yīng)，可以有效破壞沉香的細(xì)胞壁，加速乙醚滲透到沉香細(xì)胞中，使得色酮類(lèi)和脂肪族這些Mr大的化合物能更好地傳質(zhì)和溶出[16-17]。

色酮類(lèi)化合物是沉香及沉香精油的主要活性成分，也是品質(zhì)評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。色酮類(lèi)化合物在加熱裂解時(shí)，會(huì)產(chǎn)生苯甲醛和對(duì)甲氧基苯甲醛，可以產(chǎn)生持久的香味[18]，同時(shí)具有多種生物及藥理活性，如神經(jīng)保護(hù)[19]、抗腫瘤細(xì)胞毒[20]、抑制酶活性[21]、抗菌[22]和抗炎[23]等。沉香中色酮類(lèi)化合物主要分為4種類(lèi)型：四氫-2-(2-苯乙基)色酮、環(huán)氧四氫-2-(2-苯乙基)色酮、2-(2-苯乙基)色酮和二環(huán)氧-2-(2-苯乙基)色酮[24]。采用氣相色譜-質(zhì)譜法從基質(zhì)固相分散提取和乙醚超聲波提取的沉香精油共檢測(cè)出4種色酮化合物，分別為2-(2-苯乙基)色酮、6-甲氧基-2-苯乙基色酮、6,7-二甲氧基-2-(苯基乙基)色酮和6,7-二甲氧基-2-[2 -(4′-甲氧基苯基)乙基]色酮。兩種提取方式在色酮類(lèi)化合物的種類(lèi)上沒(méi)有區(qū)別，但是乙醚超聲波提取的色酮類(lèi)化合物含量較基質(zhì)固相分散提取的高。從色酮類(lèi)含量來(lái)看，乙醚超聲波提取較優(yōu)。脂肪族化合物在受到微生物、光、熱和空氣的作用下，容易氧化形成過(guò)氧化物，再分解生成低Mr的酸[25]。從表2的分析來(lái)看，乙醚超聲波提取的脂肪族化合物的含量較基質(zhì)固相分散提取的高。而沉香精油中的脂肪族化合物不是越多越好，脂肪族化合物含量較多時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間的儲(chǔ)存容易使沉香精油發(fā)生酸敗，產(chǎn)生特殊有刺激性的氣味，從而影響沉香精油的品質(zhì)。因此，從一這方面考慮，基質(zhì)固相分散提取較優(yōu)。從精油的化學(xué)組成上來(lái)看，兩種提取方法在主要成分上較一致，主要為芳香族、倍半萜類(lèi)、色酮類(lèi)和脂肪族化合物。相比乙醚超聲波提取，基質(zhì)固相分散提取的沉香精油中倍半萜化合物的組成更為豐富。但是乙醚超聲波提取的沉香精油中色酮類(lèi)化合物和脂肪族化合物的含量較高。因此也很難確定兩種提取方法哪個(gè)更優(yōu)。從提取過(guò)程和得率上來(lái)看，基質(zhì)固相分散提取具有以下優(yōu)點(diǎn)：1) 提取得率較高；2) 提取過(guò)程有機(jī)溶劑的用量少，僅為乙醚超聲提取的五分之一； 3) 提取過(guò)程常溫就可以進(jìn)行，且提取過(guò)程對(duì)化學(xué)成分的破壞小。因此，綜上所述，基質(zhì)固相分散提取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法能夠真實(shí)反映沉香精油的化學(xué)成分，可作為沉香品質(zhì)評(píng)價(jià)的一種快速鑒別方法。

3 結(jié) 論

3.1建立了基質(zhì)固相分散提取沉香精油的方法，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定了最佳工藝條件：硅酸鎂為吸附基質(zhì)，吸附基質(zhì)與樣品質(zhì)量比為4 ∶1，分散溶劑為異丙醇，分散溶劑與樣品的比例為4 ∶1(mL ∶g)，洗脫溶劑為體積比9 ∶1的正己烷和乙酸乙酯混合液，洗脫溶劑用量6 mL。在此條件下，沉香精油的提取得率為(9.19±0.15)%。

3.2采用GC-MS分析了基質(zhì)固相分散提取沉香精油的化學(xué)成分，總共鑒定化合物48種，已鑒定的化合物占色譜總出峰面積的67.04%，其中芳香族占2.13%，倍半萜類(lèi)占25.67%，色酮類(lèi)占26.85%，脂肪族占7.5%，沉香精油化學(xué)成分組成與乙醚超聲波提取得到的相似。

3.3基質(zhì)固相分散提取具有提取得率高，溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法能夠真實(shí)反映沉香精油的化學(xué)成分，可作為沉香品質(zhì)評(píng)價(jià)的一種快速鑒別方法。