苦豆子種子營(yíng)養(yǎng)成分及其急性毒性

蘇永霞，馮 平，朝克圖，蘇日拉格，路 浩，吳晨晨，趙寶玉

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 中國(guó)西部有毒植物研究所，陜西楊凌 712100；2. 榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林 719000；3. 阿拉善左旗吉蘭泰鎮(zhèn)綜合保障和技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古阿拉善 750300；4. 阿拉善左旗銀根蘇木綜合保障和技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古阿拉善 750300)

苦豆子(Sophoraalopecuroides)俗名苦豆草、苦豆根、歐苦參、草槐等，是豆科槐屬多年生草本植物，主要分布于中國(guó)西北干旱半干旱的荒漠化和鹽堿化等地區(qū)，面積約為180萬(wàn) hm2，資源儲(chǔ)量十分豐富[1-2]。作為傳統(tǒng)藥源植物，苦豆子具有清熱解毒、抗菌消炎和殺蟲(chóng)等作用，在民間常被用來(lái)做止痛劑、抗菌劑和抗風(fēng)濕劑，用于治療發(fā)燒和胃腸疾病[3]。同時(shí)，苦豆子地下根莖發(fā)達(dá)，耐干旱、耐鹽堿、抗風(fēng)固沙，是一種很好的防風(fēng)固沙植物，在西北干旱荒漠化地區(qū)對(duì)維護(hù)生態(tài)平衡和防止土地沙漠化具有重要生態(tài)作用[4]。有研究表明，苦豆子主要含有生物堿、黃酮類、揮發(fā)油、脂肪酸、甾體類等多種化學(xué)成分，其中生物堿是其主要活性成分，含量較高，且藥理作用研究最為深入[5]。苦豆子全草生物堿含量約為6.11%～8.03%，種子中最高約為8.11%，具有抑菌抗炎、抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等藥理活性[6-9]。在醫(yī)藥方面，以苦豆子生物堿為原料開(kāi)發(fā)的克瀉靈片、婦炎栓、苦參素注射液和苦參素膠囊等制劑，已廣泛用于人醫(yī)臨床，用于急慢性腸炎、婦科炎癥以及肝炎等多種疾病的治療；在農(nóng)業(yè)方面，苦豆子可作為有機(jī)綠肥、農(nóng)藥、動(dòng)物飼料等開(kāi)發(fā)利用[1]。但同時(shí)，苦豆子也具有一定的毒性，青綠時(shí)期毒性較大、枯萎時(shí)毒性較小，在冬春季飼料缺乏時(shí)牲畜常因饑餓采食而引起中毒，其中馬屬動(dòng)物較為敏感，羊、驢等過(guò)量采食嚴(yán)重者也會(huì)引起死亡[10]。鑒于苦豆子在中國(guó)資源儲(chǔ)量豐富，并且具有較高的藥用價(jià)值和生態(tài)功能，因此，人們?cè)絹?lái)越重視苦豆子的資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用。目前，有關(guān)苦豆子資源化利用的研究，主要集中在苦豆子的地上部分，而苦豆子種子營(yíng)養(yǎng)成分如何，是否有毒性及資源化利用的潛力，研究甚少。本研究擬通過(guò)檢測(cè)苦豆子種子的營(yíng)養(yǎng)成分及其對(duì)小鼠的急性毒性大小，以期為苦豆子種子的毒性毒理研究和資源化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣本 苦豆子種子于2019年10月采自內(nèi)蒙古阿拉善吉蘭泰鎮(zhèn)(105°45′30.6″E，39°45′22.6″N)，主要采集成熟期苦豆子莢果，置陰涼通風(fēng)處晾曬，干燥后經(jīng)脫痂皮處理獲得苦豆子種子，保存，備用。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明系清潔級(jí)健康小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為(20±2)g，購(gòu)自成都達(dá)碩試驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)室溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.1.3 儀器與試劑 EV311旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(北京萊伯泰科儀器有限公司)、SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、DLK-5003快速低溫冷卻循環(huán)機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)、U-3900H型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá))、L-8900型氨基酸自動(dòng)分析儀(華美辰)、Z-2000型原子吸收分光光度計(jì)(日立)和KJEI-TECTM8400型凱式定氮儀(上海沛歐)等；主要試劑有二氯甲烷、正丁醇、甲醇、濃硫酸、高氯酸、次硝酸鉍等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苦豆子種子營(yíng)養(yǎng)成分分析 取陰干的苦豆子種子粉碎，100目篩子過(guò)篩，隨后按國(guó)標(biāo)法進(jìn)行相關(guān)營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)。常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分按GB 14924.3-2010《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 配合飼料營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定》、礦物質(zhì)元素按 GB/T 13885-2017《飼料中鈣、銅、鐵、鎂、錳、鉀、鈉和鋅含量的測(cè)定 原子吸收光譜法》、磷元素按GB 5009.87-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中磷的測(cè)定》、硒元素按GB/T 5009.93-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測(cè)定》和氨基酸按GB/T 5009.124-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 苦豆子種子醇浸膏及其生物堿的提取 苦豆子種子陰干粉碎后分裝于圓底燒瓶，加入體積分?jǐn)?shù)為95%工業(yè)酒精進(jìn)行熱回流，回流溫度為72 ℃，時(shí)間為4 h，重復(fù)上述回流過(guò)程4～5次，得到苦豆子醇提液。隨后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸濃縮醇提液，得到醇浸膏。浸膏用1 mol/L HCl溶解，抽濾，除去不溶性殘?jiān)?，得到酸水液。隨后將酸水液置于分液漏斗，按母液∶二氯甲烷=3∶1的體積比用二氯甲烷反復(fù)萃取以除去雜質(zhì)；萃取后剩余的酸水液用少量固體NaOH調(diào)節(jié)pH至9～11，依次用二氯甲烷和正丁醇反復(fù)萃取，減壓回收溶劑得到堿性二氯甲烷部分和堿性正丁醇部分，二者合并為苦豆子種子生物堿部分。

1.2.3 急性毒性試驗(yàn) 參照毒理學(xué)試驗(yàn)方法與技術(shù)以及LD50計(jì)算原則，苦豆子種子醇浸膏以 3 000.00 mg/kg、2 400.00 mg/kg、1 920.00 mg/kg、1 536.00 mg/kg、1 228.80 mg/kg、 983.04 mg/kg和786.43 mg/kg為正式試驗(yàn)劑量組，苦豆子種子生物堿以800.00 mg/kg、 567.38 mg/kg、402.39 mg/kg、285.39 mg/kg和202.40 mg/kg為正式試驗(yàn)劑量組，每組10只小鼠，雌雄各半，逐只稱體質(zhì)量后灌胃染毒，每10 g體質(zhì)量給藥量為0.1 mL。在苦豆子種子醇浸膏和生物堿分別灌胃染毒后的1 h內(nèi)持續(xù)觀察小鼠的毒性反應(yīng)以及死亡情況，包括飲食、排泄物和外觀行為等變化。隨后每隔1 h觀察每組小鼠的毒性反應(yīng)，并統(tǒng)計(jì)24 h內(nèi)小鼠死亡分布情況。死亡小鼠及時(shí)進(jìn)行解剖，觀察臟器有無(wú)病理變化，其他小鼠于試驗(yàn)結(jié)束觀察愈后效果，觀察期為14 d。

1.2.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)及分析 營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)時(shí)各項(xiàng)目均做3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。急性毒性試驗(yàn)，采用改良寇氏法分別計(jì)算小鼠單次灌胃染毒后苦豆子種子醇浸膏和生物堿的LD50和95%可信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦豆子種子營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

2.1.1 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分 由表1可知，苦豆子種子中干物質(zhì)的含量最高，粗灰分的含量最低。

2.1.2 礦物質(zhì)元素 如表2所示，苦豆子種子常量元素有Ca、P，K和Mg，其中K含量最高為 7 002.25 mg/kg，Ca和P含量相當(dāng)，二者的比值為1.1，Mg含量相對(duì)較低，為1 416.00 mg/kg。表明苦豆子種子常量元素較豐富，可以作為動(dòng)物飼料礦物質(zhì)的來(lái)源。微量元素測(cè)定結(jié)果顯示，苦豆子種子中含有Fe、Mn、Zn、Cu、Cr和Se。研究顯示，當(dāng)Zn/Cu>10及Zn/Fe>1，這些礦物質(zhì)元素的生物學(xué)功能就會(huì)發(fā)生拮抗作用?？喽棺臃N子中 Zn/Cu值為4.82，Zn/Fe值為0.25，這2個(gè)比值均在合理范圍之內(nèi)，有利于動(dòng)物機(jī)體的吸收，可以作為動(dòng)物補(bǔ)充無(wú)機(jī)礦質(zhì)元素的飼料來(lái)源。Mn、Cr、Se等對(duì)機(jī)體的糖代謝和蛋白質(zhì)代謝具有重要作用，苦豆子種子中Mn元素的含量較高，Cr、Se的含量相對(duì)較低，但其含量都符合飼料中的允許量，對(duì)動(dòng)物機(jī)體具有重要的作用。

表2 苦豆子種子的礦物質(zhì)元素含量Table 2 Contents of mineral elements in seeds of S.alopecuroides

2.1.3 氨基酸 如表3所示，苦豆子種子中共有17種氨基酸，總含量為17.673%，其中必需氨基酸(EAA)9種，含量為5.780%，占總氨基酸(TAA)的32.705%。非必需氨基酸(NEAA)8種，含量為11.893%，占總氨基酸(TAA)的 67.295%。藥效氨基酸9種，含量為11.704%，占總氨基酸的66.3%。9種必需氨基酸的含量依次為L(zhǎng)eu>Lys>Val> Phe>Tyr>Thr>Ile>Met>Cys，8種非必需氨基酸含量依次為Glu>Arg>Pro>Asp>Gly>Ger>Gla>His，9種藥效氨基酸含量依次是Glu> Arg>Asp>Leu>Lys>Gly>Phe>Ile>Met。其中，所有氨基酸中EAA/NEAA=0.49，EAA/TAA=0.33，均接近并低于WHO/FAO提出的理想蛋白質(zhì)EAA/NEAA=0.60和EAA/TAA=0.40的要求，可見(jiàn)苦豆子種子的氨基酸種類和含量比較豐富，配比較為合理，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表3 苦豆子種子的氨基酸含量Table 3 Contents of amino acid in seeds of S.alopecuroides

本試驗(yàn)采用FAO/WHO提出的氨基酸比值系數(shù)法對(duì)苦豆子種子的氨基酸進(jìn)行評(píng)價(jià)[11]。由表4可知，苦豆子種子中蛋氨酸+半胱氨酸值遠(yuǎn)低于FAO/WHO推薦的氨基酸模式譜標(biāo)準(zhǔn)，并且其RC值最小為0.25，RC最小者為第一限制性氨基酸，所以蛋氨酸和半胱氨酸為苦豆子種子的第一限制氨基酸。SRC值越接近100，EAAI值接近1，則植物蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越高[11]，本試驗(yàn)中苦豆子種子的SRC、EAAI分別為59.04和 0.85，所以苦豆子種子可作為理想的植物蛋白來(lái)源。

表4 苦豆子種子的氨基酸含量和營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)Table 4 Amino acid content and nutrition evaluation in seeds of S.alopecuroides

2.2 急性毒性試驗(yàn)

2.2.1 苦豆子種子醇浸膏 小鼠灌胃染毒后， 3 000.00mg/kg、2400.00mg/kg和1920.00 mg/kg劑量組小鼠在染毒后表現(xiàn)為短暫性安靜，大約在染毒10 min左右，小鼠出現(xiàn)明顯的呼吸系統(tǒng)癥狀和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。主要表現(xiàn)為呼吸頻率加快以及全身震顫、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、四肢呈劃水狀無(wú)法站立，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)上下跳躍、驚恐不安等情況。神經(jīng)癥狀明顯的小鼠在1 h內(nèi)都表現(xiàn)為強(qiáng)直性痙攣后死亡，死亡小鼠解剖可見(jiàn)其臟器器官無(wú)明顯的病理?yè)p傷，存活小鼠在神經(jīng)癥狀過(guò)后表現(xiàn)為身體蜷縮、精神沉郁，24 h后存活小鼠飲食和精神狀況逐漸恢復(fù)正常。1 536.00 mg/kg和1 228.80 mg/kg劑量組小鼠，神經(jīng)癥狀較前3個(gè)劑量組輕，小鼠死亡數(shù)也減少。983.04 mg/kg和 786.43 mg/kg劑量組小鼠，染毒后個(gè)別小鼠表現(xiàn)為身體蜷縮發(fā)抖、精神沉郁，大部分小鼠精神狀態(tài)良好。染毒后各組小鼠的急性毒性死亡情況如表5所示，各組小鼠在24 h內(nèi)存活情況如圖1所示。采用改良寇氏法計(jì)算小鼠單次灌胃苦豆子種子醇浸膏的LD50為1 406.05 mg/kg，95%可信限為 1 221.80～1 621.81 mg/kg。

表5 苦豆子種子醇浸膏對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Acute toxicity result of extract from S.alopecuroides seeds to mice

2.2.2 苦豆子種子生物堿 小鼠灌胃染毒后，800.00 mg/kg和567.38 mg/kg劑量組小鼠在染毒后10～20 min左右出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，外觀行為以及死亡情況與灌胃高劑量苦豆子種子醇浸膏后的表現(xiàn)相似。其他3組低劑量組小鼠，給藥后表現(xiàn)為焦躁不安與精神沉郁、安靜交替出現(xiàn)，極少部分小鼠表現(xiàn)為上下跳躍等神經(jīng)癥狀，大部分小鼠在神經(jīng)癥狀過(guò)后能正常飲食、運(yùn)動(dòng)，愈后效果良好。給藥后各組小鼠的急性毒性死亡情況如表6所示，各組小鼠在24 h內(nèi)存活情況如圖2所示。采用改良寇氏法計(jì)算小鼠單次灌胃苦豆子種子生物堿的LD50為416.87 mg/kg，95%的可信限為346.74～501.19 mg/kg。

表6 苦豆子種子生物堿對(duì)小鼠的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Acute toxicity result of alkaloids from S.alopecuroides seeds to mice

3 討 論

苦豆子全草中苦豆子種子的產(chǎn)量極高，但是目前對(duì)于苦豆子種子的資源化利用研究報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，苦豆子種子中粗蛋白含量為25.19%、粗脂肪為4.46%、粗纖維為 20.22%，紫花苜蓿素有“牧草之王”的美稱，其粗蛋白、粗脂肪和粗纖維的含量分別為26.1%、 4.5%和17.2%，通過(guò)與其比較，苦豆子種子粗蛋白、粗脂肪的含量與紫花苜蓿相當(dāng)，粗纖維的含量比紫花苜蓿稍高；與矮象草、黑麥草和草木樨等牧草相比，苦豆子粗蛋白的含量比這些牧草高很多，粗纖維的含量比這些牧草低[12]。而牧草的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在很大程度上取決于其粗蛋白和粗纖維的含量，飼料中的粗蛋白可為動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)，粗纖維有助于減少動(dòng)物瘤胃臌氣，促進(jìn)動(dòng)物消化，苦豆子種子中粗蛋白含量較高、粗纖維含量適中，所以苦豆子作為飼料具有很大的利用潛力。此外，研究表明[13]苦豆子提取生物堿后剩余的籽渣和草渣中含有較高的蛋白質(zhì)和微量的生物堿，用其廢渣飼喂羊只，不僅具有抑制腸道有害細(xì)菌的作用，還能促進(jìn)飼料的消化吸收，加快羊只生長(zhǎng)，有助于干旱地區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展。

礦物質(zhì)元素對(duì)動(dòng)物機(jī)體具有重要的作用，其含量過(guò)多或缺乏都會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育造成影響。苦豆子種子中含有Ca、P、K、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、Cr和Se等多種礦物質(zhì)元素，其中Ca含量為2 587.50 mg/kg，P為2 353.50 mg/kg，Ca、P比值為1.1，研究顯示羊飼糧中Ca、P比例在 1～2∶1較為適宜，Ca含量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響其他礦物質(zhì)元素的吸收，而Fe與血紅蛋白的合成和多種酶的活性有關(guān)[14-15]。有文獻(xiàn)報(bào)道[14]，飼料中Cu含量缺乏會(huì)引起羔羊蹣跚，含量過(guò)多還會(huì)引起流涎、腹瀉等中毒癥狀，Zn元素對(duì)公羊睪丸中精子的形成和羊毛的生長(zhǎng)具有重要作用，苦豆子種子中Fe、Cu、Zn的含量都符合美國(guó) NRC推薦的綿羊飼糧中礦物質(zhì)的需求量，并且苦豆子種子的Zn/Cu值為4.82，Zn/Fe值為0.25，這兩者的比值都較為合理，在動(dòng)物利用過(guò)程中不會(huì)發(fā)生拮抗作用?？喽棺臃N子中還含有微量的Cr、Se，這兩種元素對(duì)增強(qiáng)動(dòng)物免疫力和抗氧化具有重要的作用。

本研究中，苦豆子種子含有17種氨基酸，總氨基酸含量為17.673%，與紫花苜?？偘被岷?4.85%～19.48%相當(dāng)，說(shuō)明其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[16]?？喽棺臃N子的必需氨基酸中，蛋氨酸+胱氨酸低于標(biāo)準(zhǔn)模式譜較多，是苦豆子種子的第一限制氨基酸，其他各種必需氨基酸較接近或高于模式譜標(biāo)準(zhǔn)值，表明苦豆子種子的氨基酸相對(duì)均衡合理。此外，苦豆子種子的藥效氨基酸種類豐富，含量為66.2%，說(shuō)明苦豆子種子可能還具有一定的藥用價(jià)值，其氨基酸含量較高的主要有Glu、Arg、Pro和Asp，Glu具有促進(jìn)紅細(xì)胞生成、改善腦細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)及活躍思維作用，Asp酸有治療肝臟和膽汁分泌障礙的功能，Arg可有效提高免疫力等作用[17]。

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，苦豆子種子醇浸膏的LD50為1 406.05 mg/kg，95%可信限為 1 221.80～1 621.81 mg/kg，苦豆子種子生物堿的LD50為416.87 mg/kg，95%的可信限為 346.74～501.19 mg/kg?？喽棺臃N子醇浸膏和生物堿分別灌胃染毒后，小鼠都會(huì)出現(xiàn)明顯的神經(jīng)興奮和呼吸系統(tǒng)癥狀，且高劑量組出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的大部分小鼠都會(huì)表現(xiàn)出強(qiáng)直性痙攣后死亡，低劑量組小鼠在神經(jīng)癥狀過(guò)后，能正常飲食和運(yùn)動(dòng)，愈后效果良好，說(shuō)明試驗(yàn)過(guò)后苦豆子對(duì)小鼠的持續(xù)性影響較小。本試驗(yàn)中小鼠的神經(jīng)癥狀和呼吸系統(tǒng)癥狀明顯，說(shuō)明苦豆子對(duì)小鼠的毒作用靶器官可能是腦和肺臟，余建強(qiáng)等[18]研究表明，槐定堿對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有明顯的興奮作用，曹曉東等[19]研究顯示，小鼠經(jīng)口攝入苦豆子總堿后，主要損傷的器官是肺臟和腦，從而引起這些器官的機(jī)能代謝障礙，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。有資料記載[20]苦豆子槐果堿主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)，低劑量時(shí)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，高劑量時(shí)則表現(xiàn)為興奮，而在本試驗(yàn)中苦豆子浸膏和生物堿的低劑量組小鼠主要表現(xiàn)為精神沉郁，高劑量組小鼠主要表現(xiàn)為全身震顫、上下跳躍以及精神亢奮等神經(jīng)癥狀，可能與苦豆子總堿中含有槐果堿有關(guān)。此外，苦豆子種子醇浸膏和生物堿分別染毒后，小鼠的臨床癥狀表現(xiàn)相似，說(shuō)明苦豆子中的主要毒性成分為生物堿，因此苦豆子在提取生物堿后可以安全利用。根據(jù) WHO口服外源毒物分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[9]，本試驗(yàn)測(cè)得苦豆子種子浸膏的LD50為1 406.05 mg/kg，具有低等毒性，苦豆子生物堿的LD50為416.87 mg/kg，具有中等毒性。

以上結(jié)果表明，苦豆子種子中含有較高的粗蛋白和粗纖維，并且富含多種礦物質(zhì)元素和氨基酸，配比較為合理，可以作為家畜的蛋白質(zhì)補(bǔ)充飼料。但通過(guò)急性毒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其種子中含有的生物堿具有中等毒性，家畜直接采食會(huì)產(chǎn)生毒害作用，因此苦豆子需脫毒處理后才能作為動(dòng)物蛋白質(zhì)的補(bǔ)充飼料。