分化抑制因子1和3通過(guò)Wnt/ β聯(lián)蛋白和Shh通路共同調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的干性

黃傳鐘＊，孫艷霞＊，于 悅，陳 韡，陳淑萍，林萬(wàn)松，葉韻斌1，，3

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，福建省腫瘤醫(yī)院，腫瘤免疫學(xué)研究室，福建 福州 350014；2.福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350100；3.福建省腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350014）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范 圍內(nèi)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)［1］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，CRC干細(xì)胞可能在CRC的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。高度的自我更新能力和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的腫瘤干細(xì)胞可產(chǎn)生化療抵抗和癌癥轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致預(yù)后不良［2］。從臨床角度講，確定維持細(xì)胞干性的分子調(diào)控機(jī)制從而建立有效的CRC靶向治療策略是非常必要的。分化抑制因子（inhibitors of differ?entiation，Id）屬于螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子（helixloop-helix，HLH）家族中的一員，其中 Id1（又名DNA結(jié)合抑制因子1）在多種腫瘤組織呈高表達(dá)，如前列腺癌［3］、乳腺癌［4］、卵巢癌［5］、胃癌［6］、食管癌［7］和結(jié)直腸癌［8］等，并與癌癥的侵襲轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后具有相關(guān)性［9-13］。而Id1已被證實(shí)在胚胎干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞中具有維持其自我更新的功能［14-15］，同時(shí)Id3和Id1具有高度的序列相似性，故在許多組織中具有廣泛重疊的生物學(xué)功能，它們的功能常被認(rèn)為是相互促進(jìn)的［16］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Id3在CRC干細(xì)胞特性的維持過(guò)程中也同樣具有重要作用［17］。最近，O′Brien 等［18］發(fā)現(xiàn)，Id1和Id3可通過(guò)限制P21驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞周期來(lái)共同調(diào)節(jié)CRC干細(xì)胞的自我更新，但相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過(guò)單敲減和雙敲減HCT116的Id1和Id3基因的表達(dá)，探索Id3是否協(xié)同Id1調(diào)控CRC干性及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

CRC細(xì)胞HCT116（上海細(xì)胞庫(kù)）。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶（Gibco公司，美國(guó)）；d1短發(fā)夾RNA質(zhì)粒（short hairpin RNAId1，shRNA-Id1）、shRNA-Id3和陰性對(duì)照質(zhì)粒慢病毒（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）；嘌呤霉素（Merck公司，美國(guó)）；Trizol裂解液（Invitrogen公司，美國(guó)）；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司，美國(guó)）；Id1、Id3和β肌動(dòng)蛋白引物（北京梓熙生物科技有限公司）；熒光定量檢測(cè)試劑盒和化學(xué)發(fā)光試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)）；AnnexinⅤ/PI檢測(cè)試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和基質(zhì)膠（Bio-Rad公司，美國(guó)）；NC膜（Amersham公司，美國(guó)）；Wnt通路抑制劑FH535、Sonic Hedgehog（Shh）通路抑制劑HPI-1（Abcam公司，美國(guó)）；兔抗人β聯(lián)蛋白單抗、兔抗人八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding transcrip?tion factor 4，Oct4）單抗、兔抗人zeste同源物增強(qiáng)子2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）多抗、兔抗人鈣黏蛋白轉(zhuǎn)錄抑制因子（snail）多抗、兔抗人Shh單抗、兔抗人融合抑制劑（suppressor of fused，SUFU）多抗、兔抗人周期蛋白D1單抗、兔抗人凋亡抑制因子單抗、兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphatedehydrogenase，GAPDH）單抗、兔抗人CD24單抗、兔抗人CD133單抗和兔抗人CD44單抗（均Cell Signaling Technology公司，美國(guó)）；小鼠抗人Id1多抗和小鼠抗人Id3多抗（Santa Cruz公司，美國(guó)）；小鼠抗人富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5（leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，Lgr5）多抗、兔抗人CD166、兔抗人細(xì)胞性骨髓細(xì)胞瘤病癌基因（cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-myc）多抗、兔抗人膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白2（glioma-associated oncogene homologue 2，GLI2）多抗和兔抗人Hedgehog受體（PTCH2）單抗（Abcam公司，美國(guó)）；兔抗人CD133單克隆熒光抗體、兔抗人CD24單克隆流式抗體及其同型抗體對(duì)照（Miltenyi公司，德國(guó)）。生物安全柜（哈爾濱市東聯(lián)電子有限公司），純水系統(tǒng)（Millipore公司，美國(guó)），二氧化碳培養(yǎng)箱（Heraeus公司，德國(guó)），熒光定量PCR儀（Roche公司，美國(guó)），活細(xì)胞工作站（Leica公司，美國(guó)），垂直電泳槽、CLD-RAD550型酶標(biāo)儀（Bio-RAD公司，美國(guó)），普通離心機(jī)（白洋離心機(jī)廠），流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)），凝膠成像分析儀（Panasonic公司，日本），實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀RTCA（ACEA Biosciences公司，美國(guó)）。RTCA是基于電阻抗傳感器原理的細(xì)胞檢測(cè)，能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、毒性、粘附及形態(tài)變化等動(dòng)態(tài)生物學(xué)反應(yīng)過(guò)程；儀器底部整合有微金電子傳感器芯片，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)，可引起電極界面阻抗的改變，該阻抗值的變化直接反映細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)，因此RTCA可在細(xì)胞生理狀態(tài)下，實(shí)時(shí)、連續(xù)、定量跟蹤細(xì)胞形態(tài)和增殖分化的改變。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和敲減細(xì)胞株構(gòu)建

HCT116細(xì)胞采用含10% FBS的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，傳代后分別加陰性對(duì)照質(zhì)粒（質(zhì)粒對(duì)照組，簡(jiǎn)稱對(duì)照組）、Id1敲減質(zhì)粒（sh-Id1組）、Id3敲減質(zhì)粒（sh-Id3組）及Id1和Id3雙敲減質(zhì)粒（sh-Id1Id3組），作用12 h后，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后更換為含嘌呤霉素1.5 mg·L-1培養(yǎng)液篩選細(xì)胞，每3 d更換1次新鮮的嘌呤霉素抗性培養(yǎng)基。篩選3周后，通過(guò)熒光顯微鏡下觀察綠熒光強(qiáng)度確定感染效率。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)腸癌細(xì)胞中Id1和Id3 mRNA表達(dá)

取1.2構(gòu)建和分組處理的細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，長(zhǎng)至融合度約80%時(shí)用Trizol液裂解細(xì)胞，提取總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Q-RT Super?Mix，以1 μg RNA為模板合成cDNA。Id1引物：上游為5′-CGTGCTGCTCTACGACATGA-3′，下游為 5′-GCTCCAACTGAAGGTCCCTG-3′；Id3 引物：上游為5′-AGCCAGGTGGAAATCCTAC-3′，下游為5′-AAGCTCCTTTTGTCGTTGG-3′；內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白引物：上游為5′-TGGCACCA?CACCTTCTACA-3′，下游為5′-AGCACAGCCT?GGATAGCA-3′。設(shè)定反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，按儀器的實(shí)驗(yàn)操作要求設(shè)置40個(gè)循環(huán)，用2-△Ct法計(jì)算目標(biāo)mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 Western印跡法檢測(cè)基因敲減的HCT116細(xì)胞中Id1和Id3蛋白表達(dá)水平

收集1.2構(gòu)建和分組處理的細(xì)胞，用裂解液裂解，冰上孵育15 min，提取細(xì)胞總蛋白。用BCA法進(jìn)行蛋白定量，每組取25 μg裂解蛋白進(jìn)行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至NC膜。用5% FBS封閉液室溫封閉1 h，加Id1和Id3抗體（1∶500），4℃過(guò)夜，以GPADH作為內(nèi)參（1∶2000），用TBST洗3次后加二抗（1∶1000），室溫孵育二抗2 h后加TBST洗3次，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值比值表示目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.5 實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖

取1.2構(gòu)建和分組的細(xì)胞，密度為2×108L-1，加到已檢測(cè)過(guò)基線的E-Plate 16檢測(cè)板中，每孔加100 μL培養(yǎng)液，室溫靜置30 min后將檢測(cè)板置培養(yǎng)箱中的RTCA S16儀器上，取0，24，48和72 h共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行監(jiān)測(cè)并繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因敲減的HCT116細(xì)胞克隆數(shù)

將1.2構(gòu)建和分組處理的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，各取800個(gè)接種到6孔板中，12～14 d后，吸棄培養(yǎng)液，PBS輕輕洗3次，甲醇固定30 min，每孔加0.1%結(jié)晶紫染液600 μL，染色10 min，PBS輕洗3次，計(jì)算克隆數(shù)和克隆直徑。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)基因敲減的HCT116細(xì)胞凋亡

收集1.2構(gòu)建和分組處理的細(xì)胞，按AnnexinⅤ/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，用100 μL結(jié)合液重懸，后加入5 μL FITC Annexin Ⅴ和5 μL PI，輕輕混勻，避光室溫孵育15 min后上流式細(xì)胞儀采集細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)。

1.8 無(wú)血清懸浮細(xì)胞球培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察基因敲減的HCT116細(xì)胞懸浮球的大小和數(shù)量

采用極限稀釋法，將1.2構(gòu)建和分組處理的細(xì)胞接種于96孔板中，每組5復(fù)孔，每孔加200 μL無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d后，顯微鏡下觀察懸浮球的直徑和數(shù)量。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)基因敲減的HCT116細(xì)胞CD24和CD133表達(dá)

采用直接免疫熒光標(biāo)記法分析1.2構(gòu)建和分組處理的細(xì)胞中CD24和CD133（CD133/2亞型）的表達(dá)，取1×l06對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，加抗CD24和CD133熒光抗體以及相應(yīng)同型抗體；室溫避光反應(yīng)30 min，每管加1 mL洗液，800×g離心5 min，去上清，沉淀加200 μL洗液混勻后上流式細(xì)胞儀采集細(xì)胞CD24和CD133表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.10 Western印跡法檢測(cè)基因敲減的HCT116細(xì)胞中CD24，CD133，EpCAM，Oct4，EZH2，Lgr5和 β聯(lián)蛋白表達(dá)水平

參照1.4方法，收集1.2構(gòu)建和分組處理的細(xì)胞，進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)，CD24，CD133，EpCAM，Oct4，EZH2，Lgr5和β聯(lián)蛋白抗體稀釋倍數(shù)為1∶500，二抗稀釋倍數(shù)為1∶1 000，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值比值表示目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.11 Western印跡法檢測(cè)基因敲減的HCT116細(xì)胞中c-myc， β聯(lián)蛋白，SuFu，PTCH2，Shh和GLI2蛋白表達(dá)水平

收集1.2構(gòu)建和分組處理的細(xì)胞，用裂解液裂解，冰上孵育15 min，提取細(xì)胞總蛋白。加入500 μL細(xì)胞裂解液，用吸頭上下抽吸數(shù)次，冰上孵育15 min，振蕩10 s，10 000×g離心5 min，收集上清，此為漿蛋白；再加入500 μL細(xì)胞裂解液振蕩5 s，離心5 min，棄除上清，加入50 μL萃取緩沖液抽吸數(shù)次；4℃孵育30 min，12 000×g離心10 min，收集上清，此為核蛋白。用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，每組取25 μg裂解蛋白進(jìn)行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至NC膜。用5%FBS封閉液室溫封閉1 h，加一抗（1∶500）4℃過(guò)夜，用TBST洗3次后加二抗（1∶1000），室溫孵育二抗2 h后加入TBST洗3次，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值比值表示目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.12 Western印跡法檢測(cè)基因敲減HCT116細(xì)胞過(guò)表達(dá)c-myc后CD133，Oct4，EZH2，EpCAM和Lgr5蛋白的表達(dá)

參照1.2在Id1和Id3敲減的HCT116細(xì)胞中構(gòu)建c-myc過(guò)表達(dá)細(xì)胞株，參照1.4進(jìn)行Western印跡實(shí)驗(yàn)，抗CD133，Oct4，EZH2，EpCAM和Lgr5抗體稀釋比1∶500，二抗稀釋比1∶1000，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值比值表示目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Id1和Id3基因敲減HCT116細(xì)胞的構(gòu)建

通過(guò)構(gòu)建慢病毒載體系統(tǒng)，獲得敲減Id1/Id3的HCT116細(xì)胞株，經(jīng)嘌呤霉素篩選3周后，熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度。如圖1顯示，HCT116對(duì)照組、sh-Id1組、sh-Id3組和sh-Id1Id3組細(xì)胞綠熒光率均達(dá)＞90%，提示慢病毒成功感染細(xì)胞。

Fig.1 Construction of HCT116 cells with inhibitor of differentiation 1（Id1）and Id3 gene double-knockdown（×100）.Short hairpin RNA plasmid was used to construct Id1 sin?gle gene knockout（sh-Id1），sh-Id3 and double gene knockout（sh-Id1Id3）HCT116 cells by lentiviral transfection system.

2.2 Id1和Id3基因敲減HCT116細(xì)胞中Id1和Id3 mRNA水平

如圖2所示，與對(duì)照組相比，sh-Id1組Id1mRNA水平顯著降低（P＜0.01），sh-Id3組Id3mRNA水平顯著降低（P＜0.01），sh-Id1Id3組Id1和Id3mRNA水平均顯著降低（P＜0.01）。

Fig.2 Id1（A）and Id3（B）mRNA expressions in HCT116 cells with Id1 and Id3 gene knockdown by qRT-PCR.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.3 Id1和Id3基因敲減HCT116細(xì)胞中Id1和Id3蛋白的表達(dá)

如圖3所示，與對(duì)照組相比，sh-Id1組Id1蛋白表達(dá)降低，sh-Id3組Id3蛋白表達(dá)降低，sh-Id1Id3組Id1和Id3蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）。

Fig.3 Protein expressions of Id1（A1，A2） and Id3（B1，B2）in HCT116 cells with Id1 and Id3 gene knock?down by Western blotting.IA：intensity analysis.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1 and B1，respectively.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.4 Id1/Id3敲減對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響

實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果（圖4）顯示，48 h后，與對(duì)照組相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組細(xì)胞的增殖信號(hào)顯著減弱（P＜0.05）；與sh-Id1和sh-Id3相比，sh-Id1Id3組的增殖信號(hào)亦顯著減弱（P＜0.05）。

Fig.4 Effect of Id1/Id3 knockdown on proliferation of HCT116 cells by real-time cells analysis.See Fig.1 for the cell treatment.Cell proliferation was detected 48 h post-transfection.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with control group；#P＜0.05，com?pared with sh-Id1group；△P＜0.05，compared with sh-Id3 group.

2.5 Id1/Id3敲減對(duì)HCT116細(xì)胞克隆數(shù)量和大小的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，與對(duì)照組細(xì)胞克隆數(shù)（411±18）（n=3）相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組細(xì)胞克隆數(shù)分別下降到185±24，201±20和112±21（n=3）；細(xì)胞克隆的平均直徑分別由對(duì)照組（321±48）μm（n=3）下降到144±14，163±13和（87±9）μm（n=3）。sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組與對(duì)照組相比顯著降低（P＜0.05），且sh-Id1Id3組與sh-Id1、sh-Id3組相比顯著降低（P＜0.05）。

Fig.5 Effect of Id1/Id3 knockdown on colony-formation of HCT116 cells.See Fig.1 for the cell treatment.

2.6 Id1/Id3敲減對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響

圖6結(jié)果顯示，與對(duì)照組凋亡率為（42±4）%相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），分別為（69±6）%，（59±5）%和（80±7）%（n=3）；sh-Id1Id3組細(xì)胞凋亡率顯著高于sh-Id1和sh-Id3組（P＜0.05）。

Fig.6 Effect of Id1/Id3 knockdown on apoptosis of HCT116 cells.See Fig.1 for the cell treatment.

2.7 敲減Id1/Id3對(duì)HCT116細(xì)胞成球能力的影響

無(wú)血清懸浮細(xì)胞球培養(yǎng)結(jié)果（圖7）顯示，與對(duì)照組細(xì)胞球性形成率（37±2）%相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組細(xì)胞球性形成率分別下降到（15±2）%，（18±3）%和（9±2）%（n=3）；干細(xì)胞球的平均直徑分別由對(duì)照組（103±6）μm下降到49±2，55±3和（43±1）μm（n=3）。sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組與對(duì)照組相比均顯著降低（P＜0.05），且sh-Id1Id3組與sh-Id1和sh-Id3組相比顯著降低（P＜0.05）。

Fig.7 Effect of Id1/Id3 knockdown on sphere-formation of HCT116 cells.See Fig.1 for the cell treatment.

2.8 Id1/Id3敲減對(duì)HCT116細(xì)胞CD133和CD24表達(dá)的影響

如圖8所示，CD133+細(xì)胞比例在對(duì)照組、sh-Id1、sh-Id3和sh-Id1Id3組分別為（2.80±0.17）%，（0.50±0.12）%，（0.70±0.12）%和（0.27±0.09）%（n=3）；CD24+細(xì)胞比例在對(duì)照組、sh-Id1、sh-Id3和sh-Id1Id3組分別為（24.60±2.25）%，（10.90±3.60）%，（12.70±1.13）%和（0.36±0.06）%（n=3）。sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組中CD133+和CD24+細(xì)胞比例與對(duì)照組相比均顯著降低（P＜0.05），且sh-Id1Id3組與sh-Id1和sh-Id3組相比顯著降低（均P＜0.05）。

Fig.8 Effect of Id1/Id3 knockdown on stemness of HCT116 cells.See Fig.1 for the cell treatment.

2.9 Id1/Id3敲減對(duì)HCT116細(xì)胞干性相關(guān)蛋白CD24、CD133、EPCAM、Oct4、EZH2、 β 聯(lián)蛋白、Lgr5表達(dá)的影響

Western 印跡結(jié)果顯示（圖9），sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組與對(duì)照組相比，CD24、CD133、EPCAM、Oct4、EZH2、β聯(lián)蛋白和Lgr5蛋白表達(dá)均顯著性下調(diào)（P＜0.05），但 CD166和 CD44未見(jiàn)明顯變化。

Fig.9 Protein expressions of CD24，CD133，EPCAM，Oct4，EZH2， β-catinin，CD166，CD44 and Lgr5 in HCT116 cells with Id1/Id3 gene knockdown by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with control group.

2.10 Id1/Id3敲減對(duì)HCT116細(xì)胞Wnt/ β聯(lián)蛋白和shh通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組中Wnt/β聯(lián)蛋白通路關(guān)鍵分子c-myc、細(xì)胞質(zhì)β聯(lián)蛋白、細(xì)胞核內(nèi)β聯(lián)蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05）（圖10A）；sh-Id1，sh-Id3和sh-Id1Id3組與對(duì)照組相比，Shh通路的關(guān)鍵分子SuFu和PTCH2顯著上升，Shh和GLI2顯著下降（均P＜0.05）（圖10B）。

Fig.10 Id3 and Id1 co-regulate stemness characteristics of colon cancer cells through Wnt/ β-catenin and Shh signaling pathways by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1 and B1，respectively.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with control group.

2.11 Id1/Id3基因敲減HCT116細(xì)胞過(guò)表達(dá)c-myc對(duì)CD133，Oct4，EZH2，EpCAM和Lgr5蛋白表達(dá)的影響

Western印跡結(jié)果顯示（圖11），過(guò)表達(dá)c-myc后，Id1和Id3被敲減后降低的干性標(biāo)志物CD133，Oct4，EZH2，EpCAM和Lgr5的表達(dá)重新上調(diào)（均P＜0.05），CRC細(xì)胞的干性重新增強(qiáng)，進(jìn)一步明確了Id3和Id1通過(guò)Wnt/β聯(lián)蛋白、Shh通路共同調(diào)控CRC的干性相關(guān)蛋白的表達(dá)。

Fig.11 Expressions of CD133，Oct4，EZH2，EpCAM and Lgr5 after c-myc overexpression in HCT116 cells with Id1/Id3 gene knockdown by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with control group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在腸癌細(xì)胞中敲減Id1和Id3均可通過(guò)增加凋亡，從而抑制腸癌細(xì)胞的增殖以及克隆形成，且同時(shí)敲減Id1與Id3后，腸癌細(xì)胞的增殖抑制不僅與對(duì)照組相比顯著降低，而且與單獨(dú)敲減組比較顯著降低，說(shuō)明Id1與Id3對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響具有疊加作用。

高增殖能力是許多癌癥細(xì)胞的重要特征之一，與癌癥的進(jìn)展密切相關(guān)［19-20］，同時(shí)也是腫瘤干細(xì)胞的特征之一。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新能力及增強(qiáng)侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤形成和增殖的能力等特點(diǎn)，同時(shí)具有抗常規(guī)放療和化療的能力，這些干細(xì)胞特性是腫瘤治療失敗的主要原因。本研究采用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)細(xì)胞球的方法，發(fā)現(xiàn)HCT116細(xì)胞敲減Id1/Id3后細(xì)胞成球能力下降，流式細(xì)胞術(shù)和Western印跡檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)CD133和CD24等干性標(biāo)志物表達(dá)更低，并且同時(shí)敲減Id1和Id3能顯著抑制HCT116細(xì)胞的干性特征，表明Id3能協(xié)同Id1更好地抑制腸癌進(jìn)展。

此外，干細(xì)胞的調(diào)控涉及多種信號(hào)通路，如Wnt，Sonic，Hedgehog（Shh）和 Notch 等，它們?cè)诙喾N人類惡性腫瘤中失控，直接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究表明，Wnt/β聯(lián)蛋白信號(hào)通路在保持上皮干細(xì)胞及CRC干細(xì)胞生長(zhǎng)和自我更新功能上起至關(guān)重要的作用，且Wnt/β聯(lián)蛋白信號(hào)通路的活化可導(dǎo)致EMT和腫瘤轉(zhuǎn)移［21］。同樣，Shh在調(diào)控胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞中有重要作用［22］。在本研究中敲減Id1/Id3后Wnt/β聯(lián)蛋白通路和Shh通路上的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平明顯下降，這說(shuō)明Id1/Id3通過(guò)Wnt/β聯(lián)蛋白、Shh通路調(diào)控CRC細(xì)胞干性相關(guān)蛋白的表達(dá)。c-myc作為Wnt通路和SHH通路共同的靶基因，參與維持胚胎干細(xì)胞的自我更新功能，可誘導(dǎo)Bmi1和EZH2的表達(dá)。本研究通過(guò)在敲減Id1/Id3的HCT116細(xì)胞上過(guò)表達(dá)c-myc增強(qiáng)了CRC細(xì)胞的干性，從而進(jìn)一步明確了Id3和Id1通過(guò)Wnt/β聯(lián)蛋白、Shh通路共同調(diào)控CRC的干性相關(guān)蛋白的表達(dá)。

腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生是腫瘤治療的主要障礙之一，而腫瘤干細(xì)胞是其耐藥的主要機(jī)制?？鼓[瘤藥物一般作用于增殖的腫瘤細(xì)胞，而腫瘤干細(xì)胞多處于靜止期而耐受化療藥物，常常是CRC等惡性腫瘤復(fù)發(fā)的原因之一。從腫瘤干細(xì)胞的角度尋找治療藥物，或降低腫瘤的干性，將腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物作為治療靶點(diǎn)是解決腫瘤細(xì)胞耐藥的策略之一［23］。Id1和Id3可以共同調(diào)控CRC的干性相關(guān)蛋白的表達(dá)，可能是CRC耐藥的原因之一，將Id1和Id3作為治療靶點(diǎn)可能是將來(lái)腫瘤治療的有效手段之一。