竹節(jié)香附素A對耐奧沙利鉑腸癌細胞株的作用及機制研究*

孟春芹,劉先勇

(南京醫(yī)科大學附屬江寧醫(yī)院中西醫(yī)結合科,南京 211100)

腫瘤細胞耐藥包括原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥。多數細胞耐藥為獲得性耐藥，是在臨床抗腫瘤藥物治療過程中誘導而逐漸產生的。其發(fā)生機制十分復雜，故目前仍無有效逆轉方法。目前，化療已成為大腸癌綜合治療中常用并且有效的方法。然而，隨著現代化療藥物種類的增加，使用頻次的增多、時間的延長，導致許多腸癌細胞產生耐藥，使臨床中化療效果大大降低，所以，尋找新的天然抗腫瘤藥物迫在眉睫。本課題組的前期實驗已經證實，竹節(jié)香附素A(RA)能夠抑制人結腸癌細胞株HCT116、HT29的增殖[1-2]。本實驗旨在探索RA能否逆轉HCT116/L-OHP對奧沙利鉑的耐藥性，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RPMI-1640細胞培養(yǎng)基(含雙抗)及胎牛血清(FBS)購自美國Hycolon公司；RA購自中國藥品生物制品檢定所，批號：141113； 奧沙利鉑購自美侖生物，批號：O0801AS；四甲基偶氮唑藍(MTT)購自美國Sigma 公司，批號：M2128；Annexin-V/PI凋亡試劑盒購自美國BD公司，批號為556547；逆轉錄試劑盒TaKaRa DDR037A、Power SYBR Green購自日本TaKaRa公司；β-actin、caspsae-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、P-gp、IκB-α、p65一抗及二抗，購自美國CST公司。

1.2 細胞株及培養(yǎng)

人結腸癌耐藥細胞株HCT116/L-OHP購自上海博谷生物公司；細胞培養(yǎng)于含10% FBS的RPMI1640及培養(yǎng)基中，并用低濃度奧沙利鉑(12.5 μg/mL)維持，置于37 ℃，含95% 空氣、5% CO2、完全飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于實驗前兩周停用奧沙利鉑。

1.3 MTT實驗檢測細胞存活率

(1)分別取對數生長期的HCT116、HCT116/L-OHP細胞株，以6 000、8 000/孔接種于96孔板中，每組設6個副孔，培養(yǎng)24 h。加入不同濃度的RA(1、2、4、8 μmol/L)和奧沙利鉑(12.5、25、50、100、200、400 μg/mL)培養(yǎng)24 h，再加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL/孔。繼續(xù)孵育4 h后棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，避光振蕩5～10 min，酶標儀490 nm處測吸光度(OD)。抑制率=1-實驗組OD/對照組OD×100%，重復檢測3次，分別計算兩組細胞的半數抑菌濃度(IC50)，計算耐藥指數；并確定RA對HCT116/L-OHP的無毒劑量(IC10)。(2)按上述步驟將HCT116/L-OHP種植于96孔板，分為空白組、奧沙利鉑組、奧沙利鉑聯合RA組(聯合組)，培養(yǎng)24 h后空白組加入不含藥物的培養(yǎng)基、奧沙利鉑組加入不同濃度的奧沙利鉑(25、50、100、200、400 μg/mL)，聯合組于不同濃度的奧沙利鉑組加入IC10的RA，實驗步驟同上，分別計算細胞增殖抑制率。后續(xù)實驗中僅選取聯合IC50的奧沙利鉑進行研究。

1.4 流式細胞術檢測凋亡率

HCT116/L-OHP細胞種植于6孔板中培養(yǎng)24 h，空白組加入完全培養(yǎng)基，奧沙利鉑組中僅加入奧沙利鉑，聯合組中加入IC10的RA及奧沙利鉑。繼續(xù)孵育24 h，收集各組細胞，PBS沖洗后重懸于500 μL Binding Buffer中，分別加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，避光振蕩10 min后上機進行檢測。

1.5 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)

各組細胞處理終止后，收集細胞，先后用 TRIzol、氯仿提取細胞總RNA，用紫外分光光度計測量RNA的濃度，然后保存于-80 ℃冰箱備用。根據TaKaRa逆轉錄試劑盒進行操作上樣，最后用ABI7900實時熒光定量PCR儀進行反應。采用 2-ΔΔCt 法進行結果分析，將各組相對表達水平(RQ，RQ=2-ΔΔCt)值進行比較。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因(內參為β-actin),△△Ct=△Ct實驗組-△Ct空白組。

1.6 蛋白質免疫印跡(WB)檢測相關蛋白表達

各組細胞處理終止后，收集細胞總蛋白。采用Bradford法(BCA)測定各樣本蛋白濃度。每組取20～30 μg上樣，分別用12%、10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，用濕轉法轉膜。轉膜完成后5%牛血清清蛋白(BSA)室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜10 min×3 次后，二抗室溫孵育 1 h。TBST再次洗膜10 min×3 次后使用化學發(fā)光成像儀進行條帶分析。β-actin作為上樣量參照。

1.7 免疫熒光實驗

取對數生長期的HCT116/L-OHP細胞，接種于置有無菌蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24 h，處理后收集各組爬片細胞進行固定、破膜、封閉、抗體孵育，最后滴加含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察目的蛋白。

表1 RT-PCR檢測相關基因引物序列

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 奧沙利鉑、RA對HCT116、HCT116/L-OHP細胞增殖的影響

(1)不同濃度奧沙利鉑分別作用于HCT116、HCT116/L-OHP細胞24 h，其抑制率隨著濃度增加而增加，呈現濃度依賴性(圖1A)。奧沙利鉑對HCT116細胞株的半數抑制濃度(IC50)為17.01 μg/mL，而對HCT116/L-OHP細胞株則為234.38 μg/mL，耐藥指數為13.78。(2)不同濃度RA作用于HCT116/L-OHP細胞株后，其抑制率逐漸增加(圖1B)，一般IC10濃度被認為對細胞沒有抑制作用，所以選擇1 μmol/L的RA作為后續(xù)實驗濃度。當RA聯合奧沙利鉑后，IC50從原來的(234.12±6.13)μg/mL降低到(140.45±2.25)μg/mL，差異有統計學意義(圖1C)。根據IC50濃度，后續(xù)僅選擇200 μg/mL的奧沙利鉑作為實驗濃度。

A：奧沙利鉑對HCT116、HCT116/L-OHP細胞增殖的影響；B：RA對HCT116/L-OHP細胞增殖的影響；C：RA聯合奧沙利鉑對CT116/L-OHP細胞增殖的影響。

2.2 RA聯合奧沙利鉑對HCT116/L-OHP細胞凋亡的影響

2.2.1流式細胞術結果

奧沙利鉑組HCT116/L-OHP細胞早期凋亡率為0.8%，晚期凋亡率為19.7%，總凋亡率為20.5%；而聯合組HCT116/L-OHP早期凋亡率21.1%，總凋亡率34.4%(圖2A)，凋亡率較奧沙利鉑組明顯升高。

2.2.2RT-PCR結果

凋亡標志性基因caspase-3、PARP在聯合組中表達較奧沙利鉑組明顯升高，差異均有統計學意義P<0.05(圖2B)。

A：RA聯合奧沙利鉑對HCT116/L-OHP凋亡率的影響；B：RA聯合奧沙利鉑對HCT116/L-OHP凋亡基因表達的影響；C：RA聯合奧沙利鉑對HCT116/L-OHP凋亡蛋白表達的影響。

2.2.3WB結果

奧沙利鉑組凋亡標志性蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP表達較聯合組明顯減少(圖2C)。

2.3 RA對耐藥蛋白及核因子-κB(NF-κB)信號通路的影響

RT-PCR結果顯示，編碼P-gp蛋白的基因MDR-1在聯合組中表達較奧沙利鉑組減少；免疫熒光及WB實驗也顯示，聯合組中P-gp蛋白表達較單用奧沙利鉑組減少，二者相一致(圖3A、B、D)。此外，WB發(fā)現空白組中IκB-α、p65表達最高，奧沙利鉑組較空白組表達減少，而聯合組中表達最低(圖3C)。

A：RA聯合奧沙利鉑對MDR-1基因的影響；B:WB實驗顯示RA聯合奧沙利鉑對P-gp蛋白的影響；C：RA聯合奧沙利鉑對NF-κB信號通路蛋白的影響;D:免疫熒光實驗顯示RA聯合奧沙利鉑對P-gp蛋白的影響。

3 討 論

RA是從竹節(jié)香附中提取的三萜皂苷，竹節(jié)香附又叫兩頭尖，為毛莨科銀蓮花屬植物多被銀蓮花的干燥根莖，《醫(yī)方歌括》最早記載了兩頭尖可治療乳癌。多項研究發(fā)現，RA不僅能抑制多種腫瘤細胞的增殖，還能增加細胞的敏感性，逆轉耐藥。GUO等[3]研究發(fā)現，RA能通過調控細胞周期和凋亡增加膽管癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。WANG等[4]發(fā)現RA能夠抑制STAT3磷酸化，增加骨肉瘤細胞對化療的敏感性逆轉其耐藥，從而促進細胞凋亡。PENG等[5]的實驗發(fā)現，RA可調控STAT3/NFIL3信號軸逆轉絨毛膜癌細胞的耐藥性，增加細胞凋亡。本實驗研究也發(fā)現，RA聯合奧沙利鉑后能使細胞增殖能力明顯下降，細胞凋亡率增加，說明RA可增加HCT116/L-OHP細胞株對奧沙利鉑的敏感性，逆轉其耐藥。

關于腫瘤耐藥的機制，其主要原因是細胞對抗腫瘤藥物吸收減少或排出增加，使細胞內藥物濃度降低，細胞死亡減少，從而出現耐藥，這種能控制藥物進出細胞的機制被稱為“藥物膜泵”，而調控“藥物膜泵”最主要的分子為P-gp蛋白[6]。該蛋白是在耐藥的中國倉鼠卵巢細胞中發(fā)現的一種高分子質量細胞膜糖蛋白，研究發(fā)現，其表達水平與細胞膜的通透性、細胞內藥物濃度及細胞耐藥程度有關[7]。杜夢楠[8]研究發(fā)現，P-gp在大腸癌組織中的表達均與組織分化程度、Duke′s分期、淋巴結轉移有關，且分化程度越低、分期越晚，P-gp表達越高。YAN等[9]也發(fā)現，P-gp在腸癌組織中的表達較正常大腸組織明顯增加。LIU等[10]發(fā)現，竹紅菌乙素能夠通過靶向聲動力療法逆轉SGC7901/ADR細胞株的耐藥性下調P-gp的表達。本實驗也發(fā)現，編碼P-gp的MDR-1基因在空白組中表達最高，奧沙利鉑干預后表達減少，而奧沙利鉑聯合RA干預后表達最少；并且P-gp蛋白在聯合組中表達也最少，說明RA聯合奧沙利鉑逆轉HCT116/L-OHP耐藥可能是通過下調P-gp實現的。

關于耐藥的信號通路，國內外研究已證實，NF-κB信號通路的激活是多藥耐藥產生的重要機制[11]。NF-κB轉錄因子家族由5個成員組成，即RelA(p65)、RelB、cRel、NF-κB1(p50)和NF-κB2(p52)，它們通過形成不同的同二聚體或異二聚體調節(jié)靶基因的表達，在炎癥、免疫調節(jié)、細胞分化和腫瘤形成等過程中發(fā)揮作用[12]。靜息狀態(tài)時，NF-κB與其抑制物IκB相結合存在于細胞質中。當外界因素(細菌或病毒感染、炎性細胞因子、TNF、LPS、紫外線照射、電離輻射等)刺激時導致IKKβ亞單位激活,從而使IκBs絲氨酸的S32、S36磷酸化，啟動細胞內的泛素化-蛋白酶系統，使IκBs蛋白降解,這樣,活化的NF-κB進入細胞核發(fā)揮轉錄因子作用[13]。研究發(fā)現，NF-κB具有抗凋亡能力，化療藥物誘導細胞凋亡時可激活NF-κB，誘導凋亡抑制基因的表達，導致腫瘤細胞形成化療抵抗[14]。大量研究證實，通過不同方法抑制NF-κB信號通路可提高惡性腫瘤對化療的敏感性。LIU等[15]發(fā)現，通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路減少P-gp和LRP的表達來逆轉鼻咽癌的多藥耐藥。林嘉麟[16]研究發(fā)現，在乳腺癌細胞中ClC-3通過NF-κB信號通路調控P-gp的表達，從而介導腫瘤細胞發(fā)生耐藥。向磊等[17]研究發(fā)現，姜黃素可抑制NF-κB信號通路，從而增強結腸癌HCT-116細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。王子元等[18]也發(fā)現，健脾解毒方可通過NF-κB/Nrf2/MRP2信號通路逆轉大腸癌多藥耐藥。本研究也發(fā)現，NF-κB信號通路中的IκB-α、p65在聯合組中的表達較奧沙利鉑組減少，而空白組表達最高，說明RA聯合奧沙利鉑逆轉耐藥可能與抑制了NF-κB信號通路有關。

綜上所述，RA聯合奧沙利鉑可增加HCT116/L-OHP對奧沙利鉑的敏感性，促進其凋亡，其機制可能是通過抑制NF-κB信號通路減少耐藥蛋白P-gp的表達實現的。