肉雞源沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性分析

吉尚雷 ，劉 欣 ，2，劉立英 ，侯春雪 ，2，萬 玲 *

（1. 遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧營口115009；2. 北京大偉嘉生物技術(shù)股份有限公司，北京100085）

雞白痢沙門氏菌病最易感染3 周齡內(nèi)的雛雞，能夠引起雛雞排白色稀糞，因呼吸困難或急性敗血癥而死亡，病死率較高[1-2]。成年雞主要感染生殖系統(tǒng)[3]，導(dǎo)致產(chǎn)蛋率下降、種蛋的受精率、孵化率及健雛率降低，嚴(yán)重時可引起死亡。雞白痢沙門氏菌病可進(jìn)行水平傳播，也可通過種雞蛋垂直傳播[4]。近年來，雞白痢沙門氏菌的防控措施已經(jīng)十分完善，發(fā)病情況呈下降趨勢。但是，由于抗生素使用的不規(guī)范，導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)，不同地區(qū)耐藥性不盡相同，嚴(yán)重影響?zhàn)B雞業(yè)的健康發(fā)展[5-6]。

2019年9月至12月，從遼南地區(qū)多家疑似感染雞白痢沙門氏菌的肉雞養(yǎng)殖場采集樣品進(jìn)行實驗室檢測，分離得到1株細(xì)菌，通過病原分離鑒定確定為沙門氏菌，并進(jìn)行藥敏試驗，為該病的有效防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料

病料采自遼南地區(qū)某肉雞場10日齡發(fā)病雛雞的小腸、肝臟組織。

1.1.2 試驗試劑

HE 瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）購自青島海博生物技術(shù)有限公司；藥敏試紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；染色液及其他常規(guī)試劑由遼寧動物健康養(yǎng)殖研究中心實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無菌操作分別采集病雛雞的小腸、肝臟組織1 g，加入到10 mL 亞硒酸鹽胱氨酸增菌液中，37 ℃培養(yǎng)12 h，用于沙門氏菌選擇性增菌培養(yǎng)。用接種環(huán)蘸取菌液并在HE瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 細(xì)菌生化試驗

挑取單個菌落，接種于生化反應(yīng)管中，37 ℃孵育48 h后觀察結(jié)果。

1.2.3 PCR反應(yīng)

按照DNA 提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA，采用已發(fā)表的16S rRNA 通用引物，引物序列為：8F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1540R：5'-AAGGAGG TGATCCAGCCGCA-3'，對分離菌株 16S rRNA 基因進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增DNA片段大小約為1 500 bp。

PCR 反應(yīng)體系30 μL：2×PCR Mix 3.0 15 μL、DNA 模板2 μL、上下游引物各2 μL、無菌水9 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃、10 min，變性94 ℃、5min，退火55 ℃、1 min，延伸72℃、1 min，35個循環(huán)，最后延伸72 ℃、10 min。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，PCR 產(chǎn)物測序后在Gen Bank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對，進(jìn)一步確定分離菌株的種類。

1.2.4 藥敏試驗

采用紙片擴(kuò)散法測定分離株對各藥物的敏感性。挑取將純培養(yǎng)的菌落放入營養(yǎng)肉湯中增菌，均勻涂布于培養(yǎng)基表面，在培養(yǎng)基表面放置藥物紙片，紙片之間距離2 cm，37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑大小，判定對不同藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與染色鏡檢結(jié)果（見圖1、圖2）

由圖1 可知，在病死雞的腸道分離到一株細(xì)菌，在HE瓊脂培養(yǎng)基上長出黑色菌落。

圖1 分離菌在HE瓊脂生長特性Fig.1 Growth morphology of isolate on HE medium

由圖2 可知，革蘭氏染色鏡檢可見兩端鈍圓的紅色短小陰性桿菌，初步鑒定為沙門氏菌。

圖2 分離菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.2 Morphology of isolate under the microscope

2.2 細(xì)菌生化試驗結(jié)果

分離菌株可以發(fā)酵葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇，不發(fā)酵乳糖、蔗糖、麥芽糖。吲哚試驗和V-P試驗呈陰性反應(yīng)，甲基紅試驗為陽性，符合沙門氏菌的生化特性。

2.3 分離菌PCR鑒定結(jié)果（見圖3）

由圖3 可知，提取分離菌基因組DNA 作為模板，利用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[7]，電泳檢測目的條帶大小與預(yù)期一致。測序后獲得目的片段大小為1 448 bp，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對，結(jié)果顯示分離菌株與基因庫收錄的其他沙門氏菌菌株序列同源性在98%以上，確定分離菌株為沙門氏菌。

圖3 細(xì)菌PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The PCR result of isolated strain

2.4 分離菌藥敏試驗結(jié)果（見表1）

由表1可知，該菌株對阿米卡星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星高度敏感；對慶大霉素、卡那霉素、硫酸新霉素、四環(huán)素中度敏感；對青霉素、氨芐西林、萬古霉素、克林霉素耐藥。

表1 分離菌藥敏試驗結(jié)果Tab.1 Drug susceptibility test results of isolated strain

3 討論

沙門氏菌是1種人畜共患的細(xì)菌性疾病，約有2 500種血清型[8]。在世界范圍內(nèi)，人類因食用含有沙門氏菌的禽類食品而引起中毒的事件時有發(fā)生[9]。對家禽產(chǎn)業(yè)影響最嚴(yán)重的是雞白痢沙門氏菌[10]。目前，針對沙門氏菌，凈化是最普遍的技術(shù)手段[11]。在歐洲，主要通過綜合控制養(yǎng)殖場、屠宰場和食品加工廠，實施畜禽監(jiān)控、淘汰感染動物等一系列具體措施，來減少養(yǎng)殖業(yè)中的沙門氏菌[12]。受養(yǎng)殖規(guī)模、養(yǎng)殖品種、飼養(yǎng)管理、環(huán)境變化、免疫選擇等多種因素影響，我國家禽沙門氏菌病年年發(fā)生[13]。遼南地區(qū)養(yǎng)雞業(yè)在全省占有較大比重，散養(yǎng)戶和中小型養(yǎng)殖場占較大比重。部分養(yǎng)殖戶為降低成本、增加利潤，大量使用抗生素，導(dǎo)致雞白痢沙門氏菌不斷變異產(chǎn)生耐藥株。

本試驗對遼南地區(qū)疑似雞白痢沙門氏菌感染的病死雛雞進(jìn)行檢測，最終確定分離菌為雞白痢沙門氏菌。本研究利用12 種抗生素進(jìn)行藥敏試驗，分離細(xì)菌對阿米卡星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星高度敏感；對慶大霉素、卡那霉素、硫酸新霉素、四環(huán)素中度敏感；對青霉素、氨芐西林、萬古霉素、克林霉素耐藥。不同地區(qū)分離出的沙門氏菌耐藥性不盡相同，可能與抗生素的種類、使用方法、藥濃度、使用次數(shù)等有關(guān)[14]。因此，臨床上應(yīng)該根據(jù)藥敏試驗結(jié)果篩選的高度敏感藥物進(jìn)行治療，并且制定科學(xué)合理的藥物使用制度，避免耐藥菌株的產(chǎn)生[15]。

4 結(jié)論

從遼南地區(qū)某肉雞場發(fā)病雛雞中成功分離、鑒定1 株雞白痢沙門氏菌。該菌株對青霉素、氨芐西林、萬古霉素、克林霉素耐藥；對阿米卡星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星高度敏感。本試驗為遼南地區(qū)雞白痢沙門氏菌的分布和耐藥性變遷提供參考。