基于高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法的苦杏仁與桃仁化學(xué)成分差異研究

周 熙，謝 斌，黃曉蘭，羅輝泰，黃 芳，謝夢婷，吳惠勤

(廣東省科學(xué)院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心)，廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東省中藥質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070)

苦杏仁是薔薇科杏屬植物山杏(PrunusarmeniacaL.varansuMaxim.)、西伯利亞杏(PrunussibiricaL.)、東北杏(Prunusmandshurica(Maxim.Koehne))或杏(PrunusarmeniacaL.)的干燥成熟種子，具有降氣止咳平喘、潤腸通便的功效[1-2]。桃仁是薔薇科櫻桃屬植物桃Prunuspersica(L.) Batsch或山桃Prunusdavidiana(Carr.)Franch.的干燥成熟種子，具有活血祛瘀、潤腸通便和止咳平喘的功效[1,3]?？嘈尤逝c桃仁在外形上十分相似，尤其是經(jīng)脫皮、炮制加工后更難區(qū)分，實際應(yīng)用中常被混淆使用。由于苦杏仁的價格相對較低，市場上常出現(xiàn)桃仁中摻入苦杏仁的問題[4-5]。但兩種藥材的臨床功效不同，藥材摻假可影響臨床效果。

目前，區(qū)分桃仁與苦杏仁藥材主要采用眼看、 手摸、鼻聞、口嘗等傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別方法[6-9]，存在主觀性強(qiáng)的缺點。DNA測序技術(shù)也較多地應(yīng)用于桃仁與苦杏仁的鑒別[10-11]，但相關(guān)技術(shù)操作復(fù)雜，較難推廣。

化學(xué)模式識別方法通過統(tǒng)計分析方法，比較研究不同物種、不同基因類型或不同生態(tài)類型植物的化學(xué)成分，根據(jù)定性、定量分析結(jié)果找出差異代謝物，廣泛應(yīng)用于藥材鑒別及質(zhì)量評價[12-13]、中藥炮制機(jī)制[14-15]、天然藥物開發(fā)[16]等方面。其中，高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-Q-TOF MS)是研究中藥中小分子代謝物的主要技術(shù)之一。利用HPLC-Q-TOF MS技術(shù)的高分辨率、高靈敏度的定性能力和強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)表征能力，可對植物化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。同時結(jié)合化學(xué)模式識別方法，可快速尋找化學(xué)標(biāo)志物。目前，苦杏仁與桃仁的化學(xué)成分差異研究尚未見報道。本文采用HPLC-Q-TOF MS技術(shù)結(jié)合化學(xué)模式識別方法研究了苦杏仁與桃仁的化學(xué)成分差異，可為苦杏仁與桃仁的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制、真?zhèn)舞b別等提供科學(xué)參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

1290 UPLC-6540 Q-TOF MS儀，配置電噴霧離子源、MassHunter 8.0工作站(美國Agilent公司)；賽多利斯 TP-114電子天平(美國Sartorious公司)；KQ2200型臺式機(jī)械超聲波清洗器(東莞市超聲波設(shè)備有限公司)。α-亞油酸、棕櫚酸、油酸(純度均>98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Sigma公司)。8批次苦杏仁與9批次桃仁藥材購自廣州市清平藥材市場。

1.2 樣品制備

苦杏仁與桃仁藥材粉碎過篩后，精密稱取0.5 g于50 mL錐形瓶中，加入10 mL甲醇，稱重，超聲30 min，甲醇補(bǔ)重，搖勻，靜置后以12 000 r/min離心10 min，取上清液待測。質(zhì)控(QC)樣本由制備的樣本各取100 μL混合制得。

對照品：α-亞油酸、棕櫚酸、油酸各取適量溶于甲醇，用甲醇稀釋至50 mg/L。

1.3 色譜條件

色譜柱為Agilent SB-C18(150 mm×3.0 mm,2.7 μm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)與乙腈(B)；梯度洗脫：0～2 min，2% B;2～20 min,2%～40% B;20～30 min,40%～90% B;30～45 min,90% B;45.1～50 min,90%～2% B；流速為0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量：正離子模式5 μL，負(fù)離子模式2 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

Agilent Dual AJS ESI離子源，正、負(fù)離子掃描；干燥氣(N2)溫度為350 ℃；霧化氣(N2)壓力為2.41×105Pa；干燥氣(N2)流量為8 L/min；鞘氣溫度為350 ℃；鞘氣流量為11 L/min；電噴霧電壓為3 500 V；毛細(xì)管出口電壓為150 V；錐孔電壓為65 V；八極桿電壓為750 V；掃描范圍為m/z100～1 000；碰撞能為10、20、40 eV。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1化學(xué)成分定性分析通過一級精確質(zhì)量數(shù)、二級碎片裂解規(guī)律以及文獻(xiàn)報道的化學(xué)成分，同時結(jié)合PubChem與Mass Bank在線質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫、安捷倫中藥化合物數(shù)據(jù)庫(Agilent TCM PCDL Database)以及對照品對化合物進(jìn)行確證。

1.5.2差異化合物分析利用Profinder軟件進(jìn)行預(yù)處理，包括峰提取、去噪音與峰對齊，得到包含保留時間、質(zhì)量數(shù)和峰強(qiáng)度的三維數(shù)據(jù)矩陣。將該數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計分析，包括主成分分析(PCA)與正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)，同時利用SPSS軟件進(jìn)行T檢驗以及倍數(shù)差異(Fold change,FC)分析，尋找差異化合物。

2 結(jié)果與討論

2.1 苦杏仁與桃仁的化學(xué)成分

按照“1.3”與“1.4”的色譜和質(zhì)譜條件對苦杏仁與桃仁樣品進(jìn)行分析，其正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖1。對色譜圖中各色譜峰進(jìn)行精確質(zhì)量數(shù)識別。通過分子離子峰精確質(zhì)量數(shù)、二級譜圖等信息，結(jié)合文獻(xiàn)與化合物數(shù)據(jù)庫，對樣品中29個成分進(jìn)行了鑒定(表1)。結(jié)果表明，苦杏仁與桃仁的化學(xué)成分相似，主要化學(xué)成分種類在兩種藥材中未發(fā)現(xiàn)差別，均存在于苦杏仁與桃仁中。但化合物含量存在一定差異。鑒定的29種化學(xué)成分主要包括糖苷類(8個)、氨基酸類(6個)、有機(jī)酸類(9個)、其他(6個)。其中，苦杏仁苷、野黑櫻苷、扁桃酸酰胺-β-龍膽二糖苷、扁桃酸-β-龍膽二糖苷、扁桃酸-β-D-吡喃葡萄糖苷、芐基-β-龍膽二糖苷等糖苷類化合物是苦杏仁與桃仁主要的難揮發(fā)化學(xué)成分。丙基-β-龍膽二糖苷首次在苦杏仁與桃仁中鑒定。

表1 苦杏仁與桃仁化學(xué)成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)及鑒定結(jié)果Table 1 Mass spectrometric data and the identification results of constituents in Armeniacae Amarum Semen and Persicae Semen

2.2 差異化學(xué)成分分析

PCA是一種無監(jiān)督的模式識別方式，利用降維算法，將多個指標(biāo)轉(zhuǎn)化為較少的n個指標(biāo)，能夠真實反映原始數(shù)據(jù)的分組情況。采用SIMCA-P軟件PCA模式對苦杏仁與桃仁的化學(xué)成分進(jìn)行分析(如圖2)。結(jié)果顯示，QC樣品聚集明顯，說明儀器和方法穩(wěn)定性良好。PCA模型中，苦杏仁與桃仁可沿t[1]軸分開，說明2種藥材的化學(xué)成分有明顯差異。負(fù)離子模式下，1個樣品超出PCA空間，可能原因是該樣品與其他樣品的來源差異較大。不同產(chǎn)地苦杏仁的化學(xué)成分具有較大差別[19]。

OPLS-DA作為一種有監(jiān)督的模式識別方法，將正交信號校正方法與偏最小二乘法結(jié)合，通過識別并去除自變量X中與分類變量Y無關(guān)的信息，使得分類信息主要集中在1個主成分中，建立高效、穩(wěn)定的預(yù)測模型，有助于篩選差異變量[20]。為進(jìn)一步找出2種中藥材的差異成分，利用OPLS-DA對2組樣品進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3。正、負(fù)離子模式下，苦杏仁與桃仁可沿t[1]軸分開，差異化合物明顯。R2X(cum)分別為0.815和0.783，R2Y(cum)分別為0.999和0.992。Q2(cum)分別為0.982和0.984，表明模型的可預(yù)測準(zhǔn)確程度分別為98.2%與98.4%，模型良好。根據(jù)變量投影重要性(Variable importance in projection,VIP)>1及T檢驗中P<0.05 的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異化合物。離子強(qiáng)度差異分析是篩查差異化合物的重要方法[12]。對OPLS-DA篩查的差異化學(xué)成分的離子強(qiáng)度FC值進(jìn)行分析，F(xiàn)C值越接近1，說明其差異越小，F(xiàn)C值偏離1越大，說明其差異越明顯。如表2所示，OPLS-DA模型共篩查出15個差異化學(xué)成分，主要包括糖苷類(丙基-β-龍膽二糖苷、扁桃酸-β-龍膽二糖苷、扁桃酸酰胺-β-D-吡喃葡萄糖苷、苦杏仁苷)、氨基酸(天冬酰胺、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)與脂肪酸(α-亞油酸、油酸、(9Z,11E)-13-Oxooctadeca-9,11-dienoic acid)3類化合物。其中，除天冬酰胺、葡萄糖酸、脯氨酸、扁桃酸酰胺-β-D-吡喃葡萄糖苷、色氨酸等化合物外，其他差異成分在苦杏仁中的含量均較高。

表2 苦杏仁與桃仁的差異化學(xué)成分Table 2 Differential compounds between Armeniacae Amarum Semen and Persicae Semen

OPLS-DA模型中，苦杏仁苷對分類貢獻(xiàn)最大(VIP=3.70)。苦杏仁苷含量在苦杏仁中顯著高于桃仁(P<0.05)。作為苦杏仁與桃仁的特征性成分，《中國藥典》規(guī)定苦杏仁中苦杏仁苷的含量不得低于2.4%，桃仁中苦杏仁苷的含量不得低于2.0%[1]。與本實驗結(jié)果一致。在響應(yīng)差異分析中，苦杏仁苷的FC值為0.77，說明其含量差異較小。若桃仁中摻雜一部分苦杏仁，其濃度變化可能不明顯。因此，苦杏仁苷作為鑒別桃仁中摻雜苦杏仁的潛在可能較小。15個差異化合物中僅丙基-β-龍膽二糖苷的含量差異超過10倍(FC=0.03)。說明苦杏仁中丙基-β-龍膽二糖苷的含量遠(yuǎn)高于桃仁，該化合物可作為潛在的化學(xué)標(biāo)志物用于區(qū)分苦杏仁與桃仁2種中藥材以及苦杏仁對桃仁的摻混檢測。

鑒定的6種氨基酸化合物中有5種在苦杏仁與桃仁中存在顯著差異(P<0.05)，推測氨基酸類化合物在2種藥材中的代謝存在差異。苦杏仁與桃仁均為植物的成熟種子，油脂類成分是其發(fā)揮藥理活性的主要成分之一。其中，游離脂肪酸是植物油脂的重要組成部分。3種脂肪酸類化合物的含量在苦杏仁與桃仁中具有顯著差異(P<0.05)，且其FC值為0.12～0.16，差異較大，說明苦杏仁與桃仁中的游離脂肪酸含量可能具有顯著差異。由于HPLC-Q-TOF MS對油脂類化合物的響應(yīng)較低，檢測到的差異油脂類化合物較少，需在后續(xù)對苦杏仁與桃仁的油脂成分進(jìn)一步分析。

3 結(jié) 論

本研究利用HPLC-Q-TOF MS技術(shù)鑒定了苦杏仁與桃仁中的29個共有成分。苦杏仁苷、野黑櫻苷、扁桃酸酰胺-β-龍膽二糖苷、扁桃酸-β-龍膽二糖苷、扁桃酸-β-D-吡喃葡萄糖苷、芐基-β-龍膽二糖苷等糖苷類化合物是苦杏仁與桃仁主要的難揮發(fā)化學(xué)成分。結(jié)合PCA與OPLS-DA化學(xué)模式識別技術(shù)，在2種藥材中篩查到15個具有顯著差異的化學(xué)成分。結(jié)果表明，糖苷類、氨基酸類與脂肪酸類等3類化合物的含量在苦杏仁與桃仁中具有顯著差異，丙基-β-龍膽二糖苷可作為潛在的化學(xué)標(biāo)志物用于區(qū)分苦杏仁與桃仁。該文為苦杏仁與桃仁的物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)志物研究提供了科學(xué)依據(jù)。