竹柏葉中黃酮類(lèi)成分的分離與鑒定

郭 婕， 王 歡， 張 祁， 宋 科

(吉首大學(xué) 林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000)

竹柏(Nageianagi(Thunberg) Kuntze)是羅漢松科竹柏屬植物，多分布于長(zhǎng)江以南各省區(qū)[1]，是常見(jiàn)的園林綠化用樹(shù)種。竹柏中含有黃酮類(lèi)、去甲基二萜雙內(nèi)酯類(lèi)、揮發(fā)油等多種類(lèi)型的活性化合物[2-5]，其中雙黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于松柏綱和銀杏綱等植物中，是由兩分子相同或不同類(lèi)型的黃酮及其衍生物為單元聚合而成的二聚物，在抗腫瘤和治療心血管疾病等方面活性顯著[6-8]。穗花杉雙黃酮是一種在松柏綱植物中分布廣泛的雙黃酮類(lèi)化合物，以卷柏科卷柏屬(Selaginella)植物中含量最高，具有抗炎、抗氧化和抑菌等生理功能，在緩解動(dòng)物應(yīng)激、減少炎癥損傷、提高動(dòng)物抵抗致病菌的能力等方面具有巨大潛力[9-10]，已在醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域有所應(yīng)用[11-12]，有望在畜禽生產(chǎn)中得以開(kāi)發(fā)利用。目前，關(guān)于大孔樹(shù)脂分離純化藥用植物中總黃酮的工藝研究[13-15]屢見(jiàn)報(bào)道，但有關(guān)竹柏總黃酮和其中穗花杉雙黃酮的分離純化工藝卻鮮有報(bào)道。本課題組前期對(duì)竹柏枝葉提取物中的總黃酮進(jìn)行定量研究[16]，結(jié)果顯示竹柏枝葉粗提物中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)13.6%，且各部位有著顯著的差異，葉15.5%>莖10.4%>根8.5%>種子0.15%。在此基礎(chǔ)上，本研究比較了大孔吸附樹(shù)脂和聚酰胺(PLA)樹(shù)脂對(duì)竹柏總黃酮的吸附-解吸性能，確立AB-8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)竹柏總黃酮的分離富集工藝，并進(jìn)一步對(duì)竹柏總黃酮進(jìn)行純化，從竹柏葉正丁醇萃取物中分離得到8個(gè)單體化合物，通過(guò)各種波譜手段鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，以期為竹柏提取物的組成成分和生物活性研究提供參考，為尋找雙黃酮的替代藥源提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料、試劑及儀器

竹柏葉于2014年12月采自湖南省張家界國(guó)家森林公園，由吉首大學(xué)谷伏安副教授鑒定為竹柏(Nageianagi(Thunberg) Kuntze)，50 ℃烘干，粉碎后放入干燥器內(nèi)備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：Y10A6S1，純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：MUST-15012505，純度≥99.05%)，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；色譜甲醇試劑，天津康科德科技有限公司；乙醇(體積分?jǐn)?shù)75%)、石油醚、氯仿、丙酮、正丁醇、甲醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉和硝酸鋁等，均為市售分析純。

ZF-I型三用紫外(UV)分析儀，日本日立公司；Nicolet Is 10型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀，DSQ Ⅱ EI質(zhì)譜(MS)儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；Agilent 1260型高效液相色譜(HPLC)儀，美國(guó)安捷倫科技有限公司；Bruker AVANCE Ⅲ HD 500型核磁共振波譜(NMR)儀(TMS為內(nèi)標(biāo))。

各種規(guī)格的玻璃層析柱，北京欣維爾玻璃儀器有限公司；AB-8大孔吸附樹(shù)脂、D101大孔吸附樹(shù)脂、聚酰胺樹(shù)脂-1號(hào)(PLA-1)和聚酰胺樹(shù)脂-2號(hào)(PLA-2)，鄭州勤實(shí)科技有限公司；硅膠(150～180 μm、48～75 μm和38～48 μm)和GF254薄層層析硅膠，青島海洋化工廠；凝膠SephadexLH-20(40～70 μm)，瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司；反相填充材料YMC*GEL (ODS-A-HG，S-50 μm)，日本YMC株式會(huì)社。

1.2 竹柏葉總黃酮的提取

1.2.1竹柏葉提取物的制備 取干燥的竹柏葉5.0 kg，粉碎，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇超聲波提取5次，合并提取液，減壓濃縮得到浸膏。

1.2.2竹柏葉總黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定 稱(chēng)取干燥的竹柏葉40 g，加入1 000 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇于60 ℃水浴中超聲波提取30 min，提取3次，合并提取液，減壓濃縮至干燥。然后用蒸餾水溶解、過(guò)濾后，配制成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，備用。精確稱(chēng)取經(jīng)105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品21.2 mg，用適量的體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶解，加水定容至50 mL容量瓶中，配制成0.424 g/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品母液。分別量取0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0和1.2 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品母液于10 mL容量瓶中，加入2.0 mL無(wú)水甲醇，搖勻，各加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻后靜置6 min，再分別加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻后靜置6 min，再分別加入4 mL 1 mol/mL氫氧化鈉溶液，搖勻后靜置15 min，加水定容至刻度，搖勻后置于比色皿中，于506 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(C，g/L)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程：A=11.0C+0.024 8(R2=0.999 1)，線性范圍0.013～0.076 g/L[16]。

準(zhǔn)確量取一定量的樣品溶液，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算竹柏葉總黃酮的質(zhì)量濃度。

1.2.3穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定 精確稱(chēng)取穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品2.1 mg，用5.0 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶解，定容至10 mL的容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為0.21 g/L穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品母液，過(guò)0.45 μm濾膜，備用。分別量取0.1、 0.2、 0.4、 0.8、 1.0、 2.0和4.0 mL穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品母液于10 mL的容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇定容至刻度線處，搖勻。采用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件為：色譜柱Kromasil C18柱(4.6×250 mm, 5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)335 nm，柱溫箱35 ℃，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相使用0.2%磷酸緩沖溶液(A)/甲醇(B)進(jìn)行梯度洗脫(0～15 min，40% A；15～30 min，15% A)，記錄標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積，繪制穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中穗花杉雙黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(X，g/L)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程為：Y=678 23X-31.297(R2=0.999 5)，線性范圍0.002 1～0.084 0 g/L。

1.3 樹(shù)脂的篩選

1.3.1靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1吸附率及解吸率的計(jì)算 分別稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理的4種型號(hào)(聚酰胺1號(hào)、聚酰胺2號(hào)、D101，AB-8)的樹(shù)脂各1.0 g(干質(zhì)量)，置于50 mL的錐形瓶中，分別加入總黃酮質(zhì)量濃度為8.78 g/L竹柏乙醇提取液(1.2.2節(jié)中制備)20 mL，密封，置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，靜置后過(guò)濾，測(cè)定溶液中總黃酮和穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度，并按照式(1)～(2)分別計(jì)算吸附量和吸附率。

(1)

(2)

式中：qa—吸附量，mg/g；Ea—吸附率，%；C0—吸附前初始質(zhì)量濃度，g/L；Ce—吸附后的質(zhì)量濃度，g/L；V—吸附液體積，mL；m—樹(shù)脂質(zhì)量，g。

將吸附飽和的4種型號(hào)樹(shù)脂，用一定量的蒸餾水沖洗，抽干，置于50 mL的錐形瓶中，分別加入20 mL 體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，密封，置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，靜置后過(guò)濾，測(cè)定濾液中總黃酮和穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度，并按照式(3)～(4)分別計(jì)算解吸量和解吸率。

(3)

(4)

式中：qd—解吸量，mg/g；Ed—解吸率，%；Cd—解吸液的質(zhì)量濃度，g/L；V—解吸液體積，mL；m—樹(shù)脂質(zhì)量，g。

1.3.1.2上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響 分別稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理的AB-8大孔吸附樹(shù)脂、聚酰胺樹(shù)脂各1.0 g(干質(zhì)量)，置于50 mL的錐形瓶中，分別加入總黃酮質(zhì)量濃度為0.5、 1.0、 1.5、 3.0和4.0 g/L (其中穗花杉雙黃酮質(zhì)量濃度7.15、 12.56、 13.90、 32.36和43.97 mg/L)的樣品溶液20 mL，密封，置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，靜置，過(guò)濾，考察不同上樣溶液質(zhì)量濃度對(duì)竹柏總黃酮吸附量和吸附率的影響。

1.3.1.3洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸效果的影響 將吸附飽和的AB-8大孔吸附樹(shù)脂和聚酰胺樹(shù)脂，用一定量的蒸餾水沖洗除去表面殘留的溶液，抽干，置于50 mL的錐形瓶中，分別加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為50%、 60%、 70%、 80%和90%的乙醇溶液，密封，置于25 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩24 h，靜置后過(guò)濾，考察不同體積分?jǐn)?shù)的洗脫劑對(duì)竹柏總黃酮解吸量和解吸率的影響。

1.3.2動(dòng)態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1吸附流速對(duì)吸附效果的影響 按照1.3.1節(jié)的條件，將200 mL樣品溶液以22、 44 和88 mL/h的吸附流速上樣，每10 mL收集1管流出液，定容，分別測(cè)定流出液中總黃酮和穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度，考察不同吸附流速對(duì)吸附效果的影響。

1.3.2.2上樣量對(duì)吸附效果的影響 按照1.3.1節(jié)的條件，將樹(shù)脂濕法裝柱后，取一定量的樣品溶液以22 mL/h的流速吸附上樣，每10 mL收集1管流出液，定容，分別測(cè)定流出液中總黃酮和穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度。

1.3.2.3洗脫流速對(duì)解吸效果的影響 將吸附飽和的AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱，用蒸餾水沖洗去除表面殘留的溶液，之后將洗脫劑分別以22、 44和88 mL/h的流速解吸，每10 mL收集1管洗脫液，定容，分別測(cè)定洗脫液中總黃酮和穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度。

1.3.2.4洗脫劑用量對(duì)解吸效果的影響 按前述條件將樹(shù)脂柱吸附至飽和，蒸餾水沖洗去除表面殘留的溶液，之后用一定量的洗脫劑以44和88 mL/h的流速洗脫，每10 mL收集1管洗脫液，定容，分別測(cè)定洗脫液中總黃酮和穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度。

1.4 竹柏葉黃酮化合物的純化

將竹柏葉提取物的浸膏加水制成懸浮液后，依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取。得到石油醚萃取部分(20 g)，氯仿萃取部分(30 g)，正丁醇萃取部分(200 g)。將竹柏葉正丁醇萃取物用水溶解、過(guò)濾后，通過(guò)AB-8大孔吸附樹(shù)脂分離，乙醇/水(體積比0 ∶1～1 ∶0)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，經(jīng)硅膠薄層板點(diǎn)樣檢測(cè)劃分得到6部分：Fr.1(20.5 g)，F(xiàn)r.2(26.6 g)，F(xiàn)r.3(36.1 g)，F(xiàn)r.4(42.3 g)，F(xiàn)r.5(30.7 g)，F(xiàn)r.6(19.5 g)。Fr.2組分濃縮后，采用硅膠柱色譜，用氯仿/甲醇梯度洗脫(體積比0 ∶1～1 ∶0)，收集洗脫液流分。經(jīng)薄層層析跟蹤合并從Fr.2組分中得到4個(gè)洗脫部分(Fr.2.1～Fr.2.4)。然后將Fr.2.3用甲醇/水溶液梯度洗脫(體積比7 ∶3～1 ∶1)，分別經(jīng)過(guò)聚酰胺柱層析、凝膠柱層析、ODS反相柱色譜和重結(jié)晶反復(fù)分離純化，收集流分得到化合物1(25 mg)和化合物3(5 mg)。Fr.3組分濃縮后，采用硅膠柱色譜，用氯仿/甲醇溶液梯度洗脫，收集洗脫液流分。經(jīng)薄層層析跟蹤合并從Fr.3組分中得到5個(gè)洗脫部分(Fr.3.1～Fr.3.5)。然后將Fr.3.4用甲醇/水溶液梯度洗脫，分別經(jīng)過(guò)ODS反相柱色譜、凝膠柱層析、重結(jié)晶和制備薄層反復(fù)分離純化，得到化合物2(50 mg)、化合物4(13 mg)和化合物6(4 mg)。Fr.4組分濃縮后，采用硅膠柱色譜，用氯仿/甲醇溶液梯度洗脫，收集洗脫液流分。經(jīng)薄層層析跟蹤合并從Fr.4組分中得到4個(gè)洗脫部分(Fr.4.1～Fr.4.4)。然后將Fr.4.2用甲醇/水溶液梯度洗脫，分別經(jīng)過(guò)制備薄層、重結(jié)晶和ODS反相柱色譜反復(fù)分離純化，得到化合物5(15 mg)、化合物7(6 mg)和化合物8(33 mg)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹(shù)脂的篩選

由表1可知，聚酰胺樹(shù)脂的吸附率明顯高于大孔吸附樹(shù)脂，而大孔吸附樹(shù)脂解吸率明顯優(yōu)于聚酰胺樹(shù)脂。因此，選取吸附率相對(duì)較高的聚酰胺樹(shù)脂(PLA-2)和解吸率較高的AB-8大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行后續(xù)靜態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)研究。

表1 不同樹(shù)脂的靜態(tài)吸附-解吸性能

2.2 樹(shù)脂的靜態(tài)吸附-解吸

2.2.1上樣液質(zhì)量濃度的影響 從表2可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著上樣液質(zhì)量濃度的不斷增加，兩種樹(shù)脂對(duì)竹柏黃酮的吸附率均隨之增大，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為1.5 g/L時(shí)，對(duì)竹柏黃酮的吸附率達(dá)最大值分別為94.88%和90.13%。當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為3.0 g/L時(shí)，穗花杉雙黃酮的吸附率達(dá)到最大，分別為98.57%和94.68%。因此，為了從竹柏中獲取更多的黃酮類(lèi)化合物，選取上樣液質(zhì)量濃度為1.5～3.0 g/L較為適宜。

表2 不同質(zhì)量濃度的溶液對(duì)吸附率的影響

2.2.2洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 由表3可知，兩種樹(shù)脂對(duì)穗花杉雙黃酮的解吸率隨著洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而逐漸變大，當(dāng)洗脫劑體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，繼續(xù)增大洗脫劑體積分?jǐn)?shù)，對(duì)竹柏黃酮的洗脫率減小，因此選取體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇作為洗脫劑較好。

表3 不同濃度洗脫劑對(duì)解吸率的影響

2.3 樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附-解吸

2.3.1上樣流速對(duì)吸附效果的影響 如圖1可知，在上樣量200 mL時(shí)，隨著上樣流速的加快，總黃酮泄露速度加快，分析原因可能是上樣流速過(guò)快導(dǎo)致樹(shù)脂與樣品溶液接觸時(shí)間較短，不利于吸附。因此，選取上樣流速22 mL/h較適宜。

圖1 不同上樣流速對(duì)吸附效果的影響

2.3.2上樣量對(duì)吸附效果的影響 由圖2可知，隨著上樣量的逐漸增加，流出液中總黃酮的質(zhì)量濃度增加，樹(shù)脂吸附效果逐漸下降。當(dāng)上樣量少于200 mL時(shí)，雖然流出液中總黃酮和穗花杉雙黃酮的質(zhì)量濃度均明顯增加，但是大部分的總黃酮仍然能被樹(shù)脂吸附。繼續(xù)加大上樣量至220 mL時(shí)，流出液中總黃酮質(zhì)量濃度接近上樣液質(zhì)量濃度，樹(shù)脂吸附能力明顯降低，表明樹(shù)脂已接近吸附飽和。因此，為減少樣液中總黃酮大量泄露使純化得率降低，選取220 mL為最佳上樣量。

2.3.3洗脫流速對(duì)解吸效果的影響 如圖3可知，在洗脫劑200 mL時(shí)，隨著洗脫流速的加快，樹(shù)脂與洗脫劑接觸時(shí)間較短不利于洗脫，導(dǎo)致解吸率降低。但是，洗脫流速為44 mL/h時(shí)與流速為22 mL/h時(shí)，洗脫效果相差較小。因此，為了提高工作效率，選取洗脫流速為44 mL/h較適宜。

圖3 不同洗脫流速對(duì)解吸效果的影響

2.3.4洗脫劑用量對(duì)解吸效果的影響 由圖4可以看出，隨著洗脫劑用量的逐漸增加，洗脫液中總黃酮的質(zhì)量濃度增加。當(dāng)洗脫劑用量達(dá)到140 mL時(shí)，洗脫液中幾乎檢測(cè)不到總黃酮和穗花杉雙黃酮，表明此時(shí)已接近洗脫極限。因此，為減少溶劑的浪費(fèi)，選取140 mL為最佳洗脫劑用量。

2.3.5驗(yàn)證試驗(yàn) 綜合靜態(tài)吸附-解吸及動(dòng)態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確立了竹柏總黃酮的最佳純化工藝條件為：采用AB-8大孔吸附樹(shù)脂以22 mL/h的流速吸附質(zhì)量濃度為3.0 g/L的竹柏粗提液220 mL，達(dá)到吸附平衡后，用140 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇以44 mL/h的流速進(jìn)行洗脫，測(cè)得在該條件下純化得到的樣品中總黃酮平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.8%，穗花杉雙黃酮的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.37%。

2.4 單體化合物結(jié)構(gòu)表征

化合物1，淺褐色結(jié)晶，分子式為：C15H14O6，經(jīng)薄層色譜展開(kāi)，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱后呈黃棕色斑點(diǎn)，熔點(diǎn)為174～175 ℃。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)：δ4.5(1H，d，J=7.5 Hz, H-2)，3.8(1H, m, H-3)，2.7(1H, dd,J=4.6 Hz, 16.3 Hz, H- 4a)，2.4(1H, dd,J=8.1 Hz, 16.2 Hz, H- 4b)，5.7(1H, d,J=2.2 Hz, H- 6)，5.7(1H, d,J=2.2 Hz, H-8)，6.7(1H, d,J=1.9 Hz, H-2′)，6.6(1H, d,J=8.1 Hz, H-5′)，6.6(1H, dd,J=1.9 Hz, 8.1 Hz, H- 6′)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)：δ81.0(C-2)，66.3(C-3)，28.2(C- 4)，156.3(C-5)，95.2(C- 6)，155.8(C-7)，94.1(C-8)，156.6(C-9)，99.1(C-10)，130.7(C-1′)，114.8(C-2′)，144.9(C-3′)，144.5(C- 4′)，115.1(C-5′)，118.4(C- 6′)。綜合以上理化常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)，且化合物1與兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品共薄層多體系展開(kāi)，呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，并與文獻(xiàn)[17～18]對(duì)照，確定該化合物為兒茶素(catechin)。

化合物2，黃色粉末，分子式為：C15H10O5，經(jīng)薄層色譜展開(kāi)，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱后呈黃色斑點(diǎn)，于365 nm下呈現(xiàn)亮黃色熒光。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)：δ7.9(2H, d,J=8.8 Hz, H-2′, H- 6′)，6.9(2H, d,J=8.8 Hz, H-3′, H-5′)，6.7(1H, s, H-3)，6.0(1H, s, H- 6)，6.3(1H, s, H-8)，12.9(1H, br.s, 5-OH)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)：δ163.1(C-2)，102.5(C-3)，181.1(C- 4)，161.3(C-5)，99.6(C- 6)，163.6(C-7)，94.4(C-8)，157.5(C-9)，105.2(C-10)，121.1(C-1′)，128.2(C-2′, C- 6′)，116.0(C-3′, C-5′)，δ162.4(C- 4′)。綜合以上波譜數(shù)據(jù)，推斷該化合物為5,7,4′-三羥基黃酮，與文獻(xiàn)[19～20]報(bào)道芹菜素的數(shù)據(jù)一致，因此，確定該化合物為芹菜素(apigenin)。

化合物3，白色結(jié)晶，分子式為：C15H14O6，經(jīng)薄層色譜展開(kāi)，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱后呈黃棕色斑點(diǎn)，熔點(diǎn)為244～245 ℃。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)：δ4.7(1H, br.s, H-2)，4.0(1H, m, H-3)，2.7(1H, dd,J=5.3 Hz, 16.4 Hz, H- 4a)，2.5(1H, dd,J=8.1 Hz, 16.1 Hz, H- 4b)，5.7(1H, d,J=2.2 Hz, H- 6)，5.9(1H, d,J=2.1 Hz, H-8)，6.9(1H, d,J=1.5 Hz, H-2′)，6.7(1H, d,J=8.0 Hz, H-5′)，6.6(1H, dd,J=1.7 Hz, 8.2 Hz, H- 6′)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)：δ78.1(C-2)，65.0(C-3)，27.9(C- 4)，156.2(C-5)，95.1(C- 6)，155.4(C-7)，93.9(C-8)，156.5(C-9)，98.5(C-10)，130.6(C-1′)，114.6(C-2′)，144.5(C-3′)，144.5(C- 4′)，115.0(C-5′)，118.0(C- 6′)。綜合以上理化常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)[18, 21]對(duì)照，確定該化合物為表兒茶素(epi-catechin)。

化合物4，淺黃色粉末，分子式為：C21H20O10，經(jīng)薄層色譜展開(kāi)，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱后呈黃色斑點(diǎn)，于365 nm下呈現(xiàn)亮黃色熒光。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)：δ8.0(2H, d,J=8.2 Hz, H-2′, H- 6′)，6.9(2H, d,J=8.2 Hz, H-3′, H-5′)，6.8(1H, s, H-3)，6.3(1H, s, H- 6)，13.2(1H, br.s, 5-OH)，葡萄糖的端基氫為δ4.7(1H, d,J=9.8 Hz, H-1″)，3.2～4.0(6H, m)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)：δ164.0(C-2)，102.5(C-3)，182.1(C- 4)，160.4(C-5)，98.2(C- 6)，161.2(C-7)，104.6(C-8)，156.1(C-9)，104.0(C-10)，121.6(C-1′)，129.0(C-2′, C- 6′)，115.9(C-3′, C- 5′ )，162.8(C- 4′)，葡萄糖：δ73.4(C-1″)，70.9(C-2″)，78.7(C-3″)，70.6(C- 4″)，81.9(C-5″)，61.3(C- 6″)。1H NMR譜與化合物2相比，多了δ4.7(1H, d,J=9.8 Hz)葡萄糖的端基質(zhì)子，推測(cè)該化合物為黃酮碳苷類(lèi)化合物，同時(shí)13C NMR(125MHz, DMSO-d6)中δ104.7也證實(shí)為黃酮碳苷C-8的特征信號(hào)，δ98.2為C- 6的特征信號(hào)；糖端基碳δ73.4，與黃酮氧苷中糖端基碳δ98～112有明顯的差別，根據(jù)δ73.4，70.9，78.7，70.8，81.9，61.3的一組碳信號(hào)，推測(cè)糖基為未被取代的β-D-葡萄糖。綜合以上波譜數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)[22～23]對(duì)照，確定該化合物為芹菜素-8-C-β-D-葡萄糖，即牡荊苷(vitexin)。

化合物5，黃色粉末，分子式為：C27H30O14，經(jīng)薄層色譜展開(kāi)，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱后呈黃色斑點(diǎn)，于365 nm下呈現(xiàn)亮黃色熒光。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)：δ8.1(2H, d,J=8.8 Hz, H-2′, H- 6′)，7.0(2H, d,J=8.7 Hz, H-3′, H-5′)，6.8(1H, s, H-3)，6.2(1H, s, H- 6)，13.1(1H, br.s, 5-OH)，葡萄糖：δ4.8(1H, d,J=10.1 Hz, H-1″)，3.3(1H, m)，3.4(2H, m)，3.5(1H, m)，3.8(1H, m)，4.0(1H, m)，鼠李糖：δ5.0(1H, s, H-1?)，2.0～4.0(4H, m)，0.5(3H, d,J=6.2 Hz)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)：δ164.0(C-2)，103.7(C-3), 182.0(C- 4)，160.7(C-5)，98.1(C- 6)，162.3(C-7)，105.8(C-8)，155.8(C-9)，104.5(C-10)，121.6(C-1′)，129.0(C-2′, 6′)，115.9(C-3′, 5′)，161.2(C- 4′)，葡萄糖：δ71.7(C-1″)，75.0(C-2″)，78.3(C-3″)，70.3(C- 4″)，80.9(C-5″)，61.2(C- 6″)，鼠李糖：δ100.3(C-1?)，70.4(C-2?)，70.1(C-3?)，71.5(C- 4?)，68.2(C-5?)，17.7(C- 6?)。1H NMR譜顯示該化合物母體結(jié)構(gòu)為牡荊苷(化合物4)。根據(jù)1H NMR譜中出現(xiàn)的甲基的質(zhì)子信號(hào)δ0.5(3H, d,J=6.2 Hz)和糖的端基氫信號(hào)δ5.0(1H, s, H-1?)，以及13C NMR譜中一組信號(hào)δ100.3，70.4，70.1，71.5，68.2，17.7，推測(cè)該化合物中還連有α-L-鼠李糖。綜合以上波譜數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)[20,24]對(duì)照，確定該化合物為牡荊苷-2″-O-α-L-鼠李糖，即牡荊苷鼠李糖苷(vitexin rhamnoside)。

化合物6，黃色粉末，分子式為：C30H18O10，經(jīng)薄層色譜展開(kāi)，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱后呈黃色斑點(diǎn)，于365 nm下呈現(xiàn)亮黃色熒光。1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)：δ6.8(1H, s, H-3)，6.5(1H, d,J=2.1 Hz, H- 6)，6.2(1H, d,J=2.1 Hz, H-8)，8.0(1H, br.s, H-2′)，7.16(1H, d,J=8.4 Hz, H-5′)，8.0(1H, d,J=2.4 Hz, 8.5 Hz, H- 6′)，6.8(1H, s, H-3″)，6.4(1H, s, H- 6″)，7.6(2H, d,J=8.8 Hz, H-2?, H- 6?)，6.7(2H, d,J=8.9 Hz, H-3?, H-5?)，13.1(1H, br.s, 5-OH)，13.0(1H, br.s, 5″-OH),10.8(1H, br.s, 7-OH), 10.3(1H, br.s, 7″-OH)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6)：δ164.1(C-2)，103.0(C-3)，182.1(C- 4)，161.9(C-5)，98.8(C- 6)，163.7(C-7)，94.0(C-8)，157.4(C-9)，104.0(C-10)，121.4(C-1′)，131.4(C-2′)，116.1(C-3′)，160.5(C- 4′)，119.9(C-5′)，127.8(C- 6′)，163.8(C-2″)，102.6(C-3″)，181.7(C- 4″)，161.4(C-5″)，98.6(C- 6″)，159.5(C-7″)，103.6(C-8″)，154.5(C-9″)，103.7(C-10″)，120.9(C-1?)，128.2(C-2?, C- 6?)，115.7(C-3?, C-5?)，161.0(C- 4?)。綜合以上理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)品共薄層檢測(cè)，并與文獻(xiàn)[9,25]對(duì)照，且化合物6與穗花杉雙黃酮標(biāo)準(zhǔn)品共薄層多體系展開(kāi)，呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，進(jìn)一步確定該化合物為穗花杉雙黃酮(amentoflavone)。

化合物7，淡黃色粉末，分子式為：C31H20O10，經(jīng)薄層色譜展開(kāi)，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱1min后呈黃色斑點(diǎn)。1H NMR(500MHz, DMSO-d6):δ6.8(1H, s, H-3), 6.2(1H, d,J=2.0 Hz, H- 6), 6.3(1H, d,J=1.6 Hz, H-8), 8.2(1H, d,J=2.1 Hz, H-2′), 7.0(1H, d,J=8.7 Hz, H-5′), 7.9(1H, dd,J=2.3, 8.6 Hz, H- 6′), 6.9(1H, s, H-3″), 6.2(1H, s, H- 6″), 7.8(2H, d,J=8.9 Hz, H-2?, 6?), 6.8(2H, d,J=7.4 Hz, H-3?, 5?), 13.1(1H, br.s, 5-OH), 13.0(1H, br.s, 5″-OH), 3.67(3H, s, 4?-OMe)；13C NMR(125 MHz, DMSO-d6):δ164.0(C-2), 102.6(C-3), 181.7(C- 4), 161.4(C-5), 98.8(C- 6), 164.0(C-7), 94.0(C-8), 157.3(C-9), 103.6(C-10), 119.3(C-1′), 131.4(C-2′), 121.9(C-3′), 162.7(C- 4′), 118.0(C-5′), 127.1(C- 6′), 164.3(C-2″), 103.1(C-3″), 181.8(C- 4″), 160.5(C-5″), 102.5(C- 6″), 162.6(C-7″), 100.4(C-8″), 154.7(C-9″), 105.6(C-10″), 123.2(C-1?), 128.0(C-2?,C- 6?), 114.3(C-3?,C-5?), 162.0(C- 4?), 55.3(4?-OMe)。從HMBC譜可知甲氧基上的氫信號(hào)δ3.7(3H, s)與δ161.9處C- 4?相連，綜合以上波譜數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)[17,26]對(duì)照，確定該化合物為羅漢松雙黃酮A(podocarpus flavone A)。

化合物8，淡黃色粉末，分子式為：C31H20O10，經(jīng)薄層色譜展開(kāi)，置紫外燈254 nm下觀察，有紫外吸收，噴顯色劑(5%濃硫酸-乙醇溶液)加熱1 min后呈黃色斑點(diǎn)。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6):δ6.9(1H, s, H-3), 6.2(1H, d,J=2.8 Hz, H- 6), 6.5(1H, d,J=2.0 Hz, H-8), 8.2(1H, d,J=2.8 Hz, H-2′), 7.2(1H, d,J=8.5 Hz, H-5′), 8.0(1H, dd,J=2.8, 8.8 Hz, H- 6′), 6.8(1H, s, H-3″), 6.4(1H, s, H- 6″), 7.7(2H, d,J=8.9 Hz, H-2?,6?), 6.9(2H, d,J=8.8 Hz, H-3?,5?), 3.8(3H, s, 4′-OMe), 13.1(1H, s, 5-OH), 10.8(1H, s, 7-OH), 13.0(1H, s, 5″-OH), 10.4(1H, s, 7″-OH)；13C NMR(100 MHz, DMSO-d6):δ164.4(C-2), 103.7(C-3), 182.6(C- 4), 159.96(C-5), 99.1(C- 6), 163.7(C-7), 94.5(C-8), 157.8(C-9), 103.7(C-10), 123.4(C-1′), 128.3(C-2′), 121.4(C-3′), 161.9(C- 4′), 116.6(C-5′), 131.8(C- 6′), 164.3(C-2″)，103.4(C-3″), 182.2(C- 4″), 161.0(C-5″), 104.1(C- 6″), 162.7(C-7″), 104.1(C-8″), 155.0(C-9″), 103.4(C-10″), 120.4(C-1?), 128.4(C-2?,C- 6?), 114.9(C-3?,C-5?), 161.0(C- 4?), 55.9(4′-OMe)。綜合以上波譜數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)[26～27]對(duì)照，且化合物8與白果黃素標(biāo)準(zhǔn)品共薄層多體系展開(kāi)，呈現(xiàn)單一斑點(diǎn)，進(jìn)一步確定該化合物為白果黃素(bilobetin)。

通過(guò)對(duì)竹柏葉化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離得到了8個(gè)化合物(化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5)，均為黃酮類(lèi)化合物，其中黃烷類(lèi)化合物2個(gè)(化合物1和3)，黃酮碳苷2個(gè)(化合物4和5)，雙黃酮3個(gè)(化合物6、7、8)和黃酮類(lèi)化合物1個(gè)(化合物2)。除化合物2、6和7外，其他5個(gè)化合物均為首次從竹柏中分離得到，化合物4、5和8為首次從竹柏屬植物中分離得到。

圖5 分離的竹柏葉化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)

3 結(jié) 論

3.1以吸附率和解吸率為指標(biāo)，比較了聚酰胺樹(shù)脂(PLA-1和PLA-2)和大孔吸附樹(shù)脂(AB-8和D101)對(duì)竹柏總黃酮的吸附-解吸性能，結(jié)合靜態(tài)及動(dòng)態(tài)吸附-解吸實(shí)驗(yàn)，得出AB-8大孔樹(shù)脂分離純化竹柏總黃酮的最佳工藝為：上樣液總黃酮質(zhì)量濃度為1.5～3.0 g/L，上樣流速22 mL/h，上樣量220 mL；洗脫劑為體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇，洗脫流速44 mL/h，洗脫劑用量140 mL，竹柏總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從13.6%提高到52.8%，穗花杉雙黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.1%提高到2.37%，較純化前有明顯的提高。

3.2從竹柏枝葉提取物正丁醇萃取部位分離得到8個(gè)黃酮類(lèi)化合物，分別為兒茶素(1)、芹菜素(2)、表兒茶素(3)、牡荊苷(4)、牡荊苷鼠李糖苷(5)、穗花杉雙黃酮(6)、羅漢松雙黃酮A(7)和白果黃素(8)。其中化合物4、5和8為首次從竹柏屬植物中分離得到，這為今后對(duì)竹柏中黃酮類(lèi)化合物的定量研究和定性分析提供了參考依據(jù)。