日糧纖維對(duì)竹鼠生長(zhǎng)及腸道菌群組成的影響

周可心，吳允正，戴益民，董思琦，楊 磊，胡永強(qiáng)，張文韜，張錦華

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045）

竹鼠（Rhizomyidae）在動(dòng)物分類學(xué)上屬于脊椎動(dòng)物亞門、哺乳綱、嚙齒目、竹鼠科、竹鼠屬。竹鼠沒有飲水的習(xí)慣，主要從食物中攝取水分來滿足機(jī)體對(duì)水分的需求。竹鼠是以植食性為主的動(dòng)物，其日糧以竹根、竹莖、芒草根及農(nóng)作物秸稈為主，再輔以大米、米糠、玉米等精料。竹子的化學(xué)成分主要為纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等不易消化的纖維，竹材含水量在45.18%左右[1-2]。因此，竹鼠養(yǎng)殖主要以江西、廣西等豐富的竹資源儲(chǔ)量的區(qū)域?yàn)橹鳎渌貐^(qū)則受到一定限制。在竹鼠養(yǎng)殖業(yè)中，胃腸道疾病是造成竹鼠死亡的主要病因，因此需要重視竹鼠的腸道環(huán)境的健康。腸道菌群能影響宿主腸道的生長(zhǎng)、發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收能力及免疫力，對(duì)腸道和宿主健康至關(guān)重要[3]。腸道菌群會(huì)因生存環(huán)境、年齡、飲食等因素而發(fā)生改變[4-6]。其中，飲食起決定性作用[7]。竹鼠作為植食性動(dòng)物，有較長(zhǎng)的消化道和發(fā)達(dá)的大腸、盲腸。其腸道內(nèi)有大量的微生物，能充分發(fā)揮發(fā)酵作用來消化吸收竹子等難消化的食物[8]。竹鼠日糧的竹莖成分含量發(fā)生變化時(shí)，其腸道菌群也會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體機(jī)能發(fā)生改變。

本試驗(yàn)旨在研究日糧中纖維成分對(duì)竹鼠的生長(zhǎng)及其腸道菌群的影響，進(jìn)而研究竹鼠腸道優(yōu)勢(shì)菌群的組成，為篩選產(chǎn)纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素酶的菌株來源提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為日齡相近、健康狀態(tài)良好、體重（約1 kg）接近的6只中華竹鼠（公、母各半），由宜豐縣一竹鼠養(yǎng)殖示范基地提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

采取單因素隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將6只竹鼠隨機(jī)分為2組。試驗(yàn)組添加含0%竹莖，對(duì)照組投喂40%竹莖，試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Tab.1 Test diet composition and nutritional level(air-dry basis)

試驗(yàn)組竹鼠和對(duì)照組竹鼠分別放于兩個(gè)竹鼠池中喂養(yǎng)。每天飼喂2次（8：00和17：00）。每只成年竹鼠飼料飼喂總量為90 g 左右。試驗(yàn)于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)科院傳染病興趣小組動(dòng)物房進(jìn)行，為期45 d。試驗(yàn)期間，觀察并記錄對(duì)照組和試驗(yàn)組竹鼠的健康狀況、牙齒長(zhǎng)度等。

1.3 樣品采集及檢測(cè)

在試驗(yàn)中，試驗(yàn)組竹鼠分別于第23、37、45 d死亡。將病死竹鼠解剖，截取腸段，取腸道內(nèi)容物于Ep 管中，放于-20 ℃保存，并進(jìn)行編號(hào)為cg、cm、ch。同時(shí)，分別取對(duì)照組竹鼠新鮮糞便放于Ep管中，并編號(hào)為fg、fm、fh。將樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA的V3~V4區(qū)高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。菌群分析采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。將所有樣本序列按照序列間的距離進(jìn)行聚類，然后根據(jù)序列之間的相似性將序列分成不同的操作分類單元（OTU）。基于運(yùn)算分類單元在97%相似水平下進(jìn)行樣品的生物信息統(tǒng)計(jì)分析。利用香農(nóng)（Shannon）指數(shù)、辛普森（Simpson）指數(shù)公式計(jì)算細(xì)菌多樣性，Chao 指數(shù)公式計(jì)算細(xì)菌豐富度，并在各個(gè)水平上對(duì)每組樣品進(jìn)行物種組成和差異性比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧纖維對(duì)竹鼠生長(zhǎng)性能的影響

試驗(yàn)組竹鼠日糧成分缺乏竹莖時(shí)，相繼發(fā)生精神沉郁、四肢無力、進(jìn)食減少、消瘦、糞便偏小偏干等情況，最后死亡。肉眼觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組竹鼠，除上述癥狀之外，試驗(yàn)組竹鼠牙齒平均長(zhǎng)度在2.2 cm左右，對(duì)照組竹鼠牙齒平均長(zhǎng)度1.5 cm左右。解剖病死竹鼠，未見實(shí)質(zhì)器官有明顯病變。

2.2 日糧纖維對(duì)竹鼠腸道菌群多樣性的影響（見表2、圖1、圖2）

表2 各組微生物菌群和多樣性指數(shù)Tab.2 Microbial flora and diversity index in each group

由表2、圖1 可知，香農(nóng)指數(shù)稀釋曲線接近平緩，覆蓋率在99.86%~99.92%，說明對(duì)竹鼠腸道菌群的檢測(cè)比率接近飽和狀況，能覆蓋樣品絕大部分的菌群，數(shù)據(jù)合理。分別在試驗(yàn)第27、37和45 d對(duì)試驗(yàn)組采樣，且每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采樣的數(shù)量為1，因此組內(nèi)差異小，并符合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。試驗(yàn)組、對(duì)照組分別為224 和335 個(gè)運(yùn)算分類單元。各樣品通過樣品測(cè)序序列計(jì)算得到的多樣性指數(shù)中，試驗(yàn)組的香農(nóng)指數(shù)更大，辛普森指數(shù)更小，試驗(yàn)組與對(duì)照組的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)差異不顯著（P>0.05），多樣性相似；各樣品通過測(cè)序序列計(jì)算算得的豐富度指數(shù)中，對(duì)照組的菌群豐富度大、物種豐富度更高，試驗(yàn)組與對(duì)照組的chao和ace指數(shù)差異及顯著（P<0.01），豐富度有明顯變化。為了進(jìn)一步從屬水平上分析試驗(yàn)組和對(duì)照組樣品的菌群多樣性的關(guān)系，因此構(gòu)建維恩圖（Venn）。由圖2可知，兩組共有109個(gè)運(yùn)算分類單元，分別占兩組樣品全部屬的73.65%、65.27%；試驗(yàn)組特有39 個(gè)運(yùn)算分類單元，較對(duì)照組58 個(gè)運(yùn)算分類單元略低。

圖1 基于運(yùn)算分類單元水平的腸道菌群稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve of intestinal microbial flora at OTU level

圖2 基于運(yùn)算分類單元水平的腸道菌群韋恩圖Fig.2 Venn diagram of intestinal microbial flora at OTU level

2.3 日糧纖維對(duì)竹鼠腸道菌群組成的影響（見圖3~圖6）

由圖3、圖4可知，試驗(yàn)組和對(duì)照組竹鼠的6個(gè)腸道中樣品微生物菌落主要由16個(gè)門組成，在合并小于百分之一的區(qū)域內(nèi)。試驗(yàn)組中常見的3個(gè)門為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria），分別占樣品包含的物種總數(shù)目的55.67%、23.32%、8.19%，對(duì)照組中常見的3個(gè)門為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門，分別占樣品包含的物種總數(shù)目的40.80%、33.17%、20.18%。對(duì)兩組樣品物種差異分析表明，當(dāng)竹鼠飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，其腸道微生物組成會(huì)發(fā)生改變。其中，試驗(yàn)組互養(yǎng)菌門（Synergistetes）豐度極顯著高于對(duì)照組（P<0.01），試驗(yàn)組厚壁菌門豐度極顯著高于對(duì)照組（P<0.01），試驗(yàn)組藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）豐度極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），試驗(yàn)組變形菌門豐度顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。當(dāng)竹鼠飲食結(jié)構(gòu)缺少竹莖成分時(shí)，原本優(yōu)勢(shì)的變形菌門、藍(lán)藻菌門豐度降低，而厚壁菌門豐度增加，變?yōu)榇藭r(shí)的優(yōu)勢(shì)菌，其中互養(yǎng)菌門細(xì)菌數(shù)量豐度上升趨勢(shì)最為明顯。

圖3 腸道微生物在門水平上的相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of gut microbiota at phylum level

圖4 腸道微生物門水平上差異檢驗(yàn)Fig.4 Differences in gut microbiota at phylum level

由圖5、圖6可知，在屬水平上對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組的樣品菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在合并小于百分之一的區(qū)域內(nèi)。 試驗(yàn)組中占優(yōu)勢(shì)的菌屬分別為擬桿菌屬（Bacteroides）、斷鏈真桿菌屬（[Eubacterium]_fissicatena_group）、Hungatella，分別占樣品包含的物種總數(shù)量的15.69%、11.20%、9.70%；而對(duì)照組占優(yōu)勢(shì)的菌屬分別為大腸 桿 菌 志 賀 菌 屬（Escherichia-Shigella）、norank_f_Muribaculaceae、Ralstonia，分別占樣品包含的物種總數(shù)量的28.39%、27.69%、8.81%。當(dāng)竹鼠飲食發(fā)生改變時(shí)，腸道的優(yōu)勢(shì)菌屬由變形菌門的大腸桿菌志賀菌屬和Ralstonia變?yōu)楹癖诰T的斷鏈真桿菌屬、Hungatell；同時(shí)，試驗(yàn)組腸道菌群特有Cloacibacillus、Lachnoclostridium、梭桿菌屬（Fusobacterium）等多種菌屬。用student's T檢驗(yàn)對(duì)兩組間差異顯著性分析，由圖6c 可知，試驗(yàn)組norank_f_Muribaculaceae豐度極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），試驗(yàn)組Cloacibacillus豐度極顯著高于對(duì)照組（P<0.01），試驗(yàn)組變形菌門的脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）豐度極顯著高于對(duì)照組（P<0.01），試驗(yàn)組Ralstonia豐度極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），試驗(yàn)組厚壁菌門的八疊球菌屬（Sarcina）豐度顯著低于對(duì)照組（P<0.05），試驗(yàn)組厚壁菌門的考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）豐度顯著高于對(duì)照組（P<0.05），試驗(yàn)組變形菌門的大腸桿菌志賀氏菌屬豐度顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。

圖5 腸道微生物在屬水平上的相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of gut microbiota at genus level

圖6 腸道微生物在屬水平上的差異分析Fig.6 The difference analysis of intestinal microbes at the genus level

3 討論

3.1 日糧纖維對(duì)竹鼠生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)中，觀察到日糧中缺乏竹莖會(huì)導(dǎo)致竹鼠牙齒變長(zhǎng)。竹鼠的門牙在啃食竹莖這種韌性強(qiáng)的食物過程中需不斷摩擦，使得門牙釉質(zhì)能夠發(fā)育成正常的微觀結(jié)構(gòu)，以保持良好的機(jī)械性能，正常的生長(zhǎng)速率和強(qiáng)度[9]。而當(dāng)失去這種韌性強(qiáng)的食物組成時(shí)，竹鼠牙齒的機(jī)械性能下降，門牙生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)大于磨損速度，使得門牙過長(zhǎng)；且水分?jǐn)z取減少會(huì)影響?zhàn)B料的吸收，均會(huì)導(dǎo)致竹鼠無法攝入足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)影響竹鼠的生長(zhǎng)。竹鼠這種嗜纖維的食性使其腸道菌群的組成較為特殊，腸道菌群通過參與宿主體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)和脂肪等營(yíng)養(yǎng)大分子物質(zhì)的代謝，進(jìn)而影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和代謝[10]。當(dāng)日糧缺乏竹莖時(shí)會(huì)造成腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生改變。這種通過腸道菌群變化導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收差異也會(huì)影響竹鼠的生長(zhǎng)。

3.2 日糧纖維對(duì)竹鼠腸道菌群的影響

動(dòng)物腸道菌群的平衡極易受飼養(yǎng)環(huán)境、飲食、自身免疫力等因素的影響，這種平衡一旦被打破，則會(huì)增加腸道疾病發(fā)生的概率[11]。本試驗(yàn)從腸道菌群的角度分析，試驗(yàn)組竹鼠因日糧纖維組成改變導(dǎo)致的生長(zhǎng)受到影響到死亡的原因。從門水平可知，試驗(yàn)組竹鼠厚壁菌門和互養(yǎng)菌門豐度顯著增加。李彥紅[12]報(bào)道，在厭氧消化產(chǎn)甲烷階段，厚壁菌門和擬桿菌門為產(chǎn)甲烷過程的優(yōu)勢(shì)群落，螺旋菌門、互養(yǎng)菌門和綠彎菌門是產(chǎn)甲烷階段的新增菌群。腸道內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)甲烷菌與乙酸生成菌是重要的氫利用菌，兩者同時(shí)存在相互競(jìng)爭(zhēng)[13]，腸道內(nèi)產(chǎn)甲烷菌數(shù)量顯著增加可能對(duì)乙酸生成菌造成影響，乙酸是一種短鏈揮發(fā)性脂肪酸，乙酸進(jìn)入細(xì)胞會(huì)解離出氫離子，乙酸生成量減少，可能會(huì)導(dǎo)致腸道pH值上升，利于條件致病的生長(zhǎng)。

從屬水平上，試驗(yàn)組竹鼠腸道內(nèi)變形菌門的脫硫弧菌屬數(shù)量呈上升趨勢(shì)。丁俊榮等[14]報(bào)道，腸道中脫硫弧菌屬的數(shù)量增加，會(huì)使硫化氫的數(shù)量增加。內(nèi)源性的硫化氫會(huì)對(duì)腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，阻礙結(jié)腸細(xì)胞對(duì)丁酸鹽氧化途徑，引發(fā)細(xì)胞凋亡和慢性炎癥。與對(duì)照組竹鼠相比，試驗(yàn)組竹鼠腸道內(nèi)新增梭桿菌屬等多種菌屬；極少出現(xiàn)在人腸道菌群中的梭桿菌在腸癌患者腸道中活躍[15]。李菁等[16]研究發(fā)現(xiàn)，具核梭桿菌在小鼠腸道內(nèi)定植會(huì)使腸道菌群失衡和調(diào)控腸黏膜腫瘤相關(guān)免疫因子表達(dá)等方面促進(jìn)小鼠結(jié)腸腫瘤發(fā)生。從腸道菌群生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性來看，物種之間的相關(guān)性越緊密越復(fù)雜，菌群結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，其功能也越健全，日糧組成結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致竹鼠腸道微生物組成發(fā)生變化，從而影響竹鼠腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，可能是誘導(dǎo)竹鼠腸道產(chǎn)生慢性炎癥甚至死亡的主要因素之一。

3.3 竹鼠腸道菌群分析對(duì)畜牧業(yè)的實(shí)踐意義

竹鼠是一種以竹子、芒草、植物莖稈等為食的植食性動(dòng)物，與大熊貓食性相似，竹鼠每日也必須進(jìn)食富含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等的食物來維持營(yíng)養(yǎng)需要。而動(dòng)物的日糧組成會(huì)對(duì)動(dòng)物腸道菌群起決定性作用。趙夢(mèng)迪等[17]研究發(fā)現(xiàn)，湖羊瘤胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群均為擬桿菌門和厚壁菌門。羅亞等[18]研究表明，大熊貓以高纖維的竹子為主食，其腸道中也檢測(cè)到大量厚壁菌門，且厚壁菌門占大熊貓腸道細(xì)菌總量的78%以上。厚壁菌門是動(dòng)物腸道中主要的纖維素分解菌，能夠降解纖維轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸供宿主使用[19]。目前，已從大熊貓腸道內(nèi)分離鑒定到多株纖維素降解菌，并有作為益生菌的潛能[20-24]。纖維素降解菌產(chǎn)生的纖維素酶可將纖維素降解成還原糖，還原糖可作為生成乙醇、丙酮的原料。利用這一原理，可將纖維素降解菌應(yīng)用到飼料工業(yè)中，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)纖維素的消化和吸收，同時(shí)增加體內(nèi)纖維素酶的含量。寧俊平[25]、曹曉燕等[26]均從竹鼠腸道中分離到纖維素降解菌，且都有良好的降解纖維素的能力。Wongwilaiwalin 等[27]報(bào)道，降解木質(zhì)纖維素的微生物主要由擬桿菌門和厚壁菌門下的菌屬組成；試驗(yàn)組厚壁菌門的八疊球菌相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組。

Ranganathan等[28]在小鼠的臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，每天服用八疊球菌的患病小鼠，其血液中的尿素氮水平會(huì)顯著下降，患病小鼠的生存時(shí)間也會(huì)顯著延長(zhǎng)，可見八疊球菌對(duì)竹鼠腸道健康有一定的益生作用。Lagkouvardos等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠腸道微生物群中，擬桿菌門的Muribaculaceae占主導(dǎo)地位，但由于它們直到最近才被培養(yǎng)出來，其與宿主之間的相互作用還尚未明確，有待試驗(yàn)的進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)通過16S rDNA高通量測(cè)序?qū)χ袷竽c道菌群分析發(fā)現(xiàn)，正常竹鼠擬桿菌門下的norank_f_Muribaculaceae豐度極顯著高于試驗(yàn)組，從而推測(cè)norank_f_Muribaculaceae可能對(duì)竹鼠腸道降解木質(zhì)纖維素、對(duì)纖維素的消化和吸收起重要作用。

4 結(jié)論

飼糧中缺乏竹莖成分會(huì)影響竹鼠牙齒生長(zhǎng)和腸道菌群的組成，主要體現(xiàn)在竹鼠腸道菌群多樣性降低，有害菌脫硫弧菌屬、梭桿菌屬等相對(duì)豐度的增加，從而破壞竹鼠腸道菌群的平衡，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入。

通過對(duì)竹鼠嗜竹纖維特殊食性研究，結(jié)合有同樣食性大熊貓腸道菌群的報(bào)道，本試驗(yàn)對(duì)比有無竹莖飼養(yǎng)竹鼠后腸道菌群組成差異分析，結(jié)果顯示Muribaculaceae可能對(duì)竹鼠腸道纖維素的消化和吸收起重要作用，該結(jié)果將為竹纖維在畜牧業(yè)健康養(yǎng)殖中的利用提供參考。