沙格雷酯和卡比多巴聯(lián)合用藥對順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的保護(hù)作用

關(guān) 晶＊，童 欣＊，張 怡，徐 凡，張譽馨，梁秀睿，金佳琦，敬泓滟，郭柳纖，倪欣睿，傅繼華

（1.中國藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院生理學(xué)系，江蘇 南京 210009；2.中國藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京 211198）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是指腎功能在較短時間內(nèi)下降，導(dǎo)致血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和肌酐（creatinine，CRE）濃度增加以及出現(xiàn)蛋白尿［1］。除急性期的腎功能障礙外，AKI還存在持續(xù)組織損傷的顯著風(fēng)險，導(dǎo)致腎小球濾過率持續(xù)下降，腎功能無法恢復(fù)，進(jìn)而發(fā)展成慢性腎病［2］。腎作為各種化學(xué)藥物毒性作用的主要器官，臨床上經(jīng)常發(fā)生AKI。順鉑在腎近端小管細(xì)胞中積累，臨床上約1/3患者出現(xiàn)AKI［3］。研究發(fā)現(xiàn)，AKI的發(fā)生主要是因順鉑使腎細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥和細(xì)胞凋亡［4-5］；使線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增多［5］。順鉑導(dǎo)致細(xì)胞損傷的機(jī)制尚未闡明。

有研究報道，5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）參與腎的病理狀態(tài)。腎近端小管細(xì)胞可高水平表達(dá)芳香族L-氨基酸脫羧酶（aromatic amino acid decarboxylase，AADC）［6］。該酶可將 5-羥色氨酸脫羧變成5-HT，生理條件下通過旁分泌調(diào)節(jié)腎中磷酸鹽排泄。5-HT的合成正是在色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase，Tph；外 周 為 Tph1）、AADC的2步催化下完成［7］。研究表明，5-HT高水平合成可導(dǎo)致慢性腎病并發(fā)尿毒癥［8］，還參與糖尿病腎病的發(fā)生。在人系膜細(xì)胞，5-HT作用于5-HT2A受體（5-HT2Areceptors，5-HT2AR）后產(chǎn)生大量ROS［9］，通過調(diào)節(jié)下游細(xì)胞因子的表達(dá)，引起組織炎癥、損傷和壞死［10］。5-HT2AR拮抗劑鹽酸沙格雷酯（sarpogrelate hydrochloride，SH）對糖尿病腎病小鼠的血糖、腎功能、腎組織損傷均有明顯改善作用［11］；SH可顯著延緩糖尿病腎病的發(fā)展［12］。腎細(xì)胞中還存在單胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAO-A），參與內(nèi)源性和外源性胺的脫氨基作用［13］和腎中ROS的產(chǎn)生［14-15］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，外周5-HT系統(tǒng)與胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝、血脂紊亂、炎癥反應(yīng)及糖尿病性疲勞等慢性代謝性疾病密切相關(guān)［16-18］。本研究采用順鉑誘導(dǎo)的AKI小鼠模型，研究5-HT2AR拮抗劑SH及5-HT合成抑制劑卡比多巴（cardidopa,CDP）對順鉑引起的腎組織氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡的影響，評估SH和CDP對順鉑致腎毒性的預(yù)防作用。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

順鉑（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），SH（上海乾勁化工科技有限公司），CDP（浙江手心制藥有限公司）。CRE、BUN、白蛋白（albumin，Alb）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（南京建成生物研究所）；BCA試劑和Hoechst染料（上海碧云天生物技術(shù)研究所）；ROS、5-HT、多巴胺（dopa?mine，DA）、白細(xì)胞介素 1β（interleukin 1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；小鼠抗小鼠MAO-A單克隆抗體（美國Santa Cruz Biotechnology）；兔抗小鼠Bcl-2、Bax、活化胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9多克隆抗體（沈陽萬類生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG抗體（Biosharp生物科技有限公司）。TGL-16gR高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Bio-Rad Mini-Protean?Tetra System蛋白電泳設(shè)備和Bio-Rad Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽（新加坡Bio-Rad公司）；Infinite M200 Pro全波長酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；IX51型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Tanon 5200 Multi全自動化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（上海天能有限公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司）。

1.2 AKI模型制備和分組

72只雄性6～8周齡清潔級ICR小鼠（揚州大學(xué)動物醫(yī)學(xué)比較中心），體重22～25 g，許可證號：SCXK（蘇）2017-0007。動物實驗遵守國際實驗動物倫理學(xué)要求。小鼠正常飼養(yǎng)管理，環(huán)境溫度24～26℃，濕度50%～55%，光照12 h，黑暗12 h。

依據(jù)本實驗室前期研究，聯(lián)合給藥時SH∶CDP=2∶1療效最佳；該SH和CDP比例接近等摩爾劑量（SH和CDP相對分子質(zhì)量分別為465和226）、療效有協(xié)同效應(yīng)［16，18］。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，按體重均衡的原則隨機(jī)分為6組，每組12只：正常對照組、模型組、模型+SH 50 mg·kg-1組、模型+CDP 25 mg·kg-1組、模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1組、模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組。各給藥組首先預(yù)防性ig給藥7 d，每天2次（間隔12 h給藥1次），正常對照組和模型組給予等體積溶劑（0.5%CMC-Na溶液），7 d后除正常對照組外，其余小鼠ip給予順鉑25 mg·kg-1誘導(dǎo)AKI，繼續(xù)給藥3 d，于造模后72 h將小鼠用戊巴比妥鈉麻醉后處死，收集血液和腎組織。1800×g離心10 min收集血清，腎組織用4%甲醛固定或-80℃保存待測。實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，剔除死亡小鼠（模型組2只，CDP 25 mg·kg-1組1只）和未表現(xiàn)AKI的小鼠（特征是腎外觀顏色與模型組相比無改變，且血清CRE和BUN升高不明顯；除模型組外每組出現(xiàn)1～2只）。

1.3 酶標(biāo)法檢測小鼠血清BUN、CRE和Alb含量及腎組織MDA含量和SOD活性

取1.2分組制備的血清和腎組織，肌氨酸氧化酶法測定血清CRE含量，脲酶法測定血清BUN含量，溴甲酚綠法測定血清Alb含量，硫代巴比妥酸法測定腎組織MDA含量和羥胺法測腎組織SOD活性。

1.4 ELISA檢測腎組織中ROS，5-HT，DA，TNF- α和IL-1 β水平

從-80℃冰箱內(nèi)取出1.2制備的腎組織標(biāo)本，在冰上用小剪刀剪取腎組織，按腎組織：生理鹽水=1∶9（V/V）的比例制備10%腎組織勻漿。按試劑盒說明書，ELISA測定小鼠腎組織勻漿中ROS，5-HT，DA，TNF-α和IL-1β水平。

1.5 HE染色觀察腎組織病理損傷

取1.2分組制備的腎組織，按常規(guī)方法進(jìn)行組織脫水、透明、浸蠟和包埋。切成3 μm厚切片，經(jīng)脫蠟、梯度乙醇和HE染色，中性樹膠封片。通過IX51型熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。

1.6 Hoechest33342熒光染色檢測小鼠腎組織細(xì)胞凋亡

取1.2分組制備的腎組織，固定后石蠟包埋，以3 μm切片。激光共聚焦顯微鏡（激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm）DAPI通道（藍(lán)色熒光）觀察并拍照。

1.7 Western印跡法檢測小鼠腎組織中MAO-A、Bax、Bcl-2、活化胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9蛋白表達(dá)水平

取1.2分組制備的腎組織，腎組織RIPA裂解后離心，取上清液；BCA法測蛋白濃度，上樣緩沖液后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；BSA封閉后加入對應(yīng)的一抗（Tph1，1∶1000；AADC，1∶700；5-HT2AR，1∶500；MAO-A，1∶500；活化胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶 9、Bcl-2和Bax，1∶500），于4℃孵育過夜，TBST清洗；加入山羊抗兔IgG抗體（1∶40 000）和山羊抗小鼠IgG抗體（1∶100 000），室溫孵育后，采用Tanon 5200 Multi全自動化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)觀察并拍照。Image J軟件分析條帶積分吸光度值，目的蛋白積分吸光度值與內(nèi)參GAPDH積分吸光度值比表示待測蛋白的相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SH和CDP聯(lián)用對順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷血清CRE、BUN和Alb含量及腎組織MDA含量和SOD活性的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清CRE和BUN及腎組織MDA含量顯著升高（P＜0.01），血清Alb含量和腎組織SOD活性則明顯下降（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組血清CRE、BUN及腎組織MDA 含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），腎組織SOD活性顯著升高（P＜0.01）；血清Alb除模型+CDP 25 mg·kg-1組無顯著升高外，其余各組均顯著升高（P＜0.01）。與模型+SH 50 mg·kg-1相比，模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1聯(lián)合用藥組血清CRE和BUN濃度及腎組織MDA含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），血清 Alb濃度和腎組織SOD活性均顯著升高（P＜0.01）。與模型+CDP 25 mg·kg-1組相比，2個聯(lián)合用藥組血清CRE和BUN濃度均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），血清Alb濃度和腎組織SOD活力均顯著升高（P＜0.01），模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組腎組織MDA含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1組相比，模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1聯(lián)合用藥組血清CRE和BUN濃度及腎組織MDA含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），腎組織SOD活力均顯著升高（P＜0.05）（表1）。

Tab.1 Effect of preventive treatment with sargrelate hydrochloride（SH）and cabidopa（CDP）（alone or in combina?tion）on levels of serum creatinine（CRE），blood urea nitrogen（BUN），albumin（Alb）in serum，and malondialde?hyde(MDA)content and superoxide dismutase(SOD)activity in renal tissues in cisplatin（CDDP）-induced acute kidney injury(AKI)mice

2.2 SH和CDP聯(lián)用對順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷小鼠腎組織5-HT，DA，ROS，TNF- α和IL-1 β的影響

ELISA檢測結(jié)果（表2）顯示，與正常對照組相比，模型組腎組織5-HT，ROS，TNF-α和IL-1β含量顯著升高（P＜0.01），而DA無明顯變化。與模型組比較，各給藥組DA含量無明顯變化，且除模型+CDP 25 mg·kg-1組TNF-α和IL-1β含量無明顯降低外，其余給藥組TNF-α、IL-1β及各給藥組5-HT和ROS含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型+SH 50 mg·kg-1組相比，2個聯(lián)合用藥組腎組織5-HT和TNF-α含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組腎組織ROS和IL-1β含量顯著降低（P＜0.01）。與模型+CDP 25 mg·kg-1組相比，2個聯(lián)合用藥組腎組織5-HT，ROS，TNF-α和IL-1β含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。且與模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1組相比，模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組腎組織5-HT（P＜0.05）、ROS、TNF-α和IL-1β均顯著降低（P＜0.01）。

Tab.2 Effect of preventive treatment with SH and CDP（alone or in combination）on levels of renal 5-hydroxy?tryptamine(5-HT)，dopamine(DA),reactive oxygen speies(ROS)，tumor necrosis factor- α (TNF- α)and interleu?kin-1 β (IL-1 β)in CDDP-induced AKI mice

2.3 SH和CDP聯(lián)用對順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷小鼠腎組織病理改變的影響

如圖1所示，模型組小鼠腎外觀顏色由正常的紫紅色變?yōu)榛野咨?個聯(lián)合用藥組腎顏色為粉紅色，尤以模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組最明顯（圖1B）。HE染色可見，模型組腎組織病變主要出現(xiàn)在腎小球周圍腎小管，而腎小球病變不明顯；腎小球周圍腎小管大片損傷，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞大量脫落、壞死、空泡化和管形破壞。各給藥組可見腎小管病變減輕，以SH和CDP聯(lián)合用藥組療效最佳。

Fig.1 Effect of preventive treatment with SH and CDP（alone or in combination）on kidney appearance and renal pathological injury induced by CDDP in AKI mice.See Tab.1 for the mouse treatment.A：representative pictures of kidneys in each group；B：representative pictures of renal tissue sections by hematoxylin and eosin（HE）staining.Typically，the arrows show renal tubules epithelial cells shedding，necrosis or vacuolization in the model.

2.4 SH和CDP聯(lián)用對順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷小鼠腎組織細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，Hoechst33342熒光染色細(xì)胞凋亡檢測表明，與正常對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡主要出現(xiàn)在腎小管上皮細(xì)胞，且以腎小球周圍腎小管最明顯，可見細(xì)胞核的熒光藍(lán)染加深、腎小管上皮細(xì)胞脫落和管形破壞、幾乎不見完整管形。各給藥組均顯示細(xì)胞凋亡程度減輕，細(xì)胞核Hoechst33342熒光亮度減弱，腎小管上皮細(xì)胞的破壞減輕，其中模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組腎小管管形完整，上皮細(xì)胞未被破壞。

Fig.2 Effect of preventive treatment with SH and CDP（alone or in combination）on apoptosis induced by CDDP in renal tissue detected by Hoechst33342 fluorescent staining.See Tab.1 for the mouse treatment.

2.5 SH和CDP聯(lián)用對順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷小鼠腎組織MAO-A、Bax、Bcl-2、活化胱天蛋白酶 3和胱天蛋白酶9蛋白表達(dá)水平的影響

Western印跡結(jié)果（圖3）所示，與正常對照組比較，模型組MAO-A、Bax、胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶 3表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），而Bcl-2表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，各給藥組MAO-A表達(dá)明顯降低（P＜0.01），且與各組對腎組織ROS含量升高的抑制程度一致（表2）；除模型+CDP 25 mg·kg-1組外，其余各給藥組Bax、胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3表達(dá)明顯降低而Bcl-2表達(dá)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。與模型+SH 50 mg·kg-1組和模型+CDP 25 mg·kg-1組相比，2個聯(lián)合用藥組MAO-A、Bax、活化胱天蛋白酶3表達(dá)顯著降低，Bcl-2表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），且模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組胱天蛋白酶 9表達(dá)顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1組相比，模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組MAO-A的顯著降低（P＜0.05）。

Fig.3 Effect of preventive treatment with SH and CDP（alone or in combination）on expression of renal MAO-A，Bax，Bcl-2，cleaved-caspase 3 and caspase 9 in CDDP-induced AKI mice detected by Western blotting.See Tab.1 for the mouse treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group；△P＜0.05，△△P＜0.01，compared with model+SH 26.7+CDP 13.3 group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，compared with model+CDP 25 group；◇P＜0.05，◇◇P＜0.01，compared with model+SH 26.7+CDP 13.3 group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，SH和CDP均可有效改善順鉑導(dǎo)致的AKI，并且，SH和CDP聯(lián)用療效更為明顯。聯(lián)合給藥組的劑量只有SH或CDP單獨給藥組劑量約1/2，療效較SH組好或相當(dāng)，且明顯好于CDP組。表明聯(lián)合給藥具有協(xié)同效應(yīng)，且模型+SH 50 mg·kg-1+CDP 25 mg·kg-1組效果好于模型+SH 26.7 mg·kg-1+CDP 13.3 mg·kg-1組。

順鉑致AKI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有研究認(rèn)為順鉑引起ROS生成增加，進(jìn)一步引起細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡等［5，19-20］。一方面，ROS大量堆積引起體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激，氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制5-HT2AR或5-HT合成后均可顯著降低腎組織ROS產(chǎn)生，改善順鉑引起的氧化應(yīng)激，同時抑制5-HT2AR和5-HT合成（SH聯(lián)合CDP）療效最佳。同時發(fā)現(xiàn)，抑制5-HT2AR或（和）5-HT合成對順鉑引起MAO-A表達(dá)的改變同腎氧化應(yīng)激水平的改變一致，表明腎氧化應(yīng)激水平與5-HT在MAO-A作用下的降解過程存在內(nèi)在聯(lián)系。另一方面，ROS作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，能夠激活其下游的炎癥及凋亡信號通路［21-22］，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1β產(chǎn)生，同時凋亡信號通路激活后導(dǎo)致胱天蛋白酶9和活化胱天蛋白酶3等為終末因子的細(xì)胞凋亡應(yīng)答反應(yīng)［23］，導(dǎo)致 AKI［24］。本研究發(fā)現(xiàn)，SH 及 CDP（單獨或聯(lián)合）預(yù)防性治療可有效抑制順鉑引起的AKI小鼠體內(nèi)炎癥和凋亡。

前期研究表明，2型糖尿病進(jìn)展過程中，高血糖及高濃度飽和脂肪酸誘導(dǎo)的骨骼肌疲勞、腎損傷，其關(guān)鍵原因是骨骼肌細(xì)胞及腎小球系膜細(xì)胞的MAO-A表達(dá)上調(diào)、5-HT降解增多，導(dǎo)致線粒體ROS產(chǎn)生增多［18-19］，其過程還牽涉到5-HT合成及5-HT2AR。其中，5-HT2AR可通過介導(dǎo)MAO-A及5-HT合成酶Tph1、AADC的表達(dá)來調(diào)控線粒體5-HT降解和ROS產(chǎn)生［16，18］。結(jié)合本研究結(jié)果推測，順鉑引起腎組織ROS產(chǎn)生增多、導(dǎo)致AKI的原因可能也是如此。具體可能由于AKI引起腎組織5-HT2AR激活和5-HT合成增加，進(jìn)而引起5-HT降解增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加。因此，用SH拮抗5-HT2AR和用CDP抑制5-HT合成時，可有效預(yù)防順鉑致AKI的發(fā)生?？傊?，通過同時抑制外周5-HT2AR及5-HT合成可有效預(yù)防AKI的發(fā)生，可為臨床治療AKI提供理論依據(jù)和新靶點。