水稻稻瘟病抗病基因挖掘及育種研究進展

燕孟嬌，賈曉清，郝麗芬，宋培玲，皇甫海燕，郭晨，皇甫九茹，楊永青，史志丹，李子欽

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院植物保護研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特010031）

水稻是最重要的糧食作物之一，全球有一半以上的人口以稻米為主食。面對世界人口的逐年快速增長，提高水稻產(chǎn)量仍是至關重要的研究課題。稻瘟病由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起，是世界范圍內(nèi)水稻最嚴重的真菌病害，嚴重限制了水稻的生產(chǎn)，每年造成約1.57億t稻米的產(chǎn)量損失[1]。目前，防治稻瘟病的方法主要有使用殺菌劑、田間管理和培育抗病品種。殺菌劑的過度使用及殘留對食品安全和環(huán)境造成威脅。利用宿主自身抗病基因，培育穩(wěn)定、有效、廣譜、持久的抗病品種是控制稻瘟病最安全有效和經(jīng)濟的方法[2-3]。真菌群體中的致病性變異和不斷進化對攜帶單個抗病基因的抗性品種造成新的威脅，通常在3～5年內(nèi)突破單基因產(chǎn)生的抗病性，有必要聚合多個優(yōu)良、廣譜抗病基因創(chuàng)造持久抗病的新品種。無論是短期還是長期抗病育種，都需要考慮基因、基因型和群體水平產(chǎn)生的影響。通過基因定位能鑒定產(chǎn)生抗病性的基因或者基因組位點，并評估效果的強度、種族特異性和對持久性的潛在貢獻。在基因型水平上，抗性表現(xiàn)受宿主中抗性基因數(shù)量及其特異性組合的影響。在育種計劃中，需要考慮抗性基因?qū)ζ渌袃r值性狀（例如品質(zhì)、環(huán)境適應性等）的直接或間接影響[4]。

1 抗稻瘟病抗病基因的克隆進展

抗病性一般不是質(zhì)量性狀就是數(shù)量性狀，質(zhì)量抗病性狀在識別和應答病原菌的過程中已有較清晰的認識，大部分的抗?。╮esistance，R）基因編碼與病原菌識別有關的蛋白。R基因多為顯性基因型，也存在一些隱性抗病基因，可能是易感病基因發(fā)生變異缺失引起的[4]。數(shù)量抗病性狀由多個位點共同產(chǎn)生抗病效應，多表現(xiàn)為不完全抗病。隨著高通量測序、分子標記、全基因組關聯(lián)分析（GWAS）等技術的發(fā)展，鑒定得到越來越多的QTLs，大多數(shù)主效QTLs的功能與R抗病基因相同或相似。CHAIPANYA等[5]在廣譜抗病品種Jao Hom Nin中檢測到的兩個QTLs：QTL1具有部分抗性，QTL11具有完全抗性。通過基因克隆和序列分析發(fā)現(xiàn)，QTL1和QTL11分別編碼了Pish和Pi7的等位基因。FANG等[6]利用抗病品種Bodao和感病品種Suyuuo雜交得到的212個RILs，定位到兩個抗稻瘟病的QTLs：主效QTL qPb11-1和次要QTL qPb6-1。主效QTL qPb11-1（Pb-bd1）有6個候選基因等待驗證。

水稻全基因組序列的發(fā)布與生物信息學技術的發(fā)展，為水稻抗稻瘟病基因的定位和克隆提供了新思路。到目前為止，已經(jīng)鑒定出102個R基因和350多個QTLs參與稻瘟病菌的防御過程[7-10]。其中，39個R基因（表1）已被克隆，這些基因均是通過傳統(tǒng)的圖位克隆獲得的[3，7，9，11-14]。除了pi21、Pid2、Ptr、bsr-d1和CDS1基因，大部分R基因編碼NBS-LRR（Nucleotide-binding domain leucine-rich repeat）類蛋白。其中Pita、Pi2、Pi9、Pigm、Pb1和Pi67具有廣譜抗性，其余NBS-LRR類R基因的抗譜較窄。Pb1編碼一個缺失P-loop結構域的CC-NBS-LRR蛋白，是一個具有廣譜抗性且抗性持久的R基因。PB1蛋白能夠保護水楊酸途徑的關鍵轉(zhuǎn)錄因子WRKY45不被降解，從而提高水稻的稻瘟病抗性。Pigm編碼2個受體蛋白PigmR和PigmS。PigmR具有廣譜抗病性，但會使水稻種子變小，產(chǎn)量降低。PigmS不產(chǎn)生抗病性，但可以競爭性地結合PigmR形成異源二聚體，抑制PigmR的抗病功能，同時提高結實率。經(jīng)過長期進化和人工選擇，PigmS基因受表觀遺傳調(diào)控，在葉片、莖稈等病原菌侵染的組織部位表達量很低，對PigmR的功能影響較小，為病原菌提供一個“避難所”，可能延緩病原菌的進化。Pigm使水稻既不影響產(chǎn)量又能具有廣譜、持久的抗性[15]。在抗病品種Tetep中已鑒定得到3個R基因，Pi-l、Pi-kh和Pi-ta。JOSHI等[16]利用BSA技術和精細定位在Tetep的后代品系TDH251得到新的抗稻瘟病基因Pi67，編碼NBS-LRR蛋白。

Pid2基因編碼含825個氨基酸的跨膜受體蛋白激酶（receptor-like kinase，RLK），其氨基端含有疏水信號肽、PAN結構域和跨膜結構域（TM），羧基端是典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域（STK）。與其他R基因不同的是含有一個特異的B-lectin結構域。Pid2第441個氨基酸發(fā)生突變，導致TM域結構中IIE-rich motif的缺失，不能激活下游防御系統(tǒng)，改變了該基因的抗感特性[17]。

pi21基因編碼一個富含脯氨酸的蛋白質(zhì)，包含互作結構與重金屬結合域，重金屬結合域可能與植物防御反應有關。對Pi21基因單倍型分析發(fā)現(xiàn)，Pi21編碼脯氨酸富集序列的區(qū)域缺失18 bp和48 bp兩端序列能增強抗病性[12]。

LI等[13]通過GWAS分析66份非廣譜抗病水稻，發(fā)現(xiàn)Bsr-d1啟動子區(qū)域SNP33位置發(fā)生單堿基突變后對稻瘟病產(chǎn)生持久的抗性。bsr-d1基因編碼一個含有C2H2型鋅指結構的轉(zhuǎn)錄因子，直接受MYB轉(zhuǎn)錄因子家族調(diào)控。發(fā)生堿基變異的bsr-d1與MYBS1轉(zhuǎn)錄因子緊密結合，抑制了等位基因Bsr-d1的表達并影響下游兩個過氧化物酶的表達，使H2O2降解減弱，細胞內(nèi)H2O2富集，提高了水稻的免疫反應和抗病性。

在美國廣泛種植的水稻品種Katy中檢測到一個Pi-ta的抗病位點，包含Pi-ta、Pi-ta2和Ptr 3個R基因。用3個只含有Ptr基因，但缺乏Pi-ta和Pi-ta2的重組自交系（RILs）S/C272，S/C324，和S/C353檢測抗病性，發(fā)現(xiàn)Ptr基因具有廣譜且獨立于Pi-ta的稻瘟病抗性。但是基于目前的數(shù)據(jù)，還不能完全區(qū)分Ptr和Pi-ta2。Ptr編碼一個AMR結構域，E3連接酶也存在該結構域，可能與R基因介導的防御反應有關。對Ptr突變體的序列分析發(fā)現(xiàn)，在第4個外顯子中有一段12 bp序列的缺失與抗病相關[18]。

WANG等[14]通過圖位克隆得到CDS1基因，它編碼環(huán)核苷酸門控離子通道蛋白OsCNGC9，該蛋白通過介導PAMP誘導的鈣離子流，與抗性機制相關的類受體激酶OsRLCK185互作，通過磷酸化修飾改變其通道活性，過表達OsCNGC9可觸發(fā)水稻ROS爆發(fā)和誘導PTI相關防御基因的表達，從而提高水稻苗期稻瘟病抗性。

章孟臣[19]利用全基因組關聯(lián)分析，分離到抗稻瘟病新基因BRG8，定位于細胞質(zhì)中。BRG8在秈稻群體中有3種單倍型：Hap1，Hap2，Hap3。它正調(diào)控病程相關基因PAL，PBZ/PR10和轉(zhuǎn)錄因子WRKY45、WRKY53的表達量，從而增強水稻抗病性。

馬世偉[20]利用基因組重測序的SNP分析克隆了兩個抗稻瘟病新基因，BRG1和BRW1。BRG1編碼859個氨基酸的NBS-LRR蛋白，定位在細胞質(zhì)，OsBRG1蛋白的抗性與抗稻瘟病蛋白Os07g0105900的相互作用有關。同時OsBRG1能夠通過GL7基因調(diào)控籽粒形狀。OsBRW1基因編碼1203個氨基酸的NBS-ARC蛋白，具有保守結構域NBS（P-Loop、GLPL、Kinase-2a和RNBS-D）和CC，但不具有典型的WRKY結構域。OsBRW1介導的稻瘟病抗性可能與MAPK6/12、WRKY45和PRs基因的協(xié)同表達有關。

隨著分子生物學的快速發(fā)展，一大批參與稻瘟病抗性反應的基因（如類NPR1基因，WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因等）通過突變體或其他途徑分離得到，具有免疫應答功能，但這些功能與品種間的遺傳變異不一定相關。這類參與稻瘟病抗性的基因功能已基本明確，未來可以挖掘這些基因的潛力用于作物品種改良（表1）[2，7，13-16，18，21-53]。

表1 已克隆的39個稻瘟病R基因

2 抗病基因的育種應用進展

2.1 分子標記選擇輔助育種

利用分子標記輔助選擇（marker assisted selection，MAS）技術，通過精確轉(zhuǎn)移感興趣的基因區(qū)域和加快輪回親本基因組的恢復，縮短育種時間，是目前可用于所需組合將所需基因轉(zhuǎn)移到所需水稻品種中的最先進方法[54]。許多抗病基因與分子標記例如限制性片段長度多態(tài)性（RFLP），簡單序列重復（SSR）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）緊密連鎖，以及密集的分子遺傳圖譜開發(fā)與利用，為MAS應用挖掘目標性狀主要基因和QTLs奠定了基礎。ZHENG等利用SNPs和Indels分子標記定位到抗稻瘟病新基因Pi65（t）[9]。

國內(nèi)外一直很注重抗稻瘟病種質(zhì)資源的發(fā)掘，利用已有R基因/QTLs連鎖的標記，有利于種質(zhì)資源的分類和基因型的確定，篩選廣譜、持久的抗性材料進行育種。KUROKAWA等通過與Nipponbare基因組序列進行比較分析，已在水稻中鑒定出170萬個SNPs[55-56]。

ELLUR等[57]通過分子輔助回交育種（MABB）技術將兩個攜帶抗稻瘟病的顯性抗病基因Pi2和P54的品種與印度廣泛種植的Basmati品種PB1121和PB6回交，利用分子標記SSRs和SNPs進行前景目標基因選擇和背景選擇后雜交，使這兩個抗性基因聚合于PB1121和PB6的近等基因系（NILs），加快育種進程。同時發(fā)現(xiàn)在背景恢復的估算上，SSR對背景恢復的估算高于SNP，可能是由于多態(tài)性SSR標記不如SNP標記廣泛，使用SNP標記能更準確地分析檢測背景恢復程度和NILs中的目標基因。MIAH等[58]利用兩個標記RM6836和RM8225將Piz、Pi2和Pi9 3個顯性的抗病新基因轉(zhuǎn)入品種MR219，使用SSRs標記檢測背景恢復，最終得到的13個基因?qū)胂档谋尘盎謴推骄鶠?5.98%。DAS等[59]成功地利用最接近的標記RG64和P28，將兩個廣譜水稻抗稻瘟病基因Pi2和Pi9轉(zhuǎn)入改良品種Tapaswini。

TIAN等[60]開發(fā)特異性標記Pi9/2，能有效檢測出群體中含抗性基因的后代。HUANG等[61]利用群體中存在的SNP多態(tài)性，建立基因組篩選（GS）模型用于有效分析抗稻瘟病基因的遺傳變異。FANG等利用MAS方法和抗病QTL qPb11-1（Pb-bd1）的標記，從商品品種NJ46（易感）中開發(fā)了3個能顯著增強穗稻瘟病抗性的Pb-bd1基因滲入系[6]。裘燁[62]以Tetep、地谷B作為抗稻瘟病基因供體，應用分子標記輔助選擇育種技術，改良5份稻瘟病抗性較差的受體恢復系親本。最后篩選出6個改良恢復系：具有Pi-kh基因的2個抗病純系TR2、TR4和具有Pi-d1（t）抗病基因的4個抗病純系DR3、DR4-1、DR4-2、DR1。田間稻瘟病抗性較高，農(nóng)藝性狀優(yōu)良，在配組時能獲得較好的組合。

MAS加快了當前的水稻育種進程，目前利用的MAS輔助育種主要基于已有的標記開展育種工作：（1）收集和鑒定種質(zhì)資源遺傳和表型多樣性；（2）評估這些種質(zhì)資源；（3）將已有的R基因/QTLs轉(zhuǎn)入廣泛種植的品種。未來的研究中，我們可以充分利用基因組數(shù)據(jù)，打破只能使用已有分子標記設計新品種的局限性。

2.2 多基因的分子聚合育種

抗稻瘟病育種的主要難題是遺傳抗性的持久性。由于新的強毒種的出現(xiàn)，隨著時間的流逝，僅含有特定病原體中的單個R基因的水稻品種經(jīng)常變成易感。將多個重要農(nóng)藝性狀關鍵基因聚合在單一品種是一種有效的育種策略。

FUKUOKA等[24]在廣譜持久抗稻瘟病的品種Owarihatamochi中發(fā)現(xiàn)1種系的抗病類型，由4個QTLs控制：pi21、Pi34、qBR4-2和qBR12-1。其中，pi21、Pi34是已經(jīng)克隆的抗稻瘟病基因，qBR4-2和qBR12-1定位在染色體的R基因簇上。隨后他們將這4個位點的等位基因轉(zhuǎn)入易感品種Aichiasahi，田間檢測所有含單個等位基因的均表現(xiàn)不完全抗性，受環(huán)境影響較大。聚合4個位點的NIL材料對稻瘟病抗性完全且穩(wěn)定。ELLUR等[57]也在田間誘發(fā)病害檢測中發(fā)現(xiàn)，攜帶Pi2+Pi54聚合基因的NILs比攜帶單抗病基因具有廣譜抗稻瘟病性，這些開發(fā)的NILs材料在2015年已經(jīng)進入印度品種測試的最后階段。

KUMARI等[63]首次利用共轉(zhuǎn)化技術將兩個抗稻瘟病基因Pi54和Pi54rh轉(zhuǎn)入易感病的材料，獲得兩個抗性基因疊加，具有廣譜抗性轉(zhuǎn)基因品系。該方法可以在短時間內(nèi)完成多個抗病基因的共轉(zhuǎn)化，且不存在連鎖阻力。隨后選用廣譜、強力的M.oryzae菌株Mo-ei-ger1對轉(zhuǎn)基因材料進行毒力檢測。Mo-ei-ger1能敲除大部分抗性基因，包括Pi54。與非轉(zhuǎn)基因品系相比，堆疊型轉(zhuǎn)基因IET17021品系（Pi54+Pi54rh）對Mo-ei-ger1品系表現(xiàn)出完全抗性。這兩個R基因疊加的秈稻轉(zhuǎn)基因品系可作為水稻抗稻瘟病育種的新種質(zhì)資源[64]。XIAO等[3]利用具有良好農(nóng)藝性狀的粳稻07GY31開發(fā)了攜帶廣譜抗病基因Pi9，Pizt和Pi54的單基因NILs：NILPi9，NILPizt和NILPi54，以及相應NILs雜交產(chǎn)生的PPLs（polygene pyramid lines）：PPLPi9+Pi54和PPLPizt+Pi54，結果顯示所有NILs和PPLs抗病頻率均顯著高于親本07GY31；聚合多基因PPLs的抗病頻率在葉片中均高于NILs；在稻穗中，PPLPizt+Pi54的抗病頻率高于單基因的NILPizt和NILPi54，呈現(xiàn)出簡單的基因疊加效應；而稻穗中PPLPi9+Pi54顯著低于NILPi9的抗病頻率，可能是由于OsRac1與Pi9的NB-AC區(qū)域相互作用后啟動免疫反應而未能與Pizt結合，表明主要抗稻瘟病的R基因之間存在更加復雜的互作方式[3]。因此，在多R基因的聚合育種中，應考慮不同的主要抗病基因會產(chǎn)生不同的分子免疫反應，選擇合適的主要抗病基因進行聚合育種。

水稻中的多基因聚合育種通常只涉及1～2個性狀的基因或QTLs，DAS等[59]嘗試在改良品種Tapaswini（已含有4個抗白葉枯病的基因，Xa4+Xa5+Xa13+Xa21）中聚合10個基因/QTLs，包括抗稻瘟病基因Pi2和Pi9，抗五倍子蠅基因Gm1和Gm4，耐淹基因Sub1以及耐鹽基因Saltol。利用常規(guī)方法（農(nóng)藝方法、籽粒質(zhì)量方法）和SSR標記，最大限度地恢復輪回親本基因組。篩選出10個存在或不存在不同基因組合的目標基因或QTLs的品系，4個基因聚合品系（ITGP1、ITGP2、ITGP4和ITGP5）擁有全部10個基因，對常見的生物和非生物脅迫具有較高的抗性/耐受性，產(chǎn)量僅略低于輪回親本，展示了基因聚合在水稻育種中的巨大潛力[59]。

2.3 基因組編輯育種

基因組編輯是一種精準和高效的基因工程方法，其中CIRISPR/Cas9系統(tǒng)利用簡單的核苷酸互補配對方式結合在基因組靶位點，構建簡單、高效，在植物中廣泛用于基因功能的鑒定、優(yōu)良品質(zhì)的培育和種質(zhì)資源挖掘等方面。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對一些已知R基因的進行編輯，不僅能獲得具有抗性或優(yōu)質(zhì)的育種材料，而且在育種周期上節(jié)約了大量的時間。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻的品質(zhì)改良、抗除草劑、抗白葉枯病、創(chuàng)建不育系等方面均有應用[65-70]，但在稻瘟病抗病育種上的研究較少。XIE等[71]在位點Pizh檢測到兩個候選基因，利用CRISPR/Cas9編輯Pizh-1和Pizh-2基因，發(fā)現(xiàn)這兩個基因同時被編輯的突變體喪失抗性，表明二者是協(xié)同產(chǎn)生稻瘟病抗性。TGMS系在兩系雜交育種體系中起著重要的作用。Pinzhan材料是一種三系育種的中間材料，具有良好的農(nóng)藝性狀和外觀。它由于缺乏強恢復基因，Rf4保持力較弱，恢復力也較差，不能直接用于三系育種。LI等[70]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)創(chuàng)建tms5/pi21/xa13突變體，兩年內(nèi)成功地將Pinzhan轉(zhuǎn)化為新的TGMS品系（PinzhanS），同時增強抗病性。靶向基因TMS5突變存在于大多數(shù)商品化的TGMS系中，Pi21的隱性等位基因pi21廣譜抗稻瘟病，以及Xa13的隱性等位基因xa13抗白葉枯病。本研究為中間育種材料轉(zhuǎn)化為TGMS系提供了一種方便、有效的方法，加快不育系的選育。

3 展望

目前在抗病基因、防御反應以及導致水稻防御反應激活的信號轉(zhuǎn)導方面已經(jīng)取得了長足的進步，但整個抗稻瘟病的防御機制還不是很清楚。了解稻瘟病菌的遺傳特性以及水稻抗病性分子生物學的研究，有助于改良水稻品種，提高產(chǎn)量。傳統(tǒng)育種方法有許多種，如回交育種、重復選擇育種、突變育種等，在保存野生種質(zhì)、對比親本間的有性雜交、新的遺傳變異和突變等方面仍然發(fā)揮重要作用。但傳統(tǒng)育種在篩選、去除不需要的基因上存在局限性，利用新的分子技術（轉(zhuǎn)基因、分子標記、基因編輯等）、功能基因組學和DNA芯片等方法作為傳統(tǒng)育種的補充，比表型篩選更簡單，節(jié)約時間、精力和資源，還可以快速消除不良的植物基因型，改進育種程序[56，72]。

目前抗性基因/QTLs在育種中的應用主要集中在幾個持久廣譜抗性的基因上，如pi21、Pi2、Pi9、Pigm、Pb1和Pi34等?？共』虻难芯靠梢猿浞掷弥販y序、GWAS、SNPs分子標記等技術，鑒定更多廣譜、持久的抗性基因/QTLs。稻瘟病菌的遺傳變異和不斷進化很容易打破單基因抗性，具有多抗性基因/QTLs的品種具有更加持久的抗性。開發(fā)抗性基因/QTLs的分子標記，通過MAS、共轉(zhuǎn)化以及基因編輯等技術將它們聚合在品質(zhì)優(yōu)良的品種中。XIAO的研究表明，聚合抗性基因并不是簡單的基因疊加效應，抗性基因的不同組合可能直接導致不同的抗性水平。在抗稻瘟病育種過程中，寄主植物中不同的稻瘟病抗性基因的組合，可以考慮靶基因的優(yōu)良等位基因。雖然持久抗病性是一個重要的育種目標，但不能簡單地把持久抗病性問題當作植物育種問題處理。利用異質(zhì)（包括間作和類似的）群體可以有效地減少病原體的進化。因此，促使遺傳和育種技術進步的同時，還要加強遺傳資源管理、雜交項目、多環(huán)境試驗和育種過程中的其他必要階段，盡可能降低作物改良的潛在威脅。